荧光差异显示PCR克隆大鼠脑缺血相关基因KIAA0280

【目的】研究大鼠急性局灶性脑缺血时缺血组织与非缺血组织中基因表达的差异,克隆出与脑缺血相关的基因。【方法】应用荧光差异显示PCR(FDDPCR)从同一例大鼠大脑皮层缺血组织和非缺血组织中筛选出有表达差异的基因片段,经反向Northernblot杂交,将杂交阳性的片段且经RT-PCR反复验证,选取差异明显的片段进行克隆测序;经生物信息学分析处理,选取同源性低的EST片段R6,利用cDNA5'端快速扩增PCR(5'RACE法)进行基因全长的克隆。【结果】利用5'RACE法成功地克隆EST片段R6至编码区,扩增并获取全长4821bp及完整的可读框(ORF),RT-PCR及Northernblot印迹结果证实了克隆的结果,同源性分析发现该基因ORF与人大脑中已知的KIAA0280基因高度同源,同源性96%,编码166个氨基酸,为结构及功能未明确蛋白质,该基因定位于大鼠第11号染色体长臂(11q.13)。【结论】应用荧光差异显示PCR成功地自大鼠体内克隆到与人KIAA0280相似的基因,其在大鼠急性局灶性脑缺血中明显上调,该蛋白质结构及功能均未见报道及研究,其显著地差异表达提示其在脑缺血病理过程中具有重要作用。

荧光差异显示PCR分离果蝇七氟醚敏感性相关基因

吸入麻醉药是临床上常用的一类全身麻醉药 .为深入研究吸入麻醉药的作用机理 ,以本实验室创建的对七氟醚敏感的果蝇品系 (F PS1 )和耐药 (F PR1 )的果蝇品系为研究模型 ,以野生型黑腹果蝇 (Drosophilamelanogaster)为对照 ,应用荧光mRNA差异显示PCR (fluorescentdifferentialdisplayreversetranscriptional PCR ,fluoroDDRT PCR)方法 ,分离与吸入麻醉药七氟醚敏感性相关的候选基因(EST) .在分离到的 32个差异片段中 ,经Northern印迹杂交鉴定后 ,得到 1个阳性片段 (No .4 1 ) ,其在敏感品系果蝇中表达较高 .通过cDNA末端快速扩增技术 (rapidamplificationofcDNAends ,RACE)克隆和拼接获得了 1 75kb的全长cDNA ,该基因位于Chr2R 4 5F3区域内 ,为一已知序列的新基因 .实验结果与前期工作用遗传学定位方法所得结果一致 ,从而可推测决定七氟醚敏感性的相关基因可能位于果蝇第 2号染色体上 .

荧光差异显示PCR克隆参与胃腺癌转移的基因wcl1

使用来源于同一个胃腺癌病人的原发灶RF 1(ATCC编号CRL 186 4 )和转移灶RF 4 8(ATCC编号CRL 186 3)作为研究肿瘤转移的模型 .通过荧光差异显示PCR(FDD PCR)技术 ,克隆了 4 5个涉及胃腺癌转移相关基因 .和原发灶CRL 186 4相比 ,发现在转移灶CRL 186 3细胞中有 38个基因被显著上调 ,7个基因被显著下调 ,包括未被发现的基因 3个 .利用生物信息学技术对其中 1个在RF 4 8中高度上调的wcl1进行克隆和鉴定 ,发现wcl1的cDNA全长为 6 6 4bp ,含有 1个 2 4 0bp的完整阅读框 .用RT PCR和Northern印迹证实 ,结果与克隆拼接的大小完全一致 (NCBI数据库收录号AF36 4 86 3) .wcl1编码肽位于胞浆内含 79个氨基酸 ,理论上的pI Mr:5 2 8 896 1 72 .氨基酸序列分析发现 ,其N端 4～ 5 5氨基酸处为未知功能区UPF0 0 16蛋白 ,5 7～ 78处有一段亮氨酸拉链结构域 ,未发现与已知的蛋白质有高度的同源性 .该基因定位于 11q14.组织分布表明 ,wcl1除在分化差的胃腺癌中的表达要高于相应的正常胃组织 ,在微血管内皮中表达也明显高于乳腺管癌、脑纤维状星形细胞瘤 ,未检测到在其它组织有分布 .研究提示 ,Wcl1可能为胃腺癌转移过程中参与核内基因转录的相关蛋白质 .

荧光定量PCR法检测副溶血弧菌tdh基因的表达差异

以pvuA为内标基因,运用实时荧光定量PCR检测不同来源以及不同应激条件下副溶血弧菌热稳定直接溶血素基因tdh的表达量。pvuA和tdh基因的荧光定量PCR融解曲线分析表明,两者均为特异性扩增。尽管相同来源的不同菌株间tdh表达量存在显著差异,副溶血弧菌临床分离株的tdh mRNA平均表达量显著高于海产品分离株((57.2比13.8)。在pH4.0、0.5%和8%NaCl应激条件下,临床株ZJ2和海产品分离株FJ14A的tdh mRNA表达量显著高于对照组;另一海产品分离株KP34在8%NaCl条件下的表达量显著提高,而低pH应激时tdh mRNA的表达量显著降低。结果表明,不同副溶血弧菌分离株的tdh mRNA表达差异显著,临床分离株的tdh mRNA表达量总体上高于海产品分离株,副溶血弧菌在不同应激条件下主要表现为tdh mRNA表达上调。

不同荧光定量PCR对于HBVcccDNA水平的检测差异对比

目的研究对比不同荧光定量聚合酶链反应PCR对于乙型肝炎病毒HBVccc DNA水平的检测差异。方法选择20例从2007—2008年在广州市第八人民医院接受住院治疗的乙肝患者作为研究对象。提取其血清及肝组织进行实验分析,另取2份不含HBV感染的患者血清和肝组织作阴性对照组。将其中经或未经脱氧核糖核酸酶DNase处理的样本分别使用HBVccc DNA跨单缺口PCR和跨双缺口PCR检测。分析Taq Man探针跨单缺口PCR测定HBVccc DNA的结果,对比跨单、双缺口PCR测定结果以及不同荧光定量PCR的测定结果。分析血清和肝组织中HBVDNA与HBVccc DNA病毒载量的关系。结果血清及肝组织经过DNase消化后的有关拷贝数显著低于未消化者。血清和肝组织跨双缺口PCR测定结果较跨单缺口PCR测定结果均显著降低。血清中的HBVDNA及ccc DNA实验结果均显著低于在肝组织中的测定结果,差异均有统计学意义(均P<0.05)。阴性对照组经四种荧光定量PCR检测后均呈阴性。20例E抗原呈阳性的乙肝病人,其机体病毒载量总体趋势为血清HBVDNA的载量较肝组织更低,差异显著。结论 DNase可有效减少HBVccc DNA在检测过程中的假阳性情况,经DNase处理后的跨双缺口PCR检测特异性最高。同时,血清中基本不含ccc DNA。

通过荧光差异显示PCR法分离水稻中由ABA调节的基因

脱落酸(ABA)在植物种子发育以及植物细胞对外源环境因子(如逆境、胁迫等)反应过程中起着重要的作用,对其调节基因的分离将有助于了解其相关信号传导途径及作用机制。通过荧光差异显示PCR法我们由水稻中分离了部分ABA调节的cDNA片段,在所分离克隆的17个片段中,有14个片段被ABA诱导(2、4、8、12h),有3个片段被ABA抑制(8h)。测序及序列分析表明这些片段可能分别编码与植物光合作用(7)、信号传导(1)、转录调控(2)、代谢(6)相关的蛋白或未知蛋白(1)而且其表达可能受到ABA的调节或ABA参与了其作用,对其中可能编码α/β水解酶折叠蛋白、酪氨酸磷酸酶、液泡H^+-ATPase的mRNA进行的RT-PCR和Northern blot分析,确证了ABA对它们表达的调节作用。在此基础上对FDD-PCR技术及ABA作用的可能机制进行了讨论。

荧光定量PCR与逆转录PCR检测HCV RNA的比较分析

目的:用荧光定量PCR(FQ—PCR)和逆转录PCR(RT—PCR)法检测抗-HCV阳性血清中的HCVRNA,探讨两种方法检测结果的临床意义.方法:抗-HCV阳性血清样本1062份,其中481份用RT-PCR法检测,465份用FQ-PCR法检测,另有116份同时用两种PCR法检测.结果:RT—PCR法检测HCVRNA的阳性率为49.90%(240/481),FQ-PCR法的阳性率为62.58%(291/465),两种方法的阳性率有显著性差异(P<0.001).同时用两种方法检测116份,RT—PCR法阳性率为49.14%(57/116),FQ—PCR法阳性率为65.52%(76/116),也有显著性差异(P<0.05).FQ-PCR法检测的40份阴性中RT-PCR法检测出4例HCVRNA阳性.结论:FQ—PCR检测HCVRNA比RT-PCR特异性高,但RT—PCR的敏感性较FQ—PCR高,部分FQ—PCR检测的阴性结果不能排除HCVRNA阳性的可能性.

苏太猪肌内脂肪沉积相关基因SRC-1的差异显示反转录PCR鉴定

采取90头180日龄去势苏太猪的背最长肌组织测定肌内脂肪含量,从中选取肌内脂肪含量差异极显著(P<0.01)的最高和最低各6头组成RNA池,采用差异显示反转录PCR(DDRT-PCR)鉴定两组间差异表达的基因,结果共获得14条表达序列标签(expressed sequence tags),即EST序列,通过GenBank比对发现其中3条为已知序列。为进一步验证这3个已知基因与肌内脂肪之间的关系,从90个个体中选取肌内脂肪最高和最低各15个个体进行实时定量PCR检测。结果表明,细胞核受体共激活因子1基因(SRC-1)mRNA表达水平与肌内脂肪含量存在负相关关系(r=-0.38,P<0.05)。提示:SRC-1蛋白有可能参与了肌内脂肪沉积的调节。

定量PCR研究细粒棘球蚴抗氧化相关基因的差异表达

目的在已构建的氧化胁迫下细粒棘球蚴(Echinococcus granulosus)与正常组织差异表达的消减cDNA文库中,筛选细粒棘球蚴在抗氧化过程中差异表达的重要基因。方法将前期研究中应用抑制性消减杂交技术(suppression subtrac-tive hybridization,SSH)构建氧化胁迫下细粒棘球蚴差异表达基因的消减cDNA文库进行蓝白斑筛选和菌落PCR分析后测序分析。测序结果利用BLAST在线软件与GenBank数据库进行同源序列比对分析和BlastX分析。从文库中随机挑选4个未知新序列和抗氧化密切相关的TPx基因片段,利用定量PCR法研究氧化胁迫下,差异表达基因片段在mRNA水平上的变化情况。结果整个文库克隆测序结果获得重要基因的cDNA序列,如氧化还原酶、蛋白激酶、生长因子等。另有部分克隆在GenBank中无法查到对应的同源基因,可能代表了新基因。定量PCR结果显示:S88、H32-1两个基因在0.8mmol/LH2O2氧化胁迫的原头蚴中表达量分别上调为未经氧化胁迫原头蚴中的2.0和2.3倍,TPx基因片段当H2O2浓度大于0.8mmol/L时,其表达量增高。结论上述基因的上调表达很可能与细粒棘球蚴在抗氧化过程中的相关功能有密切的联系,可以作为研究细粒棘球蚴抗氧化的候选基因。

荧光定量PCR法与ELISA法检测乙肝病毒感染相关性的研究

目的 采用荧光定量PCR法与ELISA法检测乙肝病毒标志物 ,探讨两种检测方法的相关性。方法 对 95 2份深圳服务行业从业人员体检乙肝表面抗原阳性的血清 ,应用HBV荧光定量PCR法和ELISA法检测并对结果进行分析。结果 荧光定量PCR检测不同乙肝标志物分组阳性率存在一定的差异 ;E抗原阳性的HBVDNA阳性对数均值为 6 . 4 9± 1 .2 9,表面抗原阳性而E抗原阴性的HBVDNA阳性对数均值为 4. 4 6± 1. 2 9,两者间差异具有显著性 (P <0 . 0 1) ,而不同性别和籍贯间无明显差异。结论 两种方法检测乙肝标志物有密切的相关性 ;对从业人员用ELISA法检测乙肝表面抗原阳性者应进一步进行荧光定量PCR检测。

荧光定量PCR法检测牙釉质型颅咽管瘤组织ADAMDEC1、SCAPER、TRPM2、CGA和HBG2基因

目的建立ADAMDEC1、SCAPER、TRPM2、CGA、HBG2基因表达的实时荧光定量PCR,在基因转录水平上研究ADAMDEC1、SCAPER、TRPM2、CGA、HBG2基因在牙釉质型颅咽管瘤组织及正常对照组织中表达水平的差异。方法通过荧光定量PCR的方法精确测定并比较ADAMDEC1、SCAPER、TRPM2、CGA、HBG2基因在牙釉质型颅咽管瘤组织及正常垂体柄组织的表达水平。结果在牙釉质型颅咽管瘤组织ADAMDEC1和TR-PM2基因的表达水平明显升高,CGA和HBG2基因的表达水平明显下降。结论ADAMDEC1、TRPM2、CGA、HBG2基因在牙釉质型颅咽管瘤组织中存在表达异常,其意义有待进一步研究。

SSH法结合定量PCR技术研究双肌臀猪肌肉组织的差异表达基因

利用抑制性消减杂交技术(suppression subtractive hybridization,SSH) 成功地构建了双肌臀与非双肌臀大白猪肌肉组织差异表达的消减cDNA文库,获得有效克隆686个. 对整个文库测序分析,共获得587条有效序列. 利用BLAST在线软件与GenBank、GenBank EST和Tigr Porcine EST等数据库进行同源序列比较,发现其中有11个未知新序列,可能代表“双肌臀”大白猪肌肉组织特异表达的新基因. 对文库中所包含的兰尼啶受体基因(RYR1) 、钙依赖性蛋白激酶基因(CAMK2)、人类胰岛素生长因子结合蛋白-7 基因(IGFBP7),以及695号、882号和480号3个新基因进行了实时荧光定量PCR检测,结果显示:RYR1、CAMK2及IGFBP7基因在双肌臀猪肌肉组织RNA池中的表达量,分别为对照的非双肌臀猪肌肉组织RNA池中表达量的1.87、1.90和1.85倍;695号、882号和480号3个新的ESTs在双肌臀猪肌肉组织RNA池中的表达量为非双肌臀猪肌肉组织RNA池中表达量的1.48、1.44和1.78倍. 这提示我们,上述基因的上调表达很可能与猪双肌臀性状的发生有密切的关系,可以作为研究该性状的候选基因.

淹水胁迫下中国南瓜转录组及差异表达基因分析

近年来,受全球气候变化的影响,洪涝灾害频繁发生,已严重影响我国南瓜生产。为研究南瓜耐涝机理,以耐涝性强和淹水敏感的2份中国南瓜为试材,采用双套盆法进行淹水胁迫,利用转录组测序及实时荧光定量PCR进行差异表达基因分析。结果表明:淹水胁迫后,耐涝型南瓜材料013-2叶片氧化酶基因相对表达量整体上调,均高于淹水敏感型南瓜材料367-2;013-2和367-2叶片鉴定出3231个差异表达基因,其中上调表达基因1778个,下调表达基因1453个。GO富集发现差异表达基因显著富集在光合作用、乙烯反应、磷酸信号转导系统、细胞对乙烯刺激的反应、乙烯激活信号通路等生物过程中;KEGG注释发现有947个差异表达基因被注释到121条代谢通路中,包括光合作用-天线蛋白、植物激素信号转导、MAPK信号通路、植物-病原体相互作用、苯丙烷类生物合成等。KEGG GSEA发现植物激素信号转导、昼夜节律、MAPK信号通路、植物-病原互作等基因集得最高分。研究结果可为进一步探索与南瓜耐涝相关的基因奠定基础。

用mRNA差异显示方法筛选HIV/HCV合并感染者差异表达基因

目的建立信使RNA(messenger RNA,mRNA)差异显示技术平台,寻找艾滋病病毒/丙型肝炎病毒(HIV/HCV)合并感染者差异表达基因。方法分离正常人、HIV感染者、HCV感染者及HIV/HCV合并感染者的外周血单核细胞,提取RNA,定量后利用锚定引物进行逆转录合成cDNA,然后利用10对随机引物及锚定引物进行PCR扩增。行6%变性PAGE凝胶电脉,银染后分析结果,回收差异条带测序。通过SYBRgreen实时荧光定量PCR以β-actin为内参,进行大量人群样本的定量分析鉴定。结果共筛选出107条差异表达条带,其中大部分是感染者与正常人之间的差异显示条带。已鉴定6个序列,其中2个序列是未知功能基因,3个序列为锌指蛋白141 (RNF141),1个序列为环磷酸腺苷磷酸化蛋白(ARPP-19)基因。经过对超过10份病人血样RNF141荧光定量PCR初步鉴定,在HIV/HCV合并感染者、HCV感染者中,RNF141的表达水平高于正常人。结论RNF141与HIV/HCV合并感染及HCV感染可能存在一定相关性。同时证明,利用mRNA差异显示方法可以筛选出与HIV/ HCV合并感染或单独感染相关的差异表达基因。

应用FDDRT-PCR技术研究低剂量过氧化氢诱导细胞适应性反应的基因差异表达

目的用荧光差异显示RT-PCR(FDDRT-PCR)技术寻找低剂量的过氧化氢(H2O2)诱导人胚肺成纤维细胞(MRC-5)适应性反应差异表达的基因,为进一步研究低剂量的环境化学污染物(ECPs)诱导机体的生物学效应及其机制提供科学依据。方法依据H2O2对MRC-5毒性的剂量反应关系,选择低剂量和高剂量,并建立低剂量H2O2诱导MRC-5的适应性反应模型。用乳酸脱氢酶漏出率(LDH%)、Annexin V/PI检测细胞凋亡验证适应性反应模型。然后用FDDRT-PCR寻找不同方式刺激下差异表达的基因,鉴定和验证部分差异表达的基因。结果MTT获得适应性反应的模型,乳酸脱氢酶漏出率和Annexin V/PI检测细胞凋亡的结果都验证了适应性反应的模型。对不同方式处理的细胞RNA进行FDDRT-PCR,找到60个差异条带。对其中的5个差异条带进行鉴定,发现其中4个已知基因(bcl-2、EIF3S5、NDUFS4、RPS10),1个新基因。荧光定量PCR技术证实5个基因在不同处理组中的表达与荧光差异显示PCR图谱上一致。结论低剂量H2O2可以诱导MRC-5的适应性反应过程,其中bcl-2、EIF3S5、NDUFS4、RPS10在该过程中起着一定的作用。

P-糖蛋白编码基因mdr1在肝细胞癌中差异表达的定量检测

化疗药对于肝细胞癌（HCC）的疗效较差,有研究表明其与多种多药耐药（multidrug resistance,MDR）基因有关[1],而多药耐药基因1（mdr1）的编码蛋白P-糖蛋白（P-glycoprotein,P-gp）在其中占有重要地位[2],本研究利用逆转录实时荧光聚合酶链反应（Real-time PCR）技术定量检测了mdr1基因在肝细胞癌中的表达.

获得性血友病A患者血清miRNAs差异表达谱及功能miRNAs的初筛

目的 建立获得性血友病A(AHA)患者血清miRNAs差异表达谱,并探究潜在功能miRNAs分子。方法 收集13例AHA患者和13例健康对照的血清样本、人口统计学特征、APTT、FⅧ:C、FⅧ:Ab以及基础疾病情况,利用微列阵芯片技术分析其中3例AHA患者和3例健康对照血清样本,筛选差异表达miRNAs,并建立差异表达谱。在另外20例参试者(AHA和健康对照各10例)中,利用荧光定量PCR(qRT-PCR)技术分析验证差异表达miRNAs,筛选出潜在功能miRNAs。结果 微列阵芯片分析结果表明,有23个miRNAs在AHA患者和健康对照血清中表达水平存在显著差异(P<0.05)。实时荧光定量PCR技术(qRT-PCR)分析结果表明,与健康对照相比,AHA患者血清中4个miRNAs(miR-206、miR-144-5p、miR-374b-5p、miR-432-3p)显著上调(P<0.05),1个miRNA(miR-92a-3p)显著下调(P<0.05),其余18个miRNAs表达水平的差异不明显(P>0.05)。筛选出的5个miRNAs中,miR-206和miR-374b-5p与患者FⅧ:Ab显著正相关(P<0.05),而miR-92a-3p则与FⅧ:Ab显著负相关(P<0.05)。此外,miR-206和miR-92a-3p与患者罹患风湿性疾病、产后并发症、恶性肿瘤类基础疾病也存在显著相关性(P<0.05)。结论 本研究基于AHA患者血清建立了miRNAs差异表达谱,并筛选得到5个显著差异表达的miRNAs,为未来预防、诊断和治疗AHA提供了候选分子。

DDK综合症部分相关基因的实时定量PCR分析

为筛选与DDK综合症相关的基因,对其中4个表达量差异显著的基因(EGF、Bcl-2、Mcl-1、EGF-R)进行荧光定量PCR分析,以确定这些基因是否和DDK综合症相关。选用8～10周龄的清洁级小鼠,雌雄比例1∶1方式合笼交配,以DDK♀×BALB/c♂交配组合为试验组、BALB/c♀×BALB/c♂交配组合为对照组,依据胚胎发育时间,对植入前期2细胞期、4细胞期、8细胞期的胚胎进行观察和采集,提取总RNA并进行反转录,应用荧光定量PCR技术,比较所选的候选基因在不同交配组合中各胚胎时期的表达差异。结果表明,与对照组相比,EGF、Bcl-2、Mcl-1 3个基因在3个时期表达差异都极显著;EGF-R基因在4细胞期、8细胞期2个时期表达差异极显著。表明DDK综合症和所选的4个候选基因的作用相关。

三种国产乙型肝炎病毒基因荧光定量试剂检测结果分析

目的:探讨上海复星、深圳匹基、上海科华三种国产乙型肝炎病毒基因(HBV-DNA)荧光定量试剂的临床检测结果相互之间是否存在差异。方法:将相同的标本分别用三种国产HBV-DNA荧光定量试剂进行HBV-DNA荧光定量测定。然后再对检测结果进行对比,分析相互之间是否存在差异。结果:23例已知的慢性乙型肝炎患者标本,3例已知正常标本分别用三种国产HBV-DNA荧光定量试剂进行HBV-DNA定量检测,结果显示三种国产试剂的HBV-DNA定量检测结果相互之间差异小于一个数量级占91.4%,大于一个数量级小于二个数量级的占8.6%,经统计学分析差异无显著意义(P>0.05)。结论:上述三种国产HBV-DNA荧光定量试剂在同一套设备上的检测结果相互之间差异很小,有很好的准确度,它们的检测结果可以相互进行比较。

多胎与单胎山羊发情期卵巢褪黑素受体基因的差异表达研究

为探明褪黑素受体(MTR1A)对山羊产羔数等繁殖性状的调控作用,并比较多胎高产的济宁青山羊与单胎的沂蒙黑山羊发情期卵巢组织中MTR1A的差异表达量。采用荧光定量差异显示PCR(DDRT-qPCR)技术,以持家基因GAPDH为分子内标,对比研究了褪黑素受体1A(MTR1A)基因在多胎的济宁青山羊和单胎的沂蒙黑山羊发情期卵巢组织中的差异表达量。研究发现,MTR1A在两种山羊发情期的卵巢组织中均有表达,但是,在青山羊发情期卵巢组织中的表达量显著低于在沂蒙黑山羊卵巢组织中的表达量(P<0.05)。说明,发情期褪黑素受体基因在卵巢组织中的高表达是限制山羊卵巢排卵和产羔数的重要因素之一。研究结果提示:卵巢组织是褪黑素作用的重要靶器官,褪黑素对于山羊卵巢组织的发育、成熟和排卵具有重要影响。研究结果对于阐明褪黑素受体调控山羊生殖机能的作用机理提供了基础研究数据。