3种苹果病毒实时荧光定量RT-PCR检测体系的建立

苹果茎沟病毒(Apple stem grooving virus,ASGV)、苹果茎痘病毒(Apple stem pitting virus,ASPV)和苹果坏死花叶病毒(Apple necrotic mosaic virus,ApNMV)对果树的生长发育危害严重,而且复合侵染几率较高,为快速、灵敏和高效的检测3种病毒,本研究根据ASPV、ASGV和ApNMV基因组保守序列设计特异引物建立了3种病毒高灵敏度的实时荧光定量PCR检测体系(Real-time fluorescence quantitative reverse transcription PCR,RT-qPCR)。结果表明:引物ASGV-qF/qR-1、ASPV-qF/R-2和ApNMV-qF/R-3有较高的特异性,最适宜的退火温度分别为60℃、58℃和58℃,ASGV、ASPV和ApNMV 3种病毒的RT-qPCR体系比常规RT-2 PCR检测体系灵敏度高100倍,最低检出限分别为82.6、1.49×10^(2)和13.3 copies/μL。检测体系的Ct值的变异系数均小于5%,组间的变异系数在5%以内。河北农业大学果园中经RT-PCR确定带毒的88棵苹果树RT-qPCR检出率为100%,表明建立的RT-qPCR方法的可靠性和稳定性高,适用于田间果树3种病毒的检测,为苹果病毒的准确诊断提供了技术支撑。

菠萝凋萎相关病毒-1实时荧光定量RT-PCR检测体系的建立与应用

菠萝凋萎相关病毒-1(Pineapple mealybug wilt associated virus-1,PMWaV-1)是田间检出率最高的菠萝凋萎病毒。本研究根据PMWaV-1CP基因保守序列设计特异性TaqMan探针和引物,建立并优化了PMWaV-1实时荧光定量RT-PCR检测方法。优化后的反应体系制备的标准曲线为y=-3.307×log x+38.18,相关系数r2为0.998。试验结果表明,该方法能特异性地检测PMWaV-1,对PMWaV-2、3和阴性对照均无反应;最低检测限达到40拷贝。重复性试验表明批内和批间变异系数均小于1.98%,是一种操作简便、特异性强、灵敏度高、重复性较好的PMWaV-1定量检测方法。样品检测结果表明PMWaV-1在菠萝植株老叶、嫩叶和吸芽中的病毒含量呈递减趋势。

马铃薯Y病毒实时荧光定量RT-PCR检测体系的建立及应用

根据文献报道和GenBank已登录序列设计引物建立了马铃薯Y病毒(potato virus Y,PVY)实时荧光定量RT-PCR检测技术体系。该技术标准曲线循环阈值与模板浓度呈现良好的线性关系,相关系数R^2为0.9912,可特异性检测PVY,灵敏度达常规RT-PCR的1000倍,重复性好。利用建立的检测方法对山东省、青海省、贵州省、黑龙江省和河北省5个地区马铃薯植株中的PVY进行检测,检出率较常规RT-PCR技术分别高16.00、33.33、25.00、14.29、20.00百分点。因此,建立的PVY实时荧光定量RT-PCR检测体系具有特异性强、灵敏度高的特点,可以快速、准确地检测马铃薯带病种薯和植株中PVY的含量,为马铃薯Y病毒的早期监测和有效防治提供了有效的技术手段。

帕利亚姆病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用

本研究拟建立帕利亚姆病毒(Palyam virus,PALV)血清型特异性实时荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)方法用于临床样本或媒介中PALV血清型鉴定。根据我国流行PALV毒株的基因节段2序列,设计扩增引物和TaqMan探针,建立PALV血清型特异型qRT-PCR方法,对方法的特异性、灵敏性与重复性进行评估;以我国分离的28株PALV和90份核酸阳性血液样本评估检测方法的可靠性;利用建立的方法对采集库蠓样本中携带的PALV进行血清型鉴定。结果显示,建立的PALV血清型qRT-PCR检测方法具有良好的特异性与灵敏性,可检出核酸拷贝数下限在22至28 copies·μL^(-1)。对28株PALV的qRT-PCR检测结果与病毒测序鉴定结果一致;对PALV不同感染阶段哨兵动物血液(90份)中的qRT-PCR鉴定结果与分离病毒的血清型鉴定结果一致;建立的方法可准确鉴定库蠓中携带PALV的血清型。本研究建立的PALV血清型qRT-PCR定型方法具有良好的特异强、敏感性与重复性,可用于PALV感染动物与媒介中PALV血清型的鉴定,具有良好的应用价值。

实时荧光定量RT-PCR在麻疹和风疹病毒检测中的应用

目的探讨实时荧光定量RT-PCR在麻疹和风疹病毒检测中的应用效果。方法选取2021年12月—2022年12月盘锦市疾病预防控制中心接收的麻疹与风疹患者76例为研究对象,入院后所有研究对象均接受酶联免疫吸附试验法和实时荧光定量RT-PCR法检测,以检测患者恢复期血免疫球蛋白G(IgG)抗体水平(相对急性期是否4倍升高)为麻疹诊断金标准,对比两种检测方法的检测准确率、不同检测时间的阳性检出率。结果实时荧光定量RT-PCR法总诊断准确率为97.37%;酶联免疫吸附试验法中总诊断准确率为88.16%,比较两种方法的诊断准确率差异有统计学意义(P<0.05)。第1d,实时荧光定量RT-PCR法阳性检出率高于酶联免疫吸附试验法,差异有统计学意义(P<0.05)。第5d,实时荧光定量RT-PCR法阳性检出率低于酶联免疫吸附试验法,差异有统计学意义(P<0.05)。第2d、第3d、第4d实时荧光定量RT-PCR法和酶联免疫吸附试验法阳性检出率对比差异无统计学意义(P>0.05)。结论实时荧光定量RT-PCR对麻疹、风疹检测有一定诊断作用,可以有效提高检测准确率,同时操作简单,灵敏性较高,值得在麻疹与风疹病毒检测中推广。

应用实时荧光定量TaqManRT-PCR检测口蹄疫病毒

按照口蹄疫病毒 (FMDV )聚合酶 3D基因序列 ,设计合成了引物和探针 ,经各反应条件的优化 ,建立了实时荧光定量 RT- PCR技术 ,对细胞培养物、水泡液、水泡皮及分泌物、血液中的 FMDV进行了特异性检测和敏感性试验。结果 ,用 30 0 nmol/ L 的引物浓度和 2 0 0 nmol/ L 探针浓度 ,获得的 CT值较小 ,而 ΔRn最大 ;可检测到相当于 0 .1 TCID50 的病毒 RNA;与 VSV和其他水泡性病毒不发生交叉反应 ;制作的标准曲线中各浓度范围内有极好的线性关系 ,且线性范围宽 ,相关系数为 0 .984 ;组内和组间试验重复性的变异系数 (CV)分别为 5 .4 %和 6 .7% ;与常规 RT- PCR相比较 ,该方法具有快速、特异、敏感、可定量 。

Taq Man荧光定量RT-PCR快速检测甲3型流感病毒

目的建立一种特异、灵敏、快速的荧光定量RTPCR方法用于检测甲3型流感病毒核酸。方法根据GenBank登录的流感毒株序列,应用生物学软件进行序列比对,在甲3型流感病毒血凝素(HA)基因的保守区设计引物和TaqMan探针、并进行筛选。对荧光RT-PCR反应条件进行优化,检测该方法的特异性和灵敏度。并对疑似流感含漱液标本进行检测。结果该方法对甲3型流感病毒的检测有高度的特异性,对甲1型、乙型、禽流感病毒H5、SARS病毒及其他呼吸道病毒均无交叉反应,检测的灵敏度达0.01TCID50,可从疑似流感患者含漱液中直接检测流感病毒核酸,从病毒核酸提取至完成检测仅需3h左右。结论本研究建立的TaqMan荧光定量RTPCR是一种快速检测甲3型流感病毒特异、敏感的新方法。

荧光定量RT-PCR检测mdr-1基因表达

目的 :建立荧光定量RT PCR检测肿瘤细胞mdr 1基因表达的方法 ,了解肺癌组织中mdr 1的表达水平。方法 :建立荧光定量RT PCR方法 ,在PE770 0型检测仪上定量检测K5 6 2 /ADM耐药株和K5 6 2不耐药株细胞mdr 1基因表达水平 ,同时检测 45例初治肺部肿瘤病人组织标本。结果 :荧光定量RT PCR检测K5 6 2 /ADM耐药株和K5 6 2不耐药株细胞mdr 1基因表达 ,重复 10次实验所得结果平均分别为 (6 86± 0 6 5 )× 10 7拷贝 /μgRNA和 (8 49± 0 6 7)× 10 5拷贝 /μgRNA ,两者相差 80 8倍 ,变异系数分别为 9 5 %和 7 9%。 45例肺部肿瘤中 ,有 12例检出有mdr 1基因不同程度的表达。结论 :荧光定量RT PCR检测mdr 1基因表达方法 ,检测结果用绝对拷贝数来表示 ,定量准确可靠 ,并有利于标准的统一。有 1/4未经化疗的肺癌病人有一定水平mdr

猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒A多重荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为对引起腹泻症状的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪轮状病毒A(PRoVA) 3种病毒同时快速地鉴别检测,本研究对GenBank中登录的TGEV的S基因、PEDV的S基因、PRo VA的NSP基因进行序列分析,分别设计了针对3种病毒的特异性引物和用3种荧光基团标记的核酸探针,通过条件优化建立了针对这3种病毒的多重荧光定量RT-PCR方法。结果显示,该方法能够特异性检测PEDV、TGEV和PRo VA,而与其它病原无交叉反应;对TGEV、PEDV和PRo VA的最低检测量分别为1.12拷贝/μL、39拷贝/μL和25拷贝/μL;组内和组间变异系数均小于5%;该方法与商品化的试剂盒检测结果符合率达100%。该方法快速、敏感,检测结果准确可靠,为猪病毒性腹泻疾病的流行病学调查和分子生物学快速诊断奠定了基础。

SARS冠状病毒实时荧光RT-PCR定量检测

为建立一种快速、准确、特异的SARS病毒RNA定量检测方法 ,根据复合探针荧光定量分析原理 ,对SARS病毒核酸进行实时荧光定量RT PCR检测 .借助计算机辅助 ,对SARS病毒基因靶序列以及检测引物和探针进行了优化筛选 ;利用体外转录SARS病毒RNA靶序列 ,对RT PCR反应的镁离子浓度参数进行了优化 ;比较Trizol法、磁珠法、Qiagen法、煮沸法等 4种方法提取RNA的检测效果 ,建立了样本处理方法 ;通过对构建的体外转录靶序列模型的检测 ,对本方法的灵敏度、特异性、定量线性关系、精确度等进行了评价 ,并通过对4 2例临床标本的检测对本方法的检测效果进行了评估 .通过克隆SARS病毒核酸靶序列并进行体外转录 ,获得了长度约 1 2kb的体外转录RNA靶序列 ;经优化 ,荧光RT PCR反应液中的Mg2 + 浓度以 4 0mmol/L为最好 ;RNA提取方法采用磁珠法效果较好 ;本方法的检测灵敏度最低可达 5个拷贝的体外转录RNA分子 ,特异性10 0 % ,Ct 值的CV值小于 5 % .对临床确诊的 4 2份SARS病人血清和漱口水标本的检测结果表明 ,该方法的检出率为 79% ,与荧光抗体检测法的符合率为 70 % .上述结果表明 ,该方法建立的荧光定量RT PCR技术能够快速准确、特异、敏感地对SARS病毒核酸进行定量分析 ,为临床SARS冠状病毒RNA的检测提供了新的 。

鸡γ-干扰素实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为建立一种检测鸡γ干扰素的实时荧光定量RT-PCR方法,采用RT-PCR方法从ConA诱导活化的鸡脾淋巴细胞的总RNA中扩增得到鸡γ干扰素（ChIFN-γ）和鸡的28 S rRNA（Ch28 S）基因,将其分别克隆至体外转录载体后经体外转录获得了ChIFN-γ和Ch28 S的RNA,采用各自的特异性引物及Taqman探针,以Ch28 S RNA作为内参进行一步法实时荧光定量RT-PCR,检测ChIFN-γ.结果表明：ChIFN-γ和内参Ch28 S的Ct值与标准品稀释梯度在1×102～1×107拷贝/μL范围分别呈良好的线性关系,γ2均大于0.99.此方法用于检测ChIFN-γ,具有简便、高效、敏感、特异的特点.

荧光定量RT-PCR快速检测B型流感病毒的研究

目的:利用荧光定量RT-PCR技术建立一种快速检测B型流感病毒的方法。方法:根据B型流感病毒HA基因的相对保守序列分别设计一对引物及其相应的Taqman探针,建立、优化反应体系后,利用10倍稀释法检验方法的灵敏度并建立相对定量标准曲线;特异性检验后利用临床标本与普通RT-PCR法进行比较。结果:B型流感病毒检测反应的灵敏度为5.0×10-6TCID50,标准曲线相关系数为0.998,扩增效率为107.8%,5种非B型流感病毒病原体检测均为阴性,说明此方法具有很好的稳定性、重现性和特异性。结论:本研究建立荧光定量RT-PCR技术可以准确检测B型流感病毒,不仅灵敏度高、稳定性好,而且可以对病毒滴度进行定量检测。

一步法MGB荧光定量RT-PCR检测埃博拉病毒扎伊尔亚型和苏丹亚型方法的建立

目的为了建立一种快速准确的检测埃博拉病毒(EBOV)亚型的方法。方法本研究根据GenBank中公布的EBOV NP基因序列,设计引物和MGB探针,通过优化反应条件,建立了一种检测EBOV扎伊尔亚型和苏丹亚型的一步法MGB荧光定量RT-PCR方法。结果以体外转录的EBOV RNA为模板进行试验,该方法检测的灵敏度可以达到1.0×103个拷贝/μL,检测范围达到8个数量级为103～1010。建立的方法对马尔堡病毒(MARV)、登革病毒(DENV)、新疆出血热病毒(XHFV)、乙型脑炎病毒(JEV)、流感病毒(H1N1和H3N2)和猪繁殖和呼吸综合征病毒(PRRSV)E基因组RNA无非特异性扩增。结论本文将荧光定量RT-PCR技术用于埃博拉病毒的定量检测中,并且建立了EBOV扎伊尔亚型和苏丹亚型荧光定量RT-PCR检测方法,具有一定的创新性。该方法的建立对加快我国EBOV诊断技术的研究具有重要推动作用。

猪δ冠状病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立与初步应用

本研究旨在建立一种灵敏、快速检测猪δ冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)的TaqMan荧光定量RT-PCR方法。参照GenBank中PDCoV有关基因序列,设计一对特异性引物用于扩增PDCoV M 基因。将测序正确的基因片段克隆入pMD18-T载体,构建重组质粒作为建立标准曲线的病毒模板。设计合成一对特异性引物与TaqMan探针,进行反应条件和反应体系的优化,建立快速检测PDCoV的TaqMan实时荧光定量RT-PCR方法,并进行该方法的灵敏性、特异性与重复性验证。结果表明,该方法能有效扩增1.0×10^1 ~1.0×10^9 拷贝·μL^-1 的PDCoV标准质粒,建立的标准曲线呈现良好的线性关系。该方法的检测灵敏度为1.0×10^1 拷贝·μL^-1;对猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪伪狂犬病病毒等病原不发生交叉反应,具有很好的特异性;重复性试验结果显示变异系数(CV)小于1%,重复性良好。对2017—2018年期间收集的河南省不同猪场的100份腹泻病料进行检测,PDCoV的阳性检出率为23%(23/100),与PDCoV SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR检测方法的符合率为100%。人工感染PDCoV的仔猪,取攻毒后不同时间的粪便样品,应用本研究建立方法与常规RT-PCR方法对样品进行检测,TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的灵敏度远远优于常规RT-PCR。上述结果表明,本研究所建立的TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法能够灵敏、特异地检测PDCoV,可用于临床PDCoV的检测。

H7亚型禽流感病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

H7亚型禽流感病毒致病性强、危害性大,是进出口家禽及禽类产品的主要检疫对象。为了加强对H7亚型禽流感病毒的检测,建立新的快速检测方法。通过对GenBank已报道的H7亚型禽流感病毒的HA基因进行序列分析比较,设计了两套分别针对H7N2亚型和H7Nx亚型的特异性引物和用FAM标记的Taq Man MGB核酸探针,建立了H7亚型禽流感病毒实时荧光定量RT-PCR方法(Real-time RT-PCR)。该方法特异性好,不存在假阴性和假阳性的现象;敏感性高,对禽流感病毒H7亚型标准HI抗原检测的敏感性达到10-5,能够满足口岸禽流感病毒快速、准确、有效的检疫需求。

新型鸭呼肠孤病毒一步法TaqMan-MGB荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用

为建立一种快速、敏感和特异性检测新型鸭呼肠孤病毒(novel duck reovirus,NDRV)的方法,本研究根据GenBank数据库中NDRV S3基因保守序列设计1对特异性引物和1条MGB荧光探针,建立了一种检测NDRV的一步法MGB荧光定量RT-PCR方法,对其特异性、敏感性和重复性进行检验,并与普通RT-PCR进行比较。结果显示,扩增标准曲线相关系数为0.999,扩增产物的熔解曲线仅出现单特异峰。该方法对经典鸭呼肠孤病毒、H9N2禽流感病毒、鸭坦布苏病毒、A型鸭肝炎病毒、鸭新城疫病毒、鸭瘟病毒及番鸭细小病毒均未检测到信号,对NDRV的最小检出量为10拷贝·μL^-1。组内和组间变异系数均小于2%,重复性好。此外,利用该方法对239份疑似新型呼肠孤病毒病样品进行检测,常规RT-PCR检测时有75份为阳性,一步法TaqMan-MGB荧光定量RT-PCR方法检测时有100份为阳性,而且常规RT-PCR检测出的阳性样品用一步法TaqMan-MGB荧光定量RT-PCR检测时均为阳性,符合率为100%。该检测方法的建立为NDRV早期快速检测及定量分析提供新的方法。

实时荧光定量RT-PCR法快速定量检测果蔬中星状病毒

目的:针对不同果蔬表面建立星状病毒富集与RNA提取方法,结合已报道的实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)引物和探针,实现果蔬中星状病毒的高灵敏快速定量检测。方法:利用10倍梯度稀释的星状病毒c RNA分子检测Ct值及其对应的初始浓度,构建标准曲线,为星状病毒的定量检测提供参考。将ISO/TS 15216-2:2013针对果蔬中诺如病毒和甲肝病毒RNA的提取方法用于星状病毒的检测,利用人工感染的大白菜和草莓样品,分析病毒回收率、灵敏度及检测重复性。最终通过60份果蔬样品的检测验证该方法的实用性。结果:所建立的实时荧光定量RT-PCR方法扩增效率达95.9%,检测低限为5.6拷贝/反应。人工感染的大白菜样品中病毒回收率在0.94%~9.63%之间,而人工感染草莓样品中病毒回收率最高达1.03%。对同一感染浓度的样品在不同时间的检测结果变异系数均小于2%。最终检出1份来自北京农贸市场的草莓样品为星状病毒阳性,检测阳性率达1.67%。结论:建立的果蔬中星状病毒荧光RT-PCR定量检测方法快速、高效、灵敏,在食源性病毒的日常筛查和风险评估工作中具有重要的应用价值。

应用Taq Man荧光定量RT-PCR快速检测肠道病毒的研究

目的建立一种快速、灵敏、特异的荧光定量RT-PCR检测肠道病毒的方法。方法根据GenBank中肠道病毒5′UTR序列,应用生物软件在保守区设计与筛选特异引物和TaqMan探针,对荧光定量RT-PCR反应体系与条件进行优化,验证方法的特异性、敏感性和重复性。并通过对急性临床样本的检测,评价该方法的实际应用价值。结果该方法对肠道病毒包括脊髓灰质炎病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型及柯萨奇病毒和埃可病毒等的检测有高度特异性,甲肝病毒、乙脑病毒、登革病毒、腺病毒、单纯疱疹病毒、诺如病毒等均呈阴性。该方法的检测下限达10-1TCID50/100μl。12份急性结膜炎病例结膜拭子标本中7份肠道病毒核酸阳性,普通RT-PCR方法5份阳性。结论TaqMan荧光定量RT-PCR方法快速、敏感、特异,适于肠道病毒的快速检测。

葡萄卷叶伴随病毒2实时荧光定量RT-PCR技术的检测应用

通过引物筛选和体系优化建立了葡萄卷叶伴随病毒2 Grapevine leafroll-associated virus 2(GLRaV-2)的SYBR GreenⅠ染料法实时荧光定量RT-PCR检测技术。该技术标准曲线扩增效率为102.2%,决定系数为0.999,最低检出限可达10-3稀释梯度,是常规RT-PCR的100倍。对不同季节和不同部位葡萄样品的检出率普遍高于常规RT-PCR。春夏秋季样品检出率分别为67%、89%和86%,比常规RT-PCR检出率分别高42%、28%和17%。冬季休眠枝条检出率最高(100%),与常规RT-PCR相同。夏季老叶柄和卷须、秋季和冬季枝条等样品检测效果最好,检出率均为100%。对来自我国17个省38个品种的116份田间葡萄样品检测结果表明,qRT-PCR共检测到10个样品为阳性,检出率略高于常规RT-PCR。

牛精液中基因I型牛病毒性腹泻病毒荧光探针定量RT-PCR检测方法的建立

为建立牛精液中基因I型牛病毒性腹泻病毒(BVDV-1)的快速检测方法,本研究采用Sephycral S-400凝胶对牛精液过滤处理后提取病毒核酸,根据BVDV-1 5'UTR保守区基因序列,设计特异性引物和荧光探针,通过反应条件的优化,建立了牛精液中BVDV-1荧光定量RT-PCR检测方法。该方法可以检测到牛精液中含量为0.0125 TCID50的病毒,灵敏度比病毒分离方法高200倍～2 000倍,比常规RT-PCR方法高10倍。对从同一个牛场6个月内采集的120份新鲜牛精液和40份冷冻牛精液用该荧光RT-PCR方法检测,没有检测到BVDV-1阳性样品。对其中的10头牛定期检测精液中病毒的同时,并同步检测了全血中的病毒和血清抗体,结果血清抗体阳性牛精液中没有检测到病毒,本研究结果表明,不能以血清抗体阴阳性做为精液是否带毒的依据。