实时荧光聚合酶链反应技术在献血者血液筛查中的应用

目的评估将实时荧光聚合酶链反应技术应用于血液常规筛查的必要性。方法使用实时荧光聚合酶链反应技术对酶免双试剂及转氨酶检测合格的无偿献血者血液标本进行核酸筛查，初筛阳性标本进行病毒项目确认。确认阳性标本进一步做病毒载量和血清标志物检测。结果19562人份酶免阴性标本中共检出12份HBVDNA阳性标本，病毒载量为（〈12～30．6）IU／mL。其中5份为乙肝隐匿性感染，3份为乙肝感染恢复期，2份为变异病毒感染，2份为疑似乙肝窗口期感染。结论将实时荧光聚合酶链反应技术应用于血液筛查有利于提高成都地区输血安全，特别是对检出ELISAHBsAS阴性的低浓度乙型肝炎感染者具有重要意义。

应用实时荧光聚合酶链反应技术与第二代杂交捕获法检测高危亚型人乳头瘤病毒

目的比较实时荧光聚合酶链反应(PCR)与第2代杂交捕获法(HC-Ⅱ)2种人乳头瘤病毒(HPV)检测方法。方法采用实时PCR与HC-Ⅱ分别检测223例宫颈脱落细胞标本中的高危亚型HPV,对结果不一致的标本进行测序分析。结果实时PCR和HC-Ⅱ2种方法检测高危亚型HPV的一致性较好,总符合率为77%,总一致性指数(Kappa指数)为0.538。其中,高度鳞状上皮细胞内病变(HSIL)组二者的符合率为82%,Kappa指数为0.410,一致性比其他组好。结论实时PCR与HC-Ⅱ检测结果一致性较好,尤其对于HSIL患者,可作为临床上HPV高危亚型检测的有效手段。

实时荧光聚合酶链反应检测HBV基因型B～D方法的建立

目的建立实时荧光聚合酶链反应检测乙型肝炎病毒(HBV)基因型B^D方法并验证其准确性。方法比较GenBank中已发表的明确分型的143株HBV全序列,设计特异的组合引物探针,应用实时荧光聚合酶链反应HBV基因分型法对兰州地区128例慢性乙型肝炎患者血清标本进行基因型B、C、D检测,并随机对检测的基因型各3株标本进行S基因测序验证。结果128例标本中B型检出率为20.3%(26/128),C型71.9%(92/128),D型7.8%(10/128);18株HBV克隆标本S基因测序结果与本分型法完全一致。结论实时荧光聚合酶链反应HBV基因分型法能够简便、灵敏、快速、准确地鉴定HBV基因型,适宜用于HBV基因型的大规模临床和流行病学调查。

实时荧光聚合酶链反应检测肺部感染患者痰标本中军团菌

目的建立实时荧光定量聚合酶链反应(PCR),检测肺部感染患者痰液中军团菌属特异性16SrRNA基因。方法利用军团菌属特异性16SrRNA基因保守序列设计引物和探针,优化反应条件和反应体系,对嗜肺军团菌、非嗜肺军团菌及其他病原菌标准菌株进行检测,验证该方法的特异性、敏感性、重复性;并对557例肺部感染患者痰液标本进行检测,同时采用PCR酶切法作比较,阳性者对基因扩增产物测序做验证试验。结果该方法检测军团菌属所有标准菌株均出现阳性信号,其他非军团菌属检测结果均为阴性,灵敏度为102 CFU/mL;577例肺部感染患者的痰液标本,实时荧光定量PCR军团菌检出阳性率为23.1%,PCR酶切法检出阳性率为19.9%,经16SrRNA基因测序验证军团菌阳性率为17.2%,3种方法检出阳性率差异无统计学意义(P>0.05)。结论实时荧光定量PCR检测患者痰液标本中军团菌,具有快速、简便的特点,可作为临床军团菌感染患者的一种辅助诊断试验。

SYBR-GreenⅠ实时荧光聚合酶链反应结合融解曲线分析技术在α-珠蛋白生成障碍性贫血基因诊断中的应用

目的探讨SYBR-GreenⅠ实时荧光PCR(SYBR-PCR)结合融解曲线分析(D.C)技术进行α-珠蛋白生成障碍性贫血(α-地贫)基因诊断的价值。方法对22个家系中的37份样品采用4管SYBR-PCR结合D.C进行--SEA、-α3.7,-α4.2及非缺失型(αα)4个等位基因型的检测,进而作出基因诊断。同时运用单管多重PCR(mPCR)结合凝胶电泳技术进行基因检测加以对照确认。结果22个家系中6个家系检出有--SEA或-α3.7携带者,其中东南亚型缺失携带者(--SEA/αα)7例,右侧缺失携带者(-α3.7/αα)3例,东南亚型缺失与右侧缺失双重杂合子(--SEA/-α3.7)1例。2例为胎儿产前诊断。其中1例为Bart′s水肿胎儿(--SEA/--SEA),另1例为东南亚型缺失携带者(--SEA/αα)。用mPCR凝胶电泳技术得出的基因诊断结果与上述结果一致。结论SYBR-PCR结合D.C技术在α-地贫的基因诊断、携带者检出及产前诊断方面具有实用价值。

荧光聚合酶链反应技术在乙型肝炎病毒基因分型中的应用

目的 探讨适合临床检验和科研应用的乙型肝炎 (乙肝 )病毒基因分型方法 ,研究荧光聚合酶链反应技术 (PCR)技术在HBV DNA基因分型中的实用性和可行性 ,了解广州地区儿童乙肝无症状携带者HBVDNA的基因型。方法 设计两对扩增S基因引物 ,3条针对B、C、D基因型荧光探针 ,进行荧光PCR检测。结果 广州地区HBVDNA的基因型以B型和C型为主 ,其中B型 6 2 .7% ,C型 35 % ,B、C混合型 3.3%。结论 荧光PCR基因分型方法在实际应用中分型率高 ,操作相对简便 。

实时荧光聚合酶链反应检测性病患者泌尿生殖道沙眼衣原体的临床分析

采用实时荧光聚合酶链反应(PCR)检测性病患者泌尿生殖道沙眼衣原体,进行临床和实验室分析。采集380例男女性病患者泌尿生殖道分泌物,进行多形核白细胞数检测和荧光PCR。结果显示,216例男性患者中,尿道多形核白细胞数≥5个者占92.59%,荧光PCR检测沙眼衣原体阳性62例,阳性率为28.70%;沙眼衣原体合并淋病奈瑟菌感染30例,合并感染率为13.89%。164例女性患者中,87例宫颈管内多形核白细胞数≥10个(占53.05%),荧光PCR检测沙眼衣原体阳性33例(占20.12%)。结果提示,性病门诊开展实时荧光PCR检测沙眼衣原体可提高检测阳性率和控制沙眼衣原体传播。

基于荧光聚合酶链反应的脆性X综合征产前筛查技术的建立

目的建立针对脆性X综合征FMR1基因CGG重复数的快速产前检测技术方法,用于基于人群的筛查。方法采用荧光PCR法对356名孕妇进行产前FMR1基因CGG重复数检测。结果本方法可检测CGG重复数小于130的携带者,共275例(77.25%)毛细管电泳结果显示为2组峰,提示为杂合型基因型,可明确诊断。81例(22.75%)仅见到一组峰,提示可能为纯合子,也可能为CGG重复数高于130的携带者。结论基于荧光PCR的检测技术,临床上可实现近80%孕妇FMR1基因CGG重复数精确、快速的初筛,剩余病例的明确诊断尚需其他技术辅助。

荧光聚合酶链反应用于阴道炎性病病原体检测

目的 了解阴道炎患者生殖道性病病原体NGH、CT、Uu、HPV6 ,1 1 流行情况。方法 将PCR技术与荧光素标记探针相结合 (FQ -PCR) ,对阴道炎患者的宫颈柱状上皮进行NGH、CT、Uu、HPV6 ,1 1 定量检测。结果 阴道炎患者中四种病原体总感染率95 .70 % ,阳性率依次为Uu(70 .0 0 % ) >CT(61 .30 % ) >NGH(1 4 .0 0 % ) >HPV6 ,1 1 (1 0 .30 % )。病原体混合感染率 (51 .30 % ) ,以解尿支原体并发其他病原体感染率最高 (45 .30 % ) ,其次是沙眼衣原体 (44.30 % ) ,淋球菌 (9.0 0 % ) ,尖锐湿疣 (5 .70 % ) ,病例中 2 0～ 39岁患者感染NGH、CT、Uu、明显多于其他年龄组。结论 对阴道炎患者医生应尽可能做各种性病病原体检测 ,以明确诊断 ,及时治疗。

实时荧光聚合酶链反应在检测冷冻禽、畜肉类中沙门菌中的应用

目的探讨实时荧光聚合酶链反应检测技术(RT-PCR)在冷冻禽、畜肉类沙门菌快速检测中的应用价值。方法选取2017年1月至2019年12月冷冻禽、畜肉类270份,采取RT-PCR法进行沙门菌检测及血清分型鉴定,并按照《食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验》(GB 4789.4—2016)(以下简称《标准》)的规定进行检验。比较两种检测方法检测阳性率、敏感度、特异度以及对RT-PCR鉴定结果及血清分型鉴定结果进行分析。结果RT-PCR对冷冻禽、畜肉类中沙门菌检测阳性率11.85%(32/270)高于《标准》(18/270)(χ^(2)=4.320,P=0.038);RT-PCR检测敏感度高于《标准》,差异有统计学意义(χ^(2)=16.170,P<0.001),RT-PCR检测特异度与《标准》比较,差异无统计学意义(P>0.05);对所检出沙门菌实施血清分型鉴定后得知,肯塔基血清型、海德堡血清型、鼠伤寒血清型、肠炎血清型占比最高,分别可达21.875%(7/32)、18.750%(6/32)、15.625%(4/32)、12.500%(4/32)。结论RT-PCR法在冷冻禽、畜肉类沙门菌快速检测中具有较高应用价值,可准确检测出沙门菌,并明确其具体分型。

实时荧光聚合酶链反应技术及应用于病原体检测的进展

聚合酶链反应飞速的发展使其成为分子生物学实验室的重要工具,实时荧光聚合酶链反应技术以其敏感性高、重复性好、定量准确、速度快和污染少使聚合酶链反应技术又向前迈进了一步。本文对实时荧光聚合酶链反应技术的方法学作一介绍,同时也讨论了此技术存在的不足,并对其目前在病原体检测中的主要应用进行综述。

荧光聚合酶链反应在乙型肝炎病毒定量检测中的临床意义

乙型肝炎病毒（hepatitis Bvirus，HBV）引起的慢性乙型肝炎是我国的一种常见多发病。HBV的复制和表达引发的免疫应答对宿主肝细胞造成损伤。本文将205例慢性乙型肝炎患者的血清以HBeAg，HBeAb阳性进行分组，对各组血清中HBV含量进行检测比对，现报告如下。

生殖支原体16SrRNA基因和MgPa基因TaqMan荧光聚合酶链反应检测的比较研究

目的对生殖支原体(Mg)16Sr RNA基因和Mg Pa基因Taq Man荧光聚合酶链反应(PCR)检测结果进行比较,选取敏感度更高的靶基因进行Taq Man荧光PCR检测。方法选取Mg 16Sr RNA基因和Mg Pa基因为靶基因,根据已报道文献设计合成特异性扩增引物和探针,对泌尿生殖道拭子标本进行Taq Man荧光PCR检测,对Mg不同靶基因Taq Man荧光PCR检测结果进行统计学分析。结果 Mg 16Sr RNA基因Taq Man荧光PCR检测敏感性为90%,Mg Pa基因Taq Man荧光PCR检测敏感性为97.5%。结论 Mg Pa基因Taq Man荧光PCR敏感性要高于16Sr RNA基因Taq Man荧光PCR。

荧光聚合酶链反应–毛细管电泳法与Sanger测序法检测胶质瘤中端粒酶反转录酶基因启动子突变状态对比分析

目的对比分析荧光聚合酶链反应-毛细管电泳(polymerase chain reaction-capillary electrophoresis,PCR-CE)法及Sanger测序法检测胶质瘤中端粒酶反转录酶(telomerase reverse transcriptase,TERT)基因启动子突变的敏感度、特异度及一致性,为临床检测提供方法学依据。方法收集2017年11月至2019年11月首都医科大学宣武医院265例胶质瘤标本及临床病理资料,分别采用Sanger测序法与荧光PCR-CE法检测TERT基因启动子突变。结果TERT基因启动子突变与年龄、组织学分型和WHO分级均显著相关(P<0.05)。Sanger测序法与荧光PCR-CE法的TERT基因启动子突变检出率分别为52.8%(140/265)及51.3%(136/265),敏感度和特异度分别为96.4%和99.2%,符合率为97.7%,具有较好一致性(Kappa=0.955)。Sanger测序法检出TERT C228T突变103例(38.9%),荧光PCR-CE法检出99例(37.4%),敏感度和特异度分别为95.2%和99.4%,符合率为97.7%,具有较好一致性(Kappa=0.952)。Sanger测序法和荧光PCR-CE法均检测出TERT C250T突变37例(14.0%),符合率为100.0%,具有较高一致性(Kappa=1.000)。结论荧光PCR-CE法检测TERT基因启动子突变率与Sanger测序法相当,敏感度、特异度及一致性均较高,且操作相对简便快速。

宫颈人乳头瘤病毒第二代杂交捕获法和实时荧光聚合酶链反应检测法的临床应用比较

目的:比较第二代杂交捕获法(HCⅡ)与实时荧光聚合酶链反应技术(real-time PCR)在检测女性生殖道人乳头瘤病毒(HPV)高危亚型中的临床价值。方法:随机选取2011年1～6月我院妇产科行液基细胞薄层涂片技术进行低度鳞状上皮内病变(LSIL)检查,检查结果为未明确诊断意义的不典型鳞状上皮细胞(ASCUS)患者100例,分别采用real-time PCR与HCⅡ检测HPV高危亚型,比较两者的检测结果。对检测HPV阳性的样本或HPV阴性但液基细胞薄层涂片技术(LCT)≥LSIL的妇女采用阴道镜下活组织病理学检查,以病理结果作为验证两种HPV检测的参考标准。结果:共取病理68例。病理结果证实该人群中子宫颈上皮内瘤变(CIN)Ⅲ级5例,CINⅡ级11例,CINⅠ级19例,慢性宫颈炎和鳞状上皮化生33例。该100例患者HCⅡ和real-time PCR检测高危型HPV的阳性率分别为63.0%和71.0%,二者总符合率为82.3%;HCⅡ检测手段对高危宫颈病变患者进行高危HPV筛查的灵敏性、特异性、准确性、阳性预测值、阴性预测值、阳性似然比和阴性似然比分别为79.3%、88.2%、91.2%、10.1%、99.7%、8.9和0.327;real-time PCR以上各指标分别为100.0%、92.5%、86.7%、8.6%、100.0%、8.7和0。结论:Real-time PCR与HCⅡ检测宫颈上皮内瘤变患者高危型HPV有较好的相关性;但real-time PCR检测高危型HPV具有更好的敏感性和特异性。

检测戊型肝炎病毒核酸的实时荧光聚合酶链反应法的建立

目的建立一种能快速、敏感地检测戊型肝炎病毒(HEV)核酸的实时荧光聚合酶链反应法(Real-timeRT-PCR)。方法基于HEVORF3保守区序列,设计引物和探针,从22对引物和4条探针中进行筛选,并对选出的引物和探针的浓度、反应体系、反应条件、核酸抽提方法等进行优化。采用常规套式RT-PCR和本研究建立的实时荧光RT-PCR检测不同样品,比较两种方法的特异性和敏感性。结果优化出1对引物和探针的组合。优化的30μl反应体系中,上、下游引物浓度均为0.10mmol/L,探针浓度为0.20mmol/L,Taq酶的浓度为3U,AMV逆转录酶浓度为2U。优化的反应条件为:50℃30min;95℃3min;95℃10s,50℃30s,72℃60s,5个循环;95℃10s,57℃40s,40个循环。初步检测结果显示,该方法与常规套式RT-PCR特异性符合率为100%,两种方法检测HEV1型样品的敏感性均为104,检测人和猪的HEV4型样品时,实时荧光RT-PCR敏感性均为104,明显高于常规套式RT-PCR的103和102。结论所建立的检测HEV核酸的实时荧光聚合酶链反应法具有简便、快速、敏感性较高以及不易被污染等优点,具有一定的临床应用潜力。

基于三重实时荧光聚合酶链反应构建黄牛和牦牛源性成分同步检测方法

目的建立一种拥有内源质控的三重实时荧光聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)技术,用以快速鉴定肉和乳中黄牛和牦牛的源性成分。方法首先对黄牛肉、牦牛肉、黄牛奶、牦牛奶等7种动物产品进行特异性检测,同时通过稀释梯度方法验证此方法的绝对检出限(limit of detection,LOD),最后通过黄牛和牦牛肉掺假模拟试验确定该方法的相对灵敏度。结果该方法的特异性强,能特异性地检测到来源于黄牛和牦牛肉和乳的DNA,稳定扩增的内源质控有效地避免了假阴性结果,本方法针对黄牛奶的绝对LOD为2.5×10^(-3)5.0×10‒3 ng,针对牦牛奶的绝对LOD为2.5×10^(-3)5.0×10^(‒2)ng,本方法对黄牛肉和牦牛肉混合肉的相对灵敏度可达0.1%牦牛肉。结论所建立的三重实时荧光PCR方法特异性强、灵敏度高,可实现黄牛和牦牛源性以及内源质控的同步检测,又能通过内源质控排除实验假阴性结果。

实时荧光聚合酶链反应检测新型冠状病毒室内质控方法初探

目的绘制实时荧光聚合酶链反应(RT-PCR)定性室内质控图和基于循环阈值的Levey-Jennings质控图,探究新型冠状病毒RT-PCR检测的室内质控方法。方法使用无菌生理盐水按照1∶5、1∶10、1∶20、1∶30、1∶40对第三方质控物进行倍比稀释,确定室内弱阳性质控的稀释倍数。统计该实验室2022年1-2月新型冠状病毒RT-PCR阴阳性质控原始记录,以自定义数值绘制定性结果散点图。统计2022年1-2月每批次弱阳性质控的靶基因Ct值,分别对N基因和ORF1ab基因两组Ct值进行正态分布检验,根据前20次检测结果分别计算N基因和ORF1ab基因的靶值X和标准差s,绘制Levey-Jennings质控图。结果确定1∶30为每日室内质控的弱阳性质控品的稀释倍数。定性检测散点图可直观发现1次弱阳性质控检出阴性的“假阴性”反应。弱阳性质控N基因、ORF1ab基因Ct值均符合正态分布(P>0.05)。N基因Ct值靶值X为34.13,变异系数为1.91%,所有Ct值均在X±3 s以内,5次出现±2 s警告,符合Westgard质控规则。ORF1ab基因Ct值靶值为35.30,变异系数为2.58%,出现1次+3 s失控,5次±2 s警告,第31~41批次违反了10x规则,第73~80批次违反了R 4s规则。结论应用定性室内质控散点图和Levey-Jennings质控图建立的新型冠状病毒室内质控方法具有可行性,能够有效监测和预警检测过程中的质量问题,保证检测结果准确可靠。

实时荧光聚合酶链反应技术检测人乳头瘤病毒高危亚型的临床应用

目的:采用实时荧光聚合酶链反应技术(实时PCR)检测10种人乳头瘤病毒(HPV)高危亚型,比较不同病变程度标本的HPV高危亚型的检出率。方法:采用实时PCR法检测240例妇女宫颈脱落细胞标本中的10种HPV高危亚型,并对部分标本的检测结果应用测序法进行验证。结果:10种HPV高危亚型总的检出率为42.9%;高度鳞状上皮细胞内病变(HSIL)组的检出率均较低度鳞状上皮细胞内病变(LSIL)组要高,分别为81.7%与52.5%。15例HPV检测阳性的标本经测序验证均在10种亚型的范围内。结论:实时PCR法能同时检测10种HPV高危亚型,操作简便、结果准确,适合临床上用于HPV高危亚型的筛查检测。