药物筛选模型和技术及其在中药活性成分研究中的应用

现代生物技术的发展和药物作用靶标的揭示 ,为中药活性成分的研究提供了新的技术和手段。本文就整体动物模型、受体模型和分子生物色谱、细胞模型和细胞膜色谱、基因芯片技术 4种药物筛选模型和技术及其在中药活性成分研究中的应用进行了分析、综述 ,为推动中药活性成分研究、加速中药现代化步伐提供参考。

耐药鲍曼不动杆菌感染秀丽隐杆线虫药物筛选模型的建立及应用

目的:通过建立耐药鲍曼不动杆菌感染秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)模型,筛选对耐药鲍曼不动杆菌敏感的抗菌药物。方法:从临床患者标本中分离到的耐药鲍曼不动杆菌用于感染秀丽隐杆线虫后,加入哌拉西林钠、头孢噻肟钠、氨苄西林钠舒巴坦钠、亚胺培南、头孢曲松钠、头孢吡肟、美罗培南、头孢他啶、头孢哌酮钠、阿米卡星、左氧氟沙星、环丙沙星、米诺环素、两性霉素B 14种抗菌药物治疗,观察并记录秀丽隐杆线虫的存活情况,绘制感染耐药鲍曼不动杆菌后秀丽隐杆线虫的生存曲线。结果:美罗培南、亚胺培南、氨苄西林钠舒巴坦钠及米诺环素对耐药鲍曼不动杆菌感染的秀丽隐杆线虫有明显的治疗效果。结论:利用耐药鲍曼不动杆菌感染秀丽隐杆线虫药物筛选模型,可以为临床选择抗菌药物治疗耐药鲍曼不动杆菌感染提供参考。

药物筛选模型研究进展

The experimental models for drug screening are very important points in drug discovery Although the drug screening techniques have been developed, such as high throughput screening (HTS), the screening assay methods (models) still limited drug discovery In present paper, advanced animal models, cell assays and molecular methodology used for drug discovery were reviewed The characteristics and requires of the assay methods used for drug discovery in HTS were also

基于抗氧化反应元件的药物筛选模型的建立

目的建立基于抗氧化反应元件(antioxident responseelement,ARE)和SEAP报告基因的细胞筛选模型,用此模型对金雀异黄素、芹菜苷配基、儿茶素、茨非醇4种化合物进行活性比较,观察上述化合物拮抗过氧化氢损伤的作用,寻找具有强抗氧化活性作用的黄酮类化合物。方法构建重组报告基因表达载体pARE-TAL-SEAP与对照载体分别转染HEK-293细胞,检测上述黄酮类化合物作用后对SEAP的活性和抗氧化作用的影响。结果在加入25μmol.L-1H2O2进行氧化损伤的HEK-293细胞中,加入100μmol.L-1的4种化合物进行比较时金雀异黄素的抗氧化作用最强,金雀异黄素诱导SEAP的最大表达水平较对照孔升高1.3倍;加入25μmol.L-14种化合物的抗氧化作用时茨非醇的抗氧化作用最强,茨非醇诱导SEAP的最大表达水平较对照孔升高1.5倍。结论利用此模型可以检测H2O2的氧化应激反应并可筛选到抗氧化活性强的黄酮类化合物。

HIV-1 Tat蛋白结合Tar的抗艾滋病药物筛选模型的建立研究

目的建立H IV-1 Tat蛋白结合Tar的抗H IV-1药物筛选模型用于抗H IV药物筛选。方法构建表达H IV-1Tat蛋白的真核表达质粒(pCDNA3.1(+)-Tat)和H IV-1 LTR-luc荧光素酶报告基因,采用脂质体转染法共转染HeLa细胞,荧光仪检测Tat蛋白促进荧光素酶在HeLa细胞内的表达情况,建立H IV-1Tat蛋白结合Tar的细胞模型,用于抗H IV-1的药物筛选。以DRB(5,6-二氯-1-β-呋核亚硝脲-苯并咪唑)为阳性对照,进行模型的建立及条件的优化。结果通过反复试验表明,目的基因和报告基因的配比、转染时培养液中小牛血清的含量、细胞浓度、转染前细胞状态以及药物作用时间的长短等对模型的稳定性和敏感性有影响。结论应用优化的细胞模型对文冠果、紫苏等浸提物进行筛选及结果的分析。

以DNA回旋酶为靶点的抗细菌药物筛选模型的建立和初步应用

ＤＮＡ回旋酶是细菌特有的一种拓扑异构酶，它能够利用ＡＴＰ水解的能量将共价闭合环状ＤＮＡ转变为负超螺旋ＤＮＡ，从而维持细菌体内正常的超螺旋水平。目前发现，主要有两类化合物可抑制回旋酶的活性，一种是喹诺酮类化合物，一种是香豆素类化合物。前者主要是抑制ＤＮＡ－酶复合物的形成，后者主要是抑制ＡＴＰ水解和超螺旋反应的偶联。本研究建立了一个以ＤＮＡ回旋酶为靶点的抗细菌药物的定向筛选模型，并加以初步筛选。初筛阳性物质用纯化的ＤＮＡ回旋酶Ａ亚基和Ｂ亚基进行了更深入的研究。

高通量药物筛选模型

介绍了可用于药物筛选的 3种新的快速高通量筛选方法 ,包括基于反酵母双杂交的筛选系统 ;细胞平台伤的高通量筛选系统以及动物水平的筛选系统。并对其应用原理 。

基于报告基因和干扰素-α信号通路的药物筛选模型的建立

目的 建立基于报告基因和干扰素 α(Interferon α)信号通路的药物筛选模型,用于筛选具有IFN α样活性的小分子化合物。方法 构建带有ISRE(IFN αstimulatedresponseelement)靶序列和报告基因的诱导性表达载体,并将其转染入血管内皮细胞 (ECV304 )中,筛选报告基因碱性磷酸酶(SEAP)表达受IFN α诱导的阳性克隆。选取相关的细胞因子干扰素 β、干扰素 γ和生长因子甲状旁腺素(PTH)进行模型特异性考察。结果 ECV304细胞中SEAP的表达受IFN α的诱导并呈现剂量依赖关系,IFN α的最高诱导表达率是IFN β最高诱导表达率的 9 0倍、IFN γ的 8 8倍、PTH的 9 1倍,具有相对特异性。IFN α对ECV304细胞无增殖作用。本方法的Z' 因子为 0 8,说明此模型具有很好的稳定性。结论 本模型的SEAP基因表达水平能够被其特异性配体强诱导表达,利用此模型在 96孔板上用化学发光法测定SEAP基因的诱导表达水平可筛选具有IFN α样活性的小分子化合物。

基于脂代谢靶点蛋白hPPARγ-LBD的抗肿瘤药物筛选模型的研究

目的:建立一种以脂代谢靶点蛋白hPPARγ-LBD重组蛋白进行抗肿瘤药物筛选的方法。方法:采用pReceiver-B01-PPARγ-LBD表达质粒转至E.coliBL_(21)(DE_3)细胞,进行表达与纯化得到可溶性靶点蛋白hPPARγ-LBD重组蛋白,以罗格列酮为hPPARγ-LBD的阳性配体,以GW9662作拮抗剂,采用分子排阻色谱-高效液相色谱法(SEC-HPLC)测定hPPARγ-LBD重组蛋白与配体药物的结合活性。结果:在优化条件(16℃、0.6mmol/LIPTG、诱导20h)下,能可溶性表达hPPARγ-LBD重组蛋白;经镍亲和色谱纯化后,以每升LB培养基计可获得41mg、纯度为95%的hPPARγ-LBD重组蛋白;该重组蛋白与罗格列酮特异性结合率约65%,K_d值为625nmol/L;与德氮吡格(Tetrazanbigen,TNBG)特异性结合率约60%,K_d值为1000nmol/L。结论:本文基于脂代谢靶点蛋白hPPARγ-LBD建立了抗肿瘤药物体外筛选模型的方法,该方法快速、稳定、安全及简便,能应用于抗肿瘤药物的筛选。

基于酵母的高灵敏度抗朊病毒药物筛选模型建立及应用

建立一种高灵敏度抗朊病毒药物筛选模型研究传统中药的抗朊病毒作用。通过比较五种酵母朊病毒[PSI+]菌株在表型、生长特性和对抗朊病毒化合物敏感性方面的差异,优选出高药物敏感性酵母朊病毒[PSI+]菌株,并引入半变性琼脂糖凝胶电泳技术建立了一种高灵敏度抗朊病毒药物筛选模型;利用该模型研究了20种中药水提物治愈朊病毒的活性,发现淫羊藿和两面针水提物浓度为0.1 g.mL-1时,对酵母朊病毒[PSI+]的5 d治愈率分别为12.5%±3.5%和56.2%±9.1%,蛋白水平实验表明淫羊藿和两面针水提物具有治愈酵母朊病毒[PSI+]作用。

体外神经干细胞三维药物筛选模型的构建

研究目的：建立中药对神经干细胞诱导转变为神经细胞的体外模型，不仅对研究脑的发育和分化以及神经系统疾病的治疗具有重要价值，而且也有助于了解中药的作用机制，为中药的临床应用提供坚实的科学依据。本研究评价体外海马神经干细胞在胶原凝胶内的生长情况，探讨胶原凝胶作为神经系统组织支架材料的可行性，以建立适合于干细胞药物筛选及作用机理研究的三维培养模型。研究方法：①细胞培养：体外培养来源于孕13天胎鼠的海马部位神经干细胞，传至第三代；根据胶原的特性，把神经干细胞均匀混合于胶原的预凝胶溶液中，便可形成“细胞．胶原”的凝胶三维结构。②检测指标：倒置相差显微镜和激光共聚焦显微镜观察胶原凝胶中神经干细胞的生长、伸展情况；通用免疫细胞化学方法及荧光显微技术鉴定神经干细胞，BrdU染色标记增殖的细胞；采用CCK-8法及Live／DeadViability／CytotoxicityKit试剂盒检测神经干细胞不同培养条件下的生存和增殖能力，筛选出最佳的胶原工作浓度。结果：①倒置相差显微镜下观察发现胶原凝胶中的神经干细胞生长状态良好；

利用涡虫头部再生构建促再生药物筛选模型

为了能够有效地筛选促组织再生药物,建立一种促再生涡虫药物筛选模型。采用丹参注射液、天麻注射液、红花注射液、神经节苷脂钠注射液、N-N-二甲基乙酰胺等几种药物对日本三角涡虫头部的再生时间的影响作用,分析了日本三角涡虫头部再生对不同药物的差异性反应。结果显示同种药品在同一浓度下对不同日本三角涡虫个体的再生时间影响不显著(P>0.05),不同浓度下对日本三角涡虫的再生时间影响显著(P<0.05),不同药物之间对日本三角涡虫的再生时间的影响显著(P<0.05)。表明日本三角涡虫头部再生对不同药物反应灵敏,不同药物对涡虫头部再生有不同作用,可以作为神经再生药物筛选的一种生物模型。

基于tyrp1a转基因斑马鱼构建色素障碍性疾病药物筛选模型

为了能够有效地筛选治疗色素障碍性疾病药物,建立一种转基因斑马鱼药物筛选模型。采用斑马鱼酪氨酸酶相关蛋白1(tyrosinase-related protein 1a,tyrp1a)基因启动子驱动绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP),构建出tyrp1a转基因斑马鱼,使绿色荧光能够特异性表达在斑马鱼黑素细胞部位。分别给予斑马鱼促进黑素合成的药物N-苯基硫脲(Nphenylthiourea,PTU)和抑制黑素合成的药物黑素细胞刺激素(alpha-melnaocyte stimulating hormone,α-MSH),检测药物对斑马鱼黑素合成和绿色荧光蛋白表达影响。结果显示,PTU可以抑制斑马鱼黑素细胞黑素合成作用,并且降低转基因斑马鱼绿色荧光蛋白表达。α-MSH可以促进斑马鱼黑素细胞黑素合成作用,并促进转基因斑马鱼绿色荧光蛋白表达。本研究成功地建立了一种新的可以用于色素性障碍疾病药物筛选的转基因斑马鱼模型。

以受体为靶点的药物筛选模型的建立和应用

我国的新药研制工作面临着十分严峻的竞争和挑战。在创制新药的研究中寻找和发现具有生物活性的先导化合物是至关重要的环节之一，而对大量化合物进行活性筛选则是发现先导化合物的主要手段和途径。近年来，我们应用以受体为靶点的药物筛选模型筛选新药技术，已取得了一定的经验。所谓受体配体结合技术，就是利用从器官中分离出细胞膜受体或重组受体技术制备的受体作为筛选模型，利用受体和配体结合的高度特异性以及放射性核素测量的高灵敏度的特点，用放射性核素标记配体（＊L），在一定的条件下，使其与受体（R）结合，形成受体——配体复合物（R·＊L），通过测量R＊L的放射性，达到了解受体的结合活性的目的，使用这种技术测定标记配体的类似物和受体的亲和力，来比较一系列的化合物与受体结合的亲和力。由于受体配体结合分析操作快速，简便，药品用量少，可作为药物构效关系研究的工具。通过大量类似活性药物结构的化合物研究，不难总结出构效关系，明确定位出药物活性的分子部位，指导化学合成，研制安全有效的新型特异性药品提供可靠的评价手段。我们利用这种技术已建立了二十六种受体配体结合技术模型，并在这些模型上分别筛选到了有价值的亲和力大小和功能活性的新化合物参数，从而大大加快了先导化合物发现的进程。

猪组成型雄烷受体激动剂高通量药物筛选模型的建立

构建猪组成型雄烷受体（pgCAR）激动剂体外高通量筛选模型。利用RT—PCR技术从猪肝脏总RNA中扩增出pgCAR基因序列，

美国新开发的几种基因工程菌药物筛选模型介绍

综合现代生命科学各个领域的研究成果,以及已知药物构效关系和作用机制的知识,美国史克—比切姆制药公司SmithkIine—Beecham Pharmaceuticals)的研究开发部(R&D)建立了多种新药筛选模型。

构建抑制NF-κB信号通路的药物筛选模型

NF-κB已被证明在肿瘤和炎症过程中起到至关重要的作用。因此,建立抑制NF-κB信号通路的药物筛选模型至关重要。利用荧光素酶报告基因技术与蛋白印迹技术分别探索TNFα处理浓度及时间对NF-κB报告基因表达和NF-κB抑制亚单位IκBα降解的影响,进而构建NF-κB信号通路抑制剂药物筛选模型。实验结果表明,0.01 nmol/L TNFα作用24 h即能刺激HEK293T细胞中NF-κB报告基因较高水平的表达,且其表达量与TNFα的剂量和处理时间呈正相关性;0.01 nmol/L TNFα作用5 min即能使Panc-28细胞中IκBα明显降解,20min～30 min几乎降解完全,之后IκBα含量又开始增加。NF-κB阳性抑制剂藤黄酸验证表明NF-κB萤光素酶报告基因检测筛选体系和NF-κB抑制亚单位降解筛选体系两种体系稳定可行。结果证明,两种模型可以用于NF-κB信号通路抑制剂药物的筛选。

蛋白激酶为靶点的荧光可视化药物筛选模型的研究

蛋白激酶是调节人体生理功能的重要分子，其功能的异常可诱导许多疾病的发生。因此以调节、改善蛋白激酶活性及功能异常为靶点建立药物筛选模型，在创新药开发和研究方面有重要的意义。