肠炎沙门菌菌毛重组蛋白对其细胞黏附的竞争性阻断效应

鸡沙门菌通过其菌毛、鞭毛黏附宿主小肠上皮细胞是其致病过程不可或缺的重要环节。本研究旨在分析原核表达的菌毛重组蛋白FimA-sefA对肠炎沙门菌黏附小肠上皮细胞(IPEC-J2)竞争性阻断效应。将FimA、sefA基因片段克隆至pET28a(+),构建重组质粒pET28a-FimA-sefA,转化至菌株BL21(DE3)经镍柱亲和层析法(Ni-NTA)纯化获得重组蛋白FimA-sefA;利用间接免疫荧光法(IFA)、平板计数法分析肠炎沙门菌对IPEC-J2细胞的黏附。结果显示:表达的重组蛋白FimA-sefA分子量为36 ku;重组蛋白FimA-sefA、重组菌及肠炎沙门菌均能黏附IPEC-J2细胞;重组蛋白FimA-sefA及重组菌均能竞争性阻断肠炎沙门菌对IPEC-J2细胞的黏附,重组菌的阻断效应强于重组蛋白。因此,我们认为重组蛋白FimA-sefA能够在一定程度上竞争性阻断肠炎沙门菌对IPEC-J2细胞的黏附,为预防及减轻肠炎沙门菌感染策略提供了新的思路。

菌毛在生防细菌定殖植物病原线虫中功能的研究进展

植物病原线虫对林业生产危害严重,缺乏有效的防控措施,已造成巨大的经济损失。生防细菌已被用于林木病原线虫的绿色防控,并已取得良好的防治效果。然而,生防细菌防控林木线虫病害的作用机制尚不明确,严重阻碍了防线虫微生物制剂的研发与高效应用。目前,已有大量的研究结果证实,生防细菌在线虫上的定殖能力与其杀线防病效果密切相关,且细菌菌毛在生防细菌于线虫宿主的定殖过程中发挥着重要功能。本文综述了革兰氏阴性细菌菌毛的种类以及菌毛在生防细菌定殖线虫中的功能,讨论了生防细菌菌毛对运动性、黏附性、生物膜形成等定殖相关生物学性状的影响,并对菌毛在细菌防控林木线虫病害中功能的研究与应用进行了展望。

牙龈卟啉单胞菌菌毛的生物学特性及毒力

菌毛(Fim)是牙龈卟啉单胞菌的重要致病因子之一,对宿主细胞的黏附发挥着重要作用。Fim是细胞表面的丝状突起,增强了细胞对唾液蛋白、细胞外基质和真核细胞以及同类或其他种属细菌的黏附性并参与生物膜的形成。Fim A蛋白是牙龈卟啉单胞菌Fim的主要亚单位,与该菌侵入到牙周组织的上皮细胞及结缔组织内有关,而且还对牙槽骨具有一定的破坏作用。本文主要就Fim蛋白的生物学特性及其毒力等研究进展作一综述。

神经菌毛素1参与肝细胞癌侵袭及转移的研究进展

肝细胞癌是世界上极具侵袭性的实体恶性肿瘤之一,发病隐匿,早期易发生浸润和转移,导致多数患者确诊时已失去手术最佳时期。神经菌毛素1(NRP1)在肝细胞癌中发挥巨大的作用,其可促进血管生成、肿瘤生长以及肿瘤侵袭和转移,甚至介导免疫逃逸,值得注意的是,NRP1还可与微小RNA相互作用介导肝细胞癌的发生、发展。故进一步研究NRP1在肝细胞癌中的作用机制,使其未来能够作为肿瘤侵袭转移的诊断标志物以及新治疗靶点具有极其重要的意义。本文将从NRP1出发,对其与肝细胞癌之间的关系以及介导的肿瘤侵袭转移的潜在机制进行综述。

产肠毒素性大肠杆菌致病因子F_(41)、K_(99)菌毛基因的克隆与表达

目的为了分析原核表达的ETECF41和K99菌毛亚单位的抗原性和作为基因工程亚单位疫苗的可能性。方法针对黏附素F41和K99的编码序列,设计两对特异性引物,扩增F41和K99菌毛蛋白的编码基因,经序列测定后,克隆到原核表达载体pET-28a(+)上,转化E.coliBL21(DE3),筛选到可以表达F41和K99菌毛亚单位的菌株。经IPTG诱导表达后,进行SDS-PAGE和Western blot试验分析原核表达的F41和K99重组蛋白的抗原性。结果表达的F41和K99菌毛亚单位蛋白可以与抗F41和K99菌毛蛋白的单因子血清反应。结论原核表达的F41和K99重组蛋白具有良好的抗原性。

一株鸡大肠杆菌1型及P型菌毛蛋白结构基因的克隆

据国外发表的人致病性大肠杆菌 1型及P型菌毛蛋白结构基因 (pilA及papA)序列 ,设计并合成了分别位于PilA及papA保守区的 2对引物。经PCR从 1株带有甘露糖敏感血凝特性 (MSHA)及甘露糖抵抗血凝特性 (MRHA)的鸡致病性大肠杆菌 (HJ2 0e)染色体中扩增到大小分别在 6 5 7bp及 5 41bp的 2种阳性产物。通过核酸序列测定分别确证所扩增的DNA片段分别为pilA及papA基因。经酶切、连接、转化和筛选 。

纯化ETEC K88菌毛特异性卵黄抗体的加工贮藏及体外抗粘附性研究

分离、纯化产肠毒素大肠杆菌(ETEC) K88ac菌毛蛋白,将其免疫产蛋鸡,经喷雾干燥制备抗ETEC菌毛抗原特异性卵黄抗体粉。间接ELISA法检测卵黄抗体效价,试验结果表明,喷雾干燥(140℃进气,65℃出气)对卵黄抗体活性无影响,加工前后抗体滴度均为1∶1280;卵黄抗体粉在90℃干热条件下处理5min后抗体效价下降50%,而90℃湿热条件下处理5min抗体效价无明显变化,但处理15min后下降75%;经过1h的干热或湿热处理,抗体均基本失活;4℃和常温下放置半年对卵黄抗体粉活性无影响;体外抑制粘附试验表明,抗K88卵黄抗体能抑制K88对肠上皮细胞的粘附。

重庆两家三甲医院肺炎克雷伯菌菌毛变化分析

目的分析重庆两家三甲医院肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)菌毛变化及流行病学,以指导临床诊断及治疗。方法2007年7月至2008年7月共收集这两家医院检验科细菌室158株K.pneumoniae,用PCR方法和血凝实验/血凝抑制实验对其菌毛进行分型。结果145株K.pneumoniae产生Ⅲ型菌毛,7株产生Ⅰ型菌毛,其中2株两种菌毛都产生,还有6株不产生菌毛。结论这两家医院主要感染的是产生Ⅲ型菌毛的K.pneumoniae,而且主要是引起呼吸道感染,这对于临床寻求针对Ⅲ型菌毛K.pneumoniae感染的抗生素替代疗法具有指导意义。

ETEC K99、K88菌毛蛋白抗原表位多肽的设计合成及免疫反应

目的:通过生物信息学及蛋白分析软件等,寻找ETEC K88、K99菌毛蛋白的抗原表位。方法:通过生物信息学技术、DNAStar Protean蛋白分析软件及网络共享软件对ETEC K88、K99菌毛蛋白抗原性相关的参数进行预测分析,从而设计ETEC K88、K99菌毛蛋白的抗原表位多肽;采用腹腔注射的方式将合成的抗原表位多肽免疫小鼠,用ELISA法检测血清中产生的抗体,并对免疫小鼠进行了攻毒试验。结果:多肽免疫小鼠后均能诱导抗体产生,攻毒试验表明合成肽对小鼠具有保护作用。结论:成功预测了抗原表位,合成的表位多肽具有较好的抗原性。

3株致病性鸡大肠杆菌P型菌毛结构基因的克隆、序列测定及同源性分析

用鸡致病性大肠杆菌分离株O1、O2和O78的基因组DNA做为模板,PCR分别扩增出了0.55kb的P型菌毛结构基因(papA)。将扩增得到的3个papA基因片段分别克隆进pGEM-T○R载体中,转化至受体菌JM109中,用Amp/IPTG/X-gal琼脂平板蓝白菌落筛选法,得到含阳性重组子的菌株,提取质粒后用BamH和Sal双酶切进行鉴定。所得阳性重组子进行DNA序列测定,测序结果经DNAStar核酸分析软件包分析比较,结果表明,所构建的克隆质粒中均含有相应完整papA基因,其开放式阅读框架大小为549bp,编码182个氨基酸。此3株菌的P型菌毛结构基因的同源性为98.9%～100%,其中O1株和O78株的P型菌毛基因的ORF序列100%相同,O2株有2个碱基与前两者不同。

大肠埃希氏菌表面菌毛黏附因子多价菌毛疫苗的研制

为了预防仔猪黄痢,选取ETEC野生分离菌株HN2001(K88ab)、HN2002(K88ac)、HN2003(K88ad)、HN2004(K99)、HN2005(987p)、HN2006(F41)培养后用低温磁力搅拌法提取到菌毛,制成5批多价菌毛混合油乳剂灭活苗,实验室试验结果表明,5批多价灭活疫苗对小白鼠的平均保护率达95.0%,为进一步进行田间试验提供了理论依据,并将为生产上防治仔猪黄痢提供一种保护范围更加全面的生物制品。

尿路致病性大肠埃希菌1型菌毛、P型菌毛黏附能力与药敏情况之间的关系

目的研究尿路致病性大肠埃希菌(UPEC)1型菌毛、P型菌毛的黏附情况及抗菌药物的药敏情况,分析二者的相互关系,为UPEC的治疗和预防提供新思路。方法收集UPEC菌株,采用梅里埃公司VitekⅡ进行细菌鉴定与13种常见抗菌药物的药敏试验,通过1型菌毛与酵母细胞的黏附实验、P型菌毛与人红细胞的黏附实验,分别检测1型菌毛、P型菌毛的黏附情况,比较两种菌毛黏附特性与药敏之间的关系。结果根据两种菌毛的黏附特性分为四组(1型阳性P型阳性组、1型阳性P型阴性组、1型阴性P型阳性组、1型阴性P型阴性组),比较各组间的药敏差异,结果显示头孢呋辛(χ^2=16.42,P=0.001)在1型阴性P型阳性组耐药率低于其他组。分析单种菌毛黏附特性与药敏的关系,结果显示头孢呋辛(χ^2=6.01,P=0.014)在1型菌毛黏附阳性组的耐药率高于阴性组。对药敏情况与两种菌毛黏附特性进行相关性分析时发现,1型菌毛黏附阳性菌株相较于阴性菌株,头孢西丁、哌拉西林/三唑巴坦的耐药率降低,头孢呋辛的耐药率增加,P型菌毛黏附阳性菌株相较于阴性菌株,头孢呋辛的耐药率降低。结论通过比较UPEC 1型菌毛、P型菌毛黏附与药敏的关系,在临床治疗UPEC所致尿路系统感染时,为抗菌药物的选择提供了新的方向。

鸡大肠杆菌(O_(50))菌毛抗原气雾免疫和菌毛油乳苗皮下免疫效果比较研究

比较了鸡大肠杆菌 (O50 )菌毛抗原液气雾免疫与菌毛油乳苗皮下免疫的效果。油乳剂疫苗皮下免疫与菌毛液气雾免疫攻毒后的发病率分别是 1 3.33%和 2 0 %,病变差异不显著 (P >0 .0 5 ) ,而阳性对照组攻毒发病率为 80 %,病变差异显著。结果表明 ,鸡大肠杆菌菌毛液气雾免疫与菌毛油乳剂疫苗皮下注射免疫效果接近。

共表达ETECK99、K88菌毛蛋白重组干酪乳杆菌的构建

将PCR扩增的K99和K88-LTB基因片段串联插入到干酪乳杆菌细胞表面表达载体pLA中,构建了重组表达载体pLA-K99-K88-LTB,将其电转化干酪乳杆菌CICC 6 105,获得了表达融合蛋白pLA-K99-K88-LTB的重组干酪乳杆菌表达系统。重组干酪乳杆菌在MRS培养基中表达后,经SDS-PAGE检测,约有90 KDa的融合蛋白得到表达,蛋白大小与理论值相符合。Western-blot分析表明表达的蛋白可被鼠源K99,K88抗血清所识别。间接免疫荧光技术和流式细胞术的结果表明,融合蛋白成功地利用多聚谷氨酸跨膜蛋白pgsA基因展示在干酪乳杆菌菌体表面。

仔猪腹泻源大肠杆菌贵州株K_(88)菌毛研究

通过玻片凝集试验、抗D_甘露糖微量血凝试验 (MRMH)、离体细胞粘附试验、菌体蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS_PAGE)和免疫印迹、质粒DNA提取及电泳等 ,分析了仔猪腹泻源大肠杆菌贵州株 (4 0 9_11)所产K88菌毛的血凝谱、对肠上皮细胞粘附特性、菌毛蛋白亚单位分子量 ,并对其K88基因进行了初步定位。结果表明 :其所产K88菌毛的血凝谱能凝集豚鼠和鸡红细胞 ;能介导细菌粘附于仔猪离体肠上皮细胞 ,这种粘附作用能被特异的K88抗血清阻断 ;菌毛蛋白亚单位的分子量为2 35 0 0Da;K88基因位于一个分子量为 85kb(5 4× 10 6Da)的大质粒上。当菌株于 18℃生长时 。

禽病原性大肠杆菌Ⅰ型菌毛单克隆抗体的研制及其对分离株的检测

从禽病原性大肠杆菌分离株 TK3 ( O1 )提取 型菌毛免疫 BALB/c小鼠 ,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合 ,获得 4株能稳定分泌针对 型菌毛的单克隆抗体杂交瘤细胞株 ,分别命名为 a B6 、b G5 、c F3和 c G3。单抗阻断甘露糖敏感血凝试验、免疫胶体金和 Western blot试验证明 ,单抗是 型菌毛特异的。这些单抗培养上清及腹水的 ELISA效价为分别为 1 0 - 2～ 1 0 - 3和 1 0 - 5～ 1 0 - 6 ;腹水的平板凝集价为 1∶ 1 2 8～ 1∶ 2 56。上述4株单抗对 77株带 型菌毛的禽病原性大肠杆菌优势血清型分离株进行了检测 :O1 8分离株阳性率为72 %,O78分离株阳性率为 1 7%,O2分离株阳性率为 3 3 %,O88分离株阳性率 89%,O1 1分离株阳性率为60 %,O2 6分离株阳性率为 3 3 %。表明研制的 型菌毛单抗能检出大多数 O1 8、O88、O1 1分离株的 型菌毛 ,而对 O78、O2、O2

禽病原性大肠杆菌1型菌毛的分离与鉴定

以旋涡混合法使禽病原性大肠杆菌分离株５６６ 、１７９４ 和ＴＫ３ 菌毛脱落，经硫酸铵沉淀、透析后进行蔗糖密度梯度离心，收集密度为１１０ 至１１５ｇ／ｃｍ３ 的蛋白带，经ＳＤＳＰＡＧＥ测定，３ 株菌菌毛蛋白的分子量分别在１７５ 、１７０ 和１７０ｋＤ；提纯菌毛保留了甘露糖敏感性凝集豚鼠红细胞的能力，证明它们为１ 型菌毛；从１７９４ 株提取的１ 型菌毛免疫ＢＡＬＢ／Ｃ 小鼠产生的高免血清在Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ 中与３ 个菌株的相应菌毛蛋白均呈阳性反应。上述结果表明，受检的３ 株禽病原性大肠杆菌均表达了１ 型菌毛，其分子量在１７５ ～１７０ｋＤ 之间，３ 个菌株的１

大肠杆菌F18菌毛FedE蛋白的表达与鉴定

根据已经发表的F18菌毛E亚单位的基因序列(fedE)设计1对引物,利用PCR技术从重组质粒TF107E中扩增到一段序列,并按预定的阅读框架插入到表达性质粒载体pGEX-6p-1中的谷胱苷肽转移酶(GST)基因的下游,获得重组质粒pPFedE,并转化大肠杆菌BL21获得重组菌PPFedE。琼脂糖凝胶电泳、序列测定及分析表明:该序列大小为459bp,与GENEBANK中的FedE结构编码序列(Z26520)完全一致。通过对菌体裂解物的SDS-PAGE电泳分析以及Westernblotting鉴定,证明重组大肠杆菌PPFedE的可以表达融合蛋白形式的FedE(命名为GST-FedE),即FedE蛋白(16.297ku)与谷胱苷肽转移酶(27.335ku)相连组成分子量为43.632ku的融合蛋白。

F107(F18_(ab))菌毛单抗的制备、鉴定与初步应用

将大肠杆菌 10 7/ 86和水肿病菌株在TSB中培养 ,鉴定其表达F10 7菌毛 ,前者作为免疫原免疫BABL/C小鼠 ,后者作为检测抗原包装酶标板。细胞融合后经ELISA和玻板凝集检测 ,得到一株阳性杂交瘤细胞株 ,命名为F7_1。该细胞株制备的腹水ELISA效价为 :2 16,试管凝集价为 :1∶5 12 0 ,在免疫印迹中可与提取的F10 7菌毛特异性条带发生反应。利用此单抗检测表明 ,91%的水肿病菌株表达F10