葡萄球菌蛋白A活性机制与现代应用

葡萄球菌蛋白A(staphylococcus protein A,SPA)是金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)细胞壁上的一种黏连蛋白。经过几十年的研究,由于其对免疫球蛋白IgG的亲和特性,SPA已作为一种工具在抗体的检测、纯化以及疾病诊断中得到了广泛应用。SPA衍生物的构建适应了现代生产的需要,改造后的SPA可以与多种报告分子相偶联,使得免疫诊断更加快速准确。本文综述了SPA基于其免疫学特性,在抗体纯化和现代免疫分析应用中的发展状况及前景。

葡萄球菌蛋白A免疫吸附治疗全身型重症肌无力的临床研究

目的研究葡萄球菌蛋白A免疫吸附治疗全身型重症肌无力(myasthenia gravis,MG)的疗效和安全性。方法采用蛋白A免疫吸附治疗19例成人全身型MG并进行临床疗效和安全性的判定。结果所有入选病人均完成2次免疫吸附治疗;第2次治疗后的IgG、IgA、IgM浓度明显下降(P<0.0001);Osserman分级、改良美国MG基金会(MGFA)评分、MG日常生活量表(ADL)和徒手肌力量表(MMT)均明显改善(P<0.0001)。MG特异性乙酰胆碱受体(AChR)抗体阳性的患者2次治疗后抗体滴度明显下降;治疗后外周血调节性T细胞百分比明显上升。部分病人有轻度不良反应,但总体耐受性良好,各项安全性临床评定指标在治疗前后的变化均无统计学意义。结论葡萄球菌蛋白A免疫吸附可以迅速改善全身型MG病人的病情。

葡萄球菌蛋白A抗体结合区基因的克隆、表达和纯化

目的构建表达金黄色葡萄球菌A蛋白(SPA)抗体结合区基因SPA-ZZ的pET-32a-ZZ表达载体,在大肠杆菌BL21中进行高效表达并初步纯化。方法用PCR从pEZZ18中克隆SPA抗体结合区基因ZZ,构建重组表达质粒pET32-ZZ,经酶切和测序确认,将阳性重组质粒转化BL21感受态细菌,IPTG诱导表达,表达产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测(SDS-PAGE),并用Q-Sephrose Fast Flow柱进行初步纯化。结果得到了高效表达SPA-ZZ的pET32-ZZ表达载体,表达产物经SDS-PAGE检测相对分子质量为41 000,初步纯化后可得到较纯的表达蛋白。结论SPA抗体结合区蛋白ZZ能在大肠杆菌中高效表达,为SPA-ZZ的应用奠定了一定的基础。

葡萄球菌蛋白A吸附治疗对群体反应性抗体水平的影响

目的 研究葡萄球菌蛋白A(StaphylococcalProteinA .SPA)吸附治疗对群体反应性抗体 (PRA)水平的影响。方法 采用SPA吸附系统对 32例等待肾移植的致敏受者进行体外吸附实验、体内吸附实验和临床移植观察。结果 ①单次SPA吸附治疗可处理循环血浆 4 5 0～ 6 0 0ml;其饱和吸附的IgG量为 (3.98±0 .5 1)g ;实验终点饱和吸附的IgG量 (M1)为 (19.5 4± 3.13)g/L ,吸附后血浆IgG(M2 )水平降低 5 1.2 % ;②本组体内吸附实验前 ,PRA为 98%～ 5 1%者 5例 ,PRA为 5 0 %～ 4 0 %者 15例 ,PRA为 39%～ 2 5 %者 12例。每次SPA吸附治疗的循环血浆量为 70 0 0～ 90 0 0ml。本组经 (6 .70± 3.11)次SPA吸附治疗后 ,2 9例 (占90 .6 2 % )PRA降至 <12 % ;③ 2 7例 (83.37% )顺利地接受肾移植手术。术后未发生超急或急性排斥反应 ,肾功能均得以恢复。结论 SPA吸附治疗可降低致敏患者体内预存的PRA水平。SPA吸附治疗辅以配型良好的肾脏及新型免疫抑制剂 ,对预防和减轻肾移植后排斥反应疗效确切。

聚苯乙烯肽亲合标签和葡萄球菌蛋白A免疫球蛋白Fc结合区融合蛋白的克隆表达与应用

目的应用生物工程技术克隆、表达聚苯乙烯肽(PS)亲和标签(PStag)和葡萄球菌蛋白A(SPA)免疫球蛋白(IgG)-Fc结合区(ZZ)融合蛋白,在大肠埃希菌BL21中进行高效表达并初步纯化,为优化、提升免疫检测方法奠定基础。方法应用基因合成技术串联SPA-ZZ结构域和PStag基因,构建重组表达质粒pPS-SPA,经酶切和测序确认,将阳性重组质粒转化BL21感受态细菌,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫转印试验(Western blot)鉴定表达和纯化产物;直接酶联免疫吸附试验(ELISA)验证融合表达产物对亲水ELISA板的表面吸附特性和定向结合兔、鼠IgG-Fc区的效果。结果在合成基因的基础上构建的表达载体经序列分析与限制性酶切证实了串联基因的正确克隆,PAGE结果表明可诱导高表达PStag-SPA,纯化产物对亲水ELISA板的吸附能力较高,表达产物对兔与鼠IgG具有定向吸附能力。结论重组表达的PStag-SPA具有对ELISA板的黏着能力和定向结合兔、鼠IgG-Fc的应用潜力,为优化酶免疫检测技术提供了技术支持。

金黄色葡萄球菌蛋白A基因的克隆

[目的]获得SPA蛋白的IgG结合结构域的基因克隆。[方法]采用优化的CTAB法提取金黄色葡萄球菌基因组DNA,通过PCR扩增获得SPA基因。[结果]金黄色葡萄球菌基因组DNA的纯度较高,完整性好,扩增获得了SPA基因。[结论]改进的CTAB法适用于金黄色葡萄球菌DNA的提取,且成功地获得了SPA基因。为进一步构建SPA非融合表达奠定了基础。

高敏肾移植受者行葡萄球菌蛋白A免疫吸附治疗的护理体会

目的对比术前受者群体反应抗体(PRA)高的患者经过葡萄球菌蛋白A免疫吸附治疗(PAIA)后行肾脏移植后感染和排斥反应的发生率及总结护理体会。方法对于PRA不同程度增高的患者采取PAIA治疗后再行肾脏移植,观察感染和排斥反应的发生率,术前术后进行各项护理措施及整体护理观念的实施。结果 PRA高的患者经过PAIA治疗后行肾脏移植,经过精心细致的整体护理,高敏受者得到很好的护理,取得满意的临床效果。

葡萄球菌蛋白A的纯化新工艺

目的建立一种高效、简便、实用的分离纯化葡萄球菌蛋白A(SPA)的工艺。方法采用超声波破菌和IgG-Sepharose4B亲和层析分离纯化SPA;以Lowry法检测蛋白含量;双向琼脂免疫扩散法测定效价和特异性;用还原和非还原SDS-PAGE法检测纯度和相对分子质量。结果此法制得的3批SPA的蛋白含量分别为4·7、4·4和5·4mg/ml,收率分别为2·70、2·64和3·78g/100g湿菌。对人IgG的免疫双扩散效价均为1:64;与正常人、豚鼠、家兔和小鼠的血清反应均出现一条沉淀线,而与鸡和羊不出现沉淀线。经非还原SDS-PAGE检测只呈现一条蛋白带,相对分子质量约为160000～180000;经还原SDS-PAGE检测呈现两条蛋白带,相对分子质量分别约为67000和34000。结论已成功建立了分离纯化SPA的新工艺。

金黄色葡萄球菌蛋白A单克隆抗体的制备

为获得稳定性好、特异性强、效价较高的抗金黄色葡萄球菌蛋白A单克隆抗体,用热灭活的金黄色葡萄球菌wol-04菌体抗原免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)融合,以金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA)为筛选抗原进行克隆筛选,并对各株单抗的生物学特性进行分析和鉴定.结果表明:试验获得了3株稳定分泌SPA单克隆抗体的杂交瘤细胞,其中单克隆抗体3B11、4F7为SPA表面抗原表位的单克隆抗体,与金黄色葡萄球菌wol-04菌体和SPA有较强的免疫反应性,免疫球蛋白亚类分别为IgG1和IgG3,具有稳定性好、特异性强、效价较高的特点.

金黄色葡萄球菌蛋白A的提取、纯化及鉴定

为了获得纯度高、活性好的金黄色葡萄球菌蛋白A（SPA）,取改良营养肉汤培养基上生长18h的金黄色葡萄球菌培养物,采用溶菌酶裂解细胞壁释放蛋白质,用磷酸盐缓冲溶液（PBS）溶解后转入透析袋透析,透析物用小鼠IgG-sephrose4FF亲和层析柱纯化,采用二喹啉甲酸（BCA）法测蛋白质浓度。结果表明：SPA浓度为0.933mg/mL;聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）结果在42ku处有明显的电泳条带,蛋白免疫印迹（Western-blot）进一步证实小鼠IgG与SPA在42ku处发生较强的反应;以SPA为抗原,提纯的小鼠IgG为样品进行酶联免疫吸附试验（ELISA）检测,结果小鼠IgG稀释到1∶25600时仍能与SPA结合,说明提取的SPA活性较高。

葡萄球菌蛋白A免疫吸附治疗难治性系统性红斑狼疮的短期疗效观察

目的探讨葡萄球菌蛋白A免疫吸附治疗难治性系统性红斑狼疮(SLE)的短期疗效及安全性。方法选取难治性SLE的患者25例,进行葡萄球菌蛋白A免疫吸附治疗,比较治疗前后相关实验室指标、疾病活动度评分等变化,以及不良反应情况。结果治疗后24 h尿蛋白定量、肌酐(Scr)、血沉、C反应蛋白(CRP)、免疫球蛋白G(IgG)、抗双链DNA抗体(dsDNA)定量均较治疗前明显下降,而补体C3、补体C4、白细胞、血红蛋白、血小板均较治疗前明显升高(P<0.05)。有3例患者抗核抗体(ANA)治疗后转阴,阴转率12%。治疗前后SLE活动性测定评分(SLEDAI)差异有统计学意义(P<0.05)。1例患者治疗过程中出现头晕恶心不适。结论葡萄球菌蛋白A免疫吸附治疗难治性SLE的短期疗效佳,不良反应少。

葡萄球菌蛋白A胶体金分子结构特点及作为原子力显微术标记物的可行性

目的分析葡萄球菌蛋白A胶体金（SPA-CG）分子的特征性构象特点，探讨其作为原子力显微镜观测原位标记物的可行性。方法应用原子力显微镜扫描生理状态下分布在云母表面的葡萄球菌蛋白A胶体金分子，并进行结构分析及理论计算。结果极少数平卧的SPA-CG呈中部球形隆起，两端长短不一的弯曲棒状肽链环抱球形隆起的独特结构，形成反“C”字形结构，球形隆起直径为单个胶体金直径的3～4倍；极少数SPA-CG呈逗号样；绝大多数SPA-CG呈一侧面稍凹的椭球形结构，结构稳定、均一，长径为（40．88±1．58）nm，宽径为（20．82±0．68）n，高度（Z轴）为（10．51±0．28）nm。结论单个胶体金标记的葡萄球菌蛋白A分子具有独特、稳定、均一的特征性构象，可作为原子力显微术观测的原位标记物。

量子点的制备及其与葡萄球菌蛋白A偶联条件的优化

目的:制备量子点与葡萄球菌蛋白A(Staphylococcal protein A,SPA)的偶联物,探究偶联反应的最佳条件。方法:采用“经典注入法”制备碲化镉量子点,使用1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)作为偶联剂用于偶联量子点和SPA,采用单因素考察法,分别探究EDC、NHS和SPA用量以及反应时间对偶联效率的影响。结果:制备得到不同量子点、EDC、NHS、SPA比例以及不同反应时间的偶联物,其中量子点和EDC的比例为1∶1500,EDC和NHS的比例为1∶2,反应时间为2 h时偶联物荧光强度最强。结论:碲化镉量子点∶EDC∶NHS为1∶1500∶3000,反应时间为2 h时,可以制备出荧光强度较好的量子点SPA偶联物。

烧伤科分离MRSA菌株的耐药特征和葡萄球菌蛋白A基因分型

目的研究我院烧伤科2010年4～6月分离的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)菌株耐药性及分子流行病学特点,找出流行菌株,为指导临床经验用药提供参考。方法采用纸片扩散法(K-B法)及葡萄球菌A蛋白基因(spa)分型技术对分离的24株MRSA进行药物敏感性试验和同源性分析。结果分离的菌株对青霉素、苯唑西林、阿莫西林/克拉维酸、亚胺培南、美罗培南全部耐药,其余抗菌药物除万古霉素外耐药率均在50%以上,未发现万古霉素耐药株。spa基因分型发现3个spa型,t030型共22株,t3226和t632型各1株,提示分离菌株具有高度的同源性。结论我院烧伤科MRSA菌株具有多重耐药的特征,spa t030型菌株是其主要型别。

金黄色葡萄球菌蛋白A在大肠杆菌中的自诱导表达以及单克隆抗体的制备

利用大肠杆菌表达金黄色葡萄球菌蛋白A,根据大肠杆菌密码子偏好性对金黄色葡萄球菌蛋白(SPA)基因进行密码子优化。SPA基因插入p ET28a表达载体中,利用自诱导培养基诱导SPA表达,表达量达8.2 mg/L。通过Ni亲和层析纯化SPA蛋白,纯度达到95%。纯化的SPA蛋白免疫小鼠制备单克隆抗体,间接ELISA法检测抗体效价,抗体效价可达1∶40000,采用Protein G亲和层析纯化SPA单抗,纯度达98%。纯化后的SPA单抗检测与食品中常见的致病菌无交叉反应。结果显示,SPA单抗特异性良好,与其他致病菌无交叉反应。

金黄色葡萄球菌蛋白A串联Z结构域的表达、纯化及其亲和填料制备

目的构建金黄色葡萄球菌蛋白A(Staphylococcal Protein A,简称SPA或蛋白A),串联Z结构域的重组表达克隆,并实现在大肠杆菌中诱导表达,随后纯化获得重组蛋白,制备亲和填料.方法对目的基因进行元和表达的密码子优化,利用PCR扩增方法获得SPA的3个串联Z结构域,并在蛋白的N端加入组氨酸标签.将优化后的基因序列克隆到p ET43.1a(+)表达载体上,获得p ET43.1a(+)-SPA-3Z重组质粒;测序正确的重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3),IPTG诱导表达,通过亲和层析方法纯化表达的重组蛋白,并使用SDS-PAGE鉴定表达蛋白.将纯化获得的SPA纯品偶联到经环氧氯丙烷活化的Sepharose 6B Fast Flow凝胶上.使用兔多抗和腹水单抗对填料进行验证.结果成功构建p ET43.1a(+)-SPA-3Z克隆,纯化的SPA蛋白纯度高.成功将重组SPA偶联到经环氧氯丙烷活化的Sepharose 6B Fast Flow凝胶上.制备的填料在0.1mol/L的Na OH溶液里浸泡30小时,填料亲和性能未见明显变化,这为填料的长期使用提供了可能.将该填料用于抗体纯化,湿胶的多抗结合量可达22.7mg/ml,纯化的腹水单抗纯度在98%以上.结论本研究为SPA的大规模制备提供了基础.

外周血指标对鼻息肉患者黏膜中IL-5和金黄色葡萄球菌肠毒素特异性免疫球蛋白E阳性表达的预测价值

目的借助外周血指标预测慢性鼻窦炎伴鼻息肉(CRSwNP)2型生物标志物。方法收集2020年6月~2022年5月在北京同仁医院鼻科住院的CRSwNP患者临床资料,检测外周血中嗜酸粒细胞百分比(Eos%)、Eos计数、骨膜蛋白和总IgE以及CRSwNP黏膜中白细胞介素5(IL-5)和金黄色葡萄球菌肠毒素特异性免疫球蛋白E(Staphylococcus aureus enterotoxinimmunoglobulin E,SE-IgE)。应用受试者工作特征(ROC)曲线评估每个外周血指标对黏膜IL-5/SE-IgE阳性表达预测价值,利用Logistic回归筛选对黏膜IL-5/SE-IgE阳性有预测价值的外周血指标,构建诺模图模型。结果CRSwNP患者哮喘比例、血中Eos%、骨膜蛋白和总IgE在IL-5/SE-IgE阳性和阴性两组之间,均具有统计学差异。ROC曲线单因素分析显示血Eos%、Eos计数、骨膜蛋白和总IgE对黏膜IL-5和SE-IgE阳性预测的AUC分别波动在0.655~0.784和0.721~0.802,Logistic回归确认血中Eos%、总IgE和血中骨膜蛋白、总IgE可分别作为IL-5和SE-IgE阳性的独立预测因素。构建预测CRSwNP黏膜IL-5/SE-IgE阳性的诺模图模型,一致性指数(C-index)为0.804和0.81,提示具有很好的预测准确性。结论血中Eos%、总IgE和血中骨膜蛋白、总IgE分别构建的诺模图,对CRSwNP黏膜IL-5和SE-IgE阳性表达具有很好的预测价值,可以预判CRSwNP内型和表型严重性。

金黄色葡萄球菌蛋白A的原核表达及生物亲和特性研究

目的构建金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA)基因片段的表达载体,并在大肠杆菌表达系统中进行表达,探讨该重组蛋白与不同来源IgG结合的生物学特性。方法利用PCR法扩增SPA基因片段,将该段基因克隆到pET30a(+)表达载体,转化感受态BL21大肠杆菌细胞,IPTG诱导表达,利用SDS-PAGE及Westen-blot鉴定目的蛋白。His亲和层析纯化后分别与人、小鼠、兔、猪及山羊血清反应,分析其与不同来源IgG的亲和关系。结果构建的pET30a(+)-SPA表达载体在大肠杆菌BL21中可表达SPA蛋白,且发现其与人及小鼠源IgG具有较高亲和性,与兔及猪源IgG亲和性较低。结论该重组蛋白SPA与人及小鼠源免疫球蛋白IgG具有较高亲和性,为下一步应用于SPA-ELISA打下基础。

葡萄球菌核酸酶样结构蛋白1/SLC7A11抑制铁死亡对骨肉瘤发生发展的影响

目的探讨葡萄球菌核酸酶样结构蛋白1(SND1)对骨肉瘤细胞生物学功能的影响,及其通过SLC7A11调控骨肉瘤细胞铁死亡的作用机制。方法检测人成骨细胞hFOB1.19以及骨肉瘤细胞系Saos-2、U2OS、HOS和143B中SND1的表达水平。采用小干扰RNA敲减骨肉瘤细胞HOS和143B中SND1的表达(si-SND1),采用CCK8法、细胞克隆形成实验、细胞迁移和侵袭实验探究SND1的表达对骨肉瘤细胞生物学功能的影响;调控骨肉瘤细胞中SND1以及SLC7A11基因的表达,探究SND1通过SLC7A1基因对骨肉瘤铁死亡介导的肿瘤细胞凋亡的影响。结果骨肉瘤细胞Saos-2、U2OS、HOS和143B中SND1 mRNA和蛋白的表达水平显著高于人成骨细胞hFOB1.19(P均<0.01)。与对照组比较,si-SND1转染显著降低HOS和143B细胞中SND1的表达水平(P均<0.01),且细胞活性显著降低,克隆形成数量显著减少,细胞迁移和侵袭能力显著降低(P均<0.001)。铁死亡诱导剂Erastin促进骨肉瘤HOS和143B细胞凋亡,而抑制剂Ferrostatin-1刺激上调细胞活性(P均<0.001)。敲减SND-1后使用Erastin可进一步降低骨肉瘤HOS和143B细胞活性,而使用Ferrostatin-1刺激后可显著恢复细胞活性(P均<0.001);Erastin处理后,si-SND1组细胞中铁离子和丙二醛表达增高,谷胱甘肽表达降低(P均<0.001)。体内实验结果显示,敲减SND1可以明显抑制143B裸鼠移植瘤的瘤体质量(P<0.001)。敲减SND1后骨肉瘤HOS和143B细胞中SLC7A11的表达水平显著减少(P均<0.001),且铁死亡水平升高(P<0.001,P=0.020)。结论骨肉瘤细胞中SND1表达显著增高,其可能通过上调SLC7A11的表达抑制铁死亡,进而促进骨肉瘤细胞活性。