葡萄糖调节蛋白75在糖尿病肾病发生、发展机制中的作用研究进展

糖尿病肾病(DN)是引起终末期肾功能衰竭的主要病因之一,且会显著增加心脑血管疾病的发病率和病死率~([1])。根据国际糖尿病联合会预测,到2045年全世界糖尿病患者人数将达到7亿人,其中30%~40%患者将发展为DN~([2])。

银杏叶提取物对帕金森患者血清黑质DMT1、葡萄糖调节蛋白75及神经功能的影响研究

目的探讨银杏叶提取物对帕金森患者血清黑质二价金属离子转运蛋白(divalent metal transporter1,DMT1)、葡萄糖调节蛋白75(glucose regulated protein 75,grp75)及神经功能的影响。方法帕金森患者38例,根据用药不同分为对照组和实验组,每组各19例,对照组患者给予多巴丝肼片,实验组在对照组的基础上给予银杏叶提取物片,治疗连续4周。治疗结束后,对所有患者黑质DMT1、grp75及认知功能进行检测。结果与治疗前相比,治疗后2组患者的黑质DMT1水平较低(P<0.05);与对照组相比,实验组患者治疗后黑质DMT1水平较低(P<0.05)。与治疗前相比,治疗后2组患者的grp75水平较高(P<0.05),与对照组相比,实验组患者治疗后grp75水平较高(P<0.05)。与治疗前相比,治疗后2组患者的Mo CA评分较高(P<0.05),HAMD评分较低(P<0.05);与对照组相比,实验组患者治疗后Mo CA评分较高(P<0.05),HAMD评分较低(P<0.05)。结论银杏叶提取物能够显著降低帕金森患者黑质DMT1水平,升高grp75水平,改善认知功能。

葡萄糖调节蛋白75的表达特性

目的 研究不同条件下葡萄糖调节蛋白 75基因的表达情况。方法 用多组织尼龙膜 (multipletissuenylon ,MTN)Northern杂交显示 grp75在组织中的表达情况 ,用Northern杂交方法研究其在缺糖、氧化磷酸化阻滞剂叠氮钠、Ca2 + 增强剂A2 3187处理后的表达情况。结果 grp75在多组织中都有表达 ,且表达量大致相同 ,在缺糖培养的情况下 ,细胞的 grp75基因明显呈上调表达。高浓度的叠氮钠能够使grp75基因表达大幅度上调 ,A2 3187使grp75的表达量增加。 结论 grp75基因在细胞中有构成性表达 ,能够在多种组织的细胞中发挥作用 ,grp75基因的表达量和细胞自身的能量代谢有关 ,为 grp75基因对细胞缺糖保护提供了证据 ;在grp75表达与调控过程中 ,Ca2 +

葡萄糖调节蛋白75对缺糖诱导的凋亡相关基因Bax和NF-κB改变的影响

目的通过已获得稳定表达葡萄糖调节蛋白（Grp75）的PC12细胞株,检测Grp75对缺糖诱导的细胞凋亡过程中Bax和NF-κB的影响。方法Grp75过表达组和对照组细胞无糖培养6h、12h2、4h和48h后,进行相关的实验。免疫印迹法检测缺糖状态下两组细胞中Grp75的表达水平和NF-κB的活性;应用半定量RT-PCR和免疫印迹法比较Bax表达水平的变化;免疫细胞化学通过构象特异性的Bax 6A7抗体检测Bax的活化。结果Bax活化和NF-κB活性的下降在缺糖诱导的PC12细胞凋亡过程中发挥了重要的作用。而Grp75通过阻止Bax的活化和NF-κB活性的下降抑制缺糖诱导的凋亡。缺糖状态下Grp75过表达组和对照组细胞中Bax表达水平均未发生改变。结论Bax活化和NF-κB活性下降与缺糖诱导的PC12细胞凋亡关系密切,Grp75通过阻止Bax的活化和维持NF-κB的活性保护PC12细胞。

沉默葡萄糖调节蛋白75对人肝癌细胞HCCLM3增殖和凋亡的影响

目的探讨沉默葡萄糖调节蛋白75(GRP75)表达对人肝癌细胞HCCLM3增殖和凋亡的影响。方法体外培养人肝癌细胞HCCLM3,随机分为对照组、siRNA-1组、siRNA-2组,采用脂质体转染法将siRNA导入siRNA-1组(上游序列5'-GAGACGGUUUCCAAAUGAATT-3',下游序列5'-UUCAUUUGGAAACCGUCUCTT-3')、siRNA-2组(上游序列5'-GCUCUAAGGCUUCCAACCUTT-3',下游序列5'-AGGUUGGAAGCCUUAGAGCTT-3'),对照组不予干扰序列。采用Western blotting法检测各组GRP75表达,采用CCK-8法检测各组转染2、24、48、96 h细胞增殖情况,采用流式细胞术检测各组细胞凋亡情况。结果与对照组比较,siRNA-1组、siRNA-2组GRP75表达明显降低(P均<0.01),以siRNA-2组降低更明显(P<0.05)。与对照组比较,siRNA-1组、siRNA-2组各时点细胞增殖能力均降低(P均<0.01),且以siRNA-2组降低更明显(P<0.01);与对照组比较,siRNA-1组、siRNA-2组细胞凋亡率均明显升高(P均<0.01),且siRNA-2组升高更明显(P<0.01)。结论沉默GRP75表达可抑制人肝癌细胞HCCLM3增殖活性,并促进其凋亡。

葡萄糖调节蛋白75基因对H_2O_2诱导的C6胶质瘤细胞氧化应激性损伤有保护作用

目的:研究葡萄糖调节蛋白75(grp75)基因对H2O2诱导的C6胶质瘤细胞氧化应激性损伤的保护作用。方法:以grp75基因瞬时转染C6胶质瘤细胞,以H2O2作为氧化应激刺激物,建立细胞损伤模型,运用MTT、LDH、苔盼兰拒染、细胞周期流式细胞术(FCM)和凋亡小体方法观察grp75对H2O2引起的C6细胞氧化应激性损伤的影响。结果:grp75转染组C6细胞在H2O2(0.1mmol/L,24h)刺激后MTT增加、LDH活性降低,细胞凋亡明显抑制,与空载体转染组相比有显著差异。结论:grp75基因对H2O2引起的C6细胞氧化应激性损伤有保护作用。

缺糖损伤对PC12细胞的效应及对葡萄糖调节蛋白75的表达影响

目的 :探讨缺糖损伤对PC12细胞的效应及对葡萄糖调节蛋白 75 ( grp75 )的表达影响。 方法 :通过形态学观察、MTT法及流式细胞术检测缺糖损伤对PC12细胞活力的影响 ,通过RT -PCR法检测缺糖损伤对 grp75在PC12细胞中表达的影响。结果 :PC12细胞在无糖培养条件下 ,细胞活力逐渐下降 ,48小时后 ,大部分细胞死亡 ,部分细胞为凋亡。而 grp75的表达随着无糖培养时间的增加而上调。 结论 :缺糖损伤导致PC12细胞活力下降 ,并引起

线粒体信号肽引导葡萄糖调节蛋白75-增强型绿色荧光蛋白(GRP75-EGFP)融合蛋白定位于线粒体

目的构建葡萄糖调节蛋白75(GRP75)不同结构域、不同形式突变体与线粒体信号肽重组蛋白并鉴定其亚细胞定位。方法通过重叠延伸PCR,将线粒体靶向信号肽序列分别与GRP75不同结构域基因拼接。利用定点突变PCR分别扩增实现62和65位氨基酸突变的磷酸化失活型、磷酸化激活型突变体、482位氨基酸突变的底物结合缺陷型突变体及三位点同时突变重组体。将上述重组基因克隆入p EGFPC1真核表达质粒,酶切和测序验证后分别用脂质体转染He La细胞,Western blot法检测重组蛋白表达水平,激光共聚焦显微镜观察比较重组蛋白亚细胞定位情况。结果成功构建了线粒体信号肽融合或缺失的GRP75结构域、磷酸化失活和激活突变体、底物结合缺陷突变体真核表达质粒。各重组质粒的片段插入、位点突变、信号肽融合情况均符合设计目的,在He La细胞表达后产物的相对分子质量大小均符合预期。EGFP蛋白C端插入信号肽能引导下游融合的GRP75全长蛋白、结构域片段、突变体蛋白表达定位于He La细胞线粒体中,而缺失信号肽的对应重组蛋白则主要分布于胞质和局部核周。结论构建了一系列GRP75重组真核表达质粒,EGFP融合信号肽能引导重组蛋白在线粒体中表达定位。

葡萄糖调节蛋白75在线粒体中的功能

葡萄糖调节蛋白75(Grp75)主要是由N-端的ATP酶结构域和C-端配体结合域(LBD)所组成,对于细胞的存活是必不可少的蛋白质,在哺乳动物细胞的各种组分中广泛分布,参与细胞的多种生命活动。但其主要分布是在线粒体,对线粒体的蛋白质输入、Ca 2+代谢、能量代谢以及线粒体的细胞内分布都具有重要的调控作用。

葡萄糖调节蛋白75生物学功能研究概述

葡萄糖调节蛋白75（glucose regulated protein75,grp75）是一种主要存在于细胞线粒体中的热休克蛋白（heat shock protein,HSP）[1]。它行使分子伴侣的功能,协助细胞质中合成的线粒体蛋白肽链转运入线粒体,帮助肽链在线粒体中正确折叠和装配,介导异常蛋白质的降解[2]。本文对grp75生物学功能的研究现状作一概述。

葡萄糖调节蛋白75基因突变体及其真核表达载体构建

葡萄糖调节蛋白75(glucose-regulated protein75,Grp75)与细胞内的p53结合抑制其核移位,起到了保护细胞的作用。为研究Grp75和p53的结合与否是如何影响细胞活力,现构建Grp75缺失突变基因的真核表达载体。以SOE-PCR(genesplicing by overlap extension)法得到Grp75缺失突变基因,与pcDNA3.0真核表达载体连接,构建Grp75缺失突变的特异性表达载体pcDNA3.0/Grp75(Δ253-282),经酶切、测序鉴定Grp75缺失突变蛋白表达载体成功构建。用脂质体将pcDNA3.0/Grp75(Δ253-282)转染到PC12细胞株,以1mg/mL浓度的G418筛选出稳定株,并命名为PC12/Grp75(Δ253-282)(+)。半定量RT-PCR和Western blot结果显示PC12/Grp75(Δ253-282)(+)细胞组内Grp75的mRNA和蛋白的表达水平较PC12细胞组增高。对PC12细胞组、PC12/Grp75(Δ253-282)(+)细胞组和PC12/Grp75(+)细胞组(pcDNA3/Grp75真核表达载体已构建)分别缺糖0h、3h、9h、18h和36h,MTT法检测各组细胞活力,Hoechst33324法检测细胞凋亡情况。结果显示PC12/Grp75(+)组细胞活力高于其它两组,PC12/Grp75(Δ253-282)(+)组高于PC12组,差异有统计学意义。Hoechst33324染色后,凋亡细胞的比率与MTT细胞活力检测结果基本一致。Western blot检测三种细胞内p53的表达量,PC12/Grp75(+)细胞内p53蛋白表达量低于另外两组,可能是由于Grp75蛋白量的增多部分抑制了p53的表达,提示Grp75对缺糖诱导细胞凋亡的抑制作用部分与p53的结合有关。以上结果表明Grp75基因的缺失突变在一定程度上降低了细胞的活力。

葡萄糖调节蛋白75对棕榈酸诱导的MIN6细胞脂毒性的影响及机制研究

目的探讨葡萄糖调节蛋白75(Mortalin)对棕榈酸诱导的MIN6细胞脂毒性的影响和机制。方法无特定病原体(SPF)级雄性C57BL/6J小鼠,20只,6~8周,20~24 g。采用随机数字表法将小鼠分为标准饮食组(SD)和高脂饮食组(HFD),每组10只。使用免疫荧光染色法、免疫组织化学法检测小鼠胰腺组织中Mortalin的表达情况。通过慢病毒转染构建Mortalin敲低(Sh-Mortalin)的MIN6稳转细胞株,根据使用牛血清白蛋白(BSA)还是棕榈酸(PA)处理敲低和空载细胞将其分为Sh-Mortalin组、Mortalin敲低空载组(ShNC-Mortalin组)、Sh-Mortalin+PA组、ShNC-Mortalin+PA组,按应用细胞外调节蛋白激酶(ERK)抑制剂U0126还是二甲基亚砜(DMSO)将细胞分为Sh-Mortalin+DMSO组、Sh-Mortalin+PA+DMSO组、Sh-Mortalin+U0126组、Sh-Mortalin+PA+U0126组。使用5-乙炔基-2′-脱氧尿苷(EdU)法检测细胞增殖率,流式细胞仪检测细胞凋亡率和活性氧(ROS)水平,酶联免疫吸附测定法检测胰岛素水平,Western blotting检测ERK通路相关蛋白[磷酸化细胞外调节蛋白激酶1/2(p-ERK1/2)、磷酸化原癌基因丝苏氨酸蛋白激酶-1(p-Raf-1)]的表达。2组间比较采用t检验,多组间比较采用单因素方差分析。结果体内实验结果表明,与SD组相比,HFD组小鼠胰腺的Mortalin表达明显增加(P<0.01)。体外实验结果表明,与ShNC-Mortalin+PA组相比,Sh-Mortalin+PA组的细胞增殖水平更高,细胞凋亡率更低,细胞ROS水平更低,胰岛素水平更高(P<0.05)。Western blotting结果显示,ShNC-Mortalin和Sh-Mortalin组p-ERK1/2、p-Raf-1蛋白表达均以PA时间梯度降低,且与ShNC-Mortalin组相比,Sh-Mortalin组的p-ERK1/2蛋白水平更高(P<0.05)。与Sh-Mortalin+DMSO组相比,Sh-Mortalin+U0126组EdU阳性率和p-ERK1/2水平均更低,且细胞脂毒性损伤加重(P<0.05)。结论Mortalin参与调控了MIN6细胞的脂毒性损伤过程,且敲低Mortalin可通过激活Raf-1/ERK信号通路减轻PA诱导的MIN6细胞脂毒性损伤。

葡萄糖调节蛋白75的研究进展

葡萄糖调节蛋白75(Grp75)是高度保守的热激蛋白家族中的一员,在细胞内主要行使伴侣蛋白的功能,帮助未折叠或错误折叠蛋白质进行正确的折叠,还与细胞内多个因子结合,参与细胞内多个重要的生物学过程。现就Grp75的基因定位、蛋白质分布和功能以及临床研究展开本综述。

应用蛋白组学方法筛选和鉴定乙型肝炎病毒PreS1结合蛋白

前S1蛋白(PreS1)在乙型肝炎病毒与宿主的相互作用中起至关重要的作用.为筛选乙型肝炎病毒PreS1结合蛋白,进一步探讨其在病毒感染过程中的作用,原核表达、纯化了PreS1-谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione-S-transferase,GST)融合蛋白,利用此蛋白与HepG2细胞裂解液进行Pull-down实验,其产物进行双向凝胶电泳分离.结果发现2个PreS1特异结合蛋白,经质谱鉴定为分子伴侣蛋白——葡萄糖调节蛋白78(GRP78)和葡萄糖调节蛋白75(GRP75).通过免疫共沉淀和Western印迹分析证实,PreS1与GRP75之间存在相互作用.实验结果表明,GRP75为新发现乙型肝炎病毒PreS1特异结合蛋白,其与PreS1结合后的生理功能以及在HBV感染过程中的作用值得深入研究.

grp75对细胞缺糖损伤的保护作用

为研究ｇｒｐ７５的功能，对过表达ｇｒｐ７５的ＣＨＬ细胞进行无糖培养以施加能量代谢应激，运用台盼蓝染色计数、ＬＤＨ释放测定和流式细胞术等方法评估其损伤程度。结果显示，无糖培养５ｈ，过表达ｇｒｐ７５细胞和对照组细胞比较，细胞活率、亚二倍体细胞率均无明显差别；无糖培养 １０ｈ，过表达ｇｒｐ７５ 细胞的活率高于对照组（Ｐ＜ ０．０１），亚二倍体细胞率低于对照组（Ｐ＜０．０５）；无糖培养至２０ｈ，两组细胞活率和亚二倍体细胞比率无显著差别。ＬＤＨ释放测定结果显示，无糖培养４ｈ，过表达ｇｒｐ７５细胞和对照组细胞ＬＤＨ释放百分比无显著差别；无糖培养７～１５ｈ，过表达ｇｒｐ７５细胞ＬＤＨ释放百分比低于对照组（Ｐ＜０．０５）；无糖培养２０ｈ，两组细胞ＬＤＨ释放百分比无显著差别。这一研究结果表明，过表达ｇｒｐ７５的细胞对一定强度的缺糖损害有明显的耐受性（表现为较轻的细胞膜损伤，较轻的ＤＮＡ断裂和较高的存活率），即细胞内ｇｒｐ７５具有对抗缺糖损伤的作用。

谷氨酰胺对细胞缺糖损伤的保护作用

目的观察谷氨酰胺(glutamine,Gln)对细胞缺糖(glucose desprivation,GD)损伤的保护作用,并探讨可能的作用机制。方法在以无糖培养大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤(PC12)细胞建立细胞缺糖损伤模型的基础上,首先以噻唑蓝比色(MTT)法、流式细胞法、细胞线粒体跨膜电位检测等方法观察Gln对缺糖损伤细胞模型的作用;再以大鼠大脑中动脉线栓法建立动物脑缺血模型,观察Gln对动物缺血性损伤的保护作用;同时用免疫细胞化学法、Western blot印迹法检测细胞中应激基因葡萄糖调节蛋白75(grp75)的表达变化。结果Gln能使离体细胞在缺糖应激下存活率增加、凋亡率降低,线粒体跨膜电位稳定;动物实验显示Gln能减轻动物因缺血造成的脑损伤;免疫细胞化学法、Western blot印迹法检测结果表明Gln可以上调细胞中grp75的表达。结论Gln对细胞缺糖损伤和动物缺血性脑损伤具有一定的保护作用,这种保护作用可能与上调细胞中的应激基因grp75的表达有关。

大鼠急性心肌梗死后缺血缺氧心肌早期凋亡信号分子的变化

目的探索能够应用于临床辨别早期缺血心肌生物学活性的敏感代谢变化指标。方法SD大鼠行冠状动脉前降支结扎术建立心肌缺血模型,分别结扎0(对照组)、5、20、45min。采用luciferin/luciferase法,RT-PCR法和免疫组织化学法分析心肌组织在不同缺血时间段梗死区、梗死边缘区及正常区ATP含量变化,葡萄糖调节蛋白75(grp75)和缺氧诱导因子1α(HIF1α)基因表达变化,以及细胞色素C释放、聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)降解的情况。结果大鼠冠状动脉前降支分别结扎5、20、45min时,梗死区及梗死区边缘心ATP含量上升,并于20、45min时明显高于正常水平;grp75及HIF1α基因转录水平未见明显改变。免疫组化结果显示少数细胞细胞色素C的释放出现于冠状动脉前降支结扎5min,而PARP的降解发生较迟,出现于冠状动脉前降支结扎20min。冠状动脉前降支结扎45min时细胞色素C的释放和PARP的降解明显增强免疫反应呈现片状染色。结论大鼠急性心肌缺血后早期梗死区发生细胞凋亡,细胞色素C释放、PARP降解出现较早,可用作为临床辨别缺血心肌生物学活性的早期变化指标。

黄芪注射液对血管紧张素Ⅱ诱导的H9c2细胞凋亡的抑制作用和机制研究

目的:探讨黄芪注射液对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的H9c2心肌细胞凋亡的抑制作用及其可能作用机制。方法:采用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)方法筛选H9c2细胞培养的黄芪注射液浓度;H9c2细胞分为正常对照组、AngⅡ模型组、AngⅡ+黄芪注射液组。采用实时定量聚合酶链式反应(RT-PCR)法检测3组H9c2细胞电压依赖性阴离子通道1(VDAC1)、线粒体融合蛋白2(Mfn2)及分子伴侣葡萄糖调节蛋白75(GRP75)mRNA的表达;蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测VDAC1、Mfn2、GRP75的蛋白表达;Fura-2 AM法测定细胞内Ca^(2+)浓度变化;用流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况。结果:黄芪注射液在浓度为0.125%时对细胞的促增殖作用最为显著。与正常对照组比较,AngⅡ模型组Mfn2、GRP75 mRNA表达水平明显增加(P<0.05),AngⅡ+黄芪注射液组Mfn2、GRP75 mRNA表达低于AngⅡ模型组(P<0.05或P<0.01),而3组VDAC1 mRNA表达比较差异无统计学意义(P>0.05)。与正常对照组比较,AngⅡ模型组VDAC1、Mfn2和GRP75的蛋白表达明显增加(P<0.05或P<0.01),AngⅡ+黄芪注射液组VDAC1、Mfn2、GRP75的蛋白表达低于AngⅡ模型组(P<0.01)。与正常对照组比较,AngⅡ模型组细胞钙含量、细胞凋亡率明显增加(P<0.05或P<0.01),AngⅡ+黄芪注射液组细胞钙含量、细胞凋亡率低于AngⅡ模型组(P<0.01)。结论:黄芪注射液能够抑制血管紧张素Ⅱ诱导的H9c2心肌细胞凋亡,其机制可能与其调节VDAC1、Mfn2和GRP75等MAM结构蛋白表达和影响细胞内钙平衡有关。