马铃薯蔗糖磷酸合成酶StSPS1的原核表达及抗体制备

为了对马铃薯蔗糖磷酸合成酶(SPS)编码蛋白StSPS1进行原核表达及多克隆抗体制备。从四倍体马铃薯品种川芋10号的块茎中克隆出了StSPS1基因,该基因编码区全长为3165 bp,编码蛋白的长度为1055 aa。随后基于构建的His标签融合表达载体PET30a-StSPS1,进行了StSPS1蛋白的诱导、变性、纯化、复性及兔免疫试验。结果发现,StSPS1蛋白分子量约为119.62 ku,在可溶性上清中的表达极少,主要在不溶的沉淀中表达,最佳的诱导条件为37℃下用0.5或1.0 mmol/L的IPTG诱导4 h。由于StSPS1为包涵体蛋白,故对其进行包涵体变性处理,并利用His标签纯化出了与目的条带大小相符的蛋白,同时通过His抗体进行了蛋白质免疫印迹(WB)试验,发现在119.62 ku处检测到目标条带,说明StSPS1包涵体蛋白纯化成功。最后,通过将透析复性后的StSPS1蛋白注射进兔子皮下组织中,成功免疫出2个StSPS1的抗体,经过WB鉴定发现2个抗体均能在抗原和川芋10号叶片的总蛋白中杂出目标条带。综上,对马铃薯StSPS1蛋白进行了诱导及纯化,并成功制备了StSPS1蛋白的兔多克隆抗体。

蔗糖代谢中蔗糖磷酸合成酶(SPS)的研究进展

蔗糖磷酸合成酶(sucrosephosphatesynthase,SPS)参与植物的生长发育,而植物生长发育所需要的光合产物大部分以蔗糖的形式供应和运输,其中蔗糖磷酸合成酶是蔗糖进入各种代谢途径所必需的关键酶之一。本文综述了蔗糖磷酸合成酶生物学功能,基因表达调控及进化,SPS基因的克隆及遗传转化植株的表现;并进一步对蔗糖磷酸合成酶的研究作出设想。

蔗糖磷酸合成酶与香蕉果实成熟、衰老的关系

研究了正常成熟、成熟抑制和促进成熟处理的香蕉果实蔗糖磷酸合成酶(SPS)与呼吸速率、硬度及蔗糖形成的关系。结果表明:(1)使用乙烯吸收剂不仅极显著抑制了呼吸速率、果实软化和蔗糖的积累(P<0·01),同时抑制了SPS的活性,与正常成熟果实相比,其SPS活性高峰延迟3d出现,酶活性明显降低。(2)丙烯处理不仅使SPS活性高峰比对照提前9d出现,而且促进了呼吸速率的提高,加速了硬度的下降和蔗糖的积累。表明SPS与香蕉果实的成熟、衰老和糖的积累及果实软化等有密切的关系。

甘蔗B家族蔗糖磷酸合成酶基因SofSPSB的克隆及原核表达

【目的】克隆甘蔗B家族SofSPSB基因并进行原核表达,为进一步研究甘蔗SPS酶学特性及SPS活性调控机制奠定基础。【方法】在进化分析的基础上,通过同源克隆获得甘蔗SofSPSB基因部分序列,再结合RACE技术获得全长cDNA序列。扩增SofSPSB基因ORF并连到原核表达载体pETBlue-2上,导入大肠杆菌BL21(DE3)中表达。【结果】通过比对B家族中进化关系很近的玉米(Zea mays)ZmSPS1和水稻(Oryza sativa)OsSPS1基因序列,并在保守区设计一对引物扩增获得甘蔗B家族SPS基因(SofSPSB)2330bp序列。结合5'-RACE和3'-RACE技术获得3481 bp SofSPSB基因全长cDNA序列,该序列包含一个3225bp的开放阅读框(ORF);起始密码子(ATG)位于转录起始位点后56bp处,终止密码子(TGA)后有一段201bp的非编码序列,并带有真核生物典型的polyA尾巴;编码1074个氨基酸,SofSPSB与Zm-SPS1、OsSPS1的核苷酸序列同源性分别为94.7%和81.3%,氨基酸序列同源性分别为96.0%和83.9%;其理论分子量Mw=118.96kDa,等电点pI=6.30。经原核表达后纯化获得带6×His标签的融合蛋白。【结论】克隆获得甘蔗B家族Sof-SPSB基因全长cDNA序列,成功构建了SofSPSB基因原核表达载体,使其在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。

甘蔗蔗糖磷酸合成酶SPSⅢ基因表达的初步研究

【目的】了解蔗糖磷酸合成酶基因在甘蔗中表达特性及其对甘蔗糖分积累影响的作用机理。【方法】以甘蔗品种桂糖28号(GT28)、拔地拉、新台糖20号(ROC20)、新台糖22号(ROC22)为供试材料,选取0叶、+1叶、幼嫩叶鞘、幼茎,通过半定量RT-PCR法对甘蔗SPSIII基因的表达进行分析。【结果】SPSIII在4个甘蔗基因型中的0叶、+1叶、幼嫩叶鞘和幼茎中均有表达,在GT284个不同部位的表达量较低,在拔地拉4个不同部位表达较均匀,在ROC204个部位中以嫩叶鞘的表达较高,在ROC22中以幼茎的表达较高。【结论】SPSIII在4个甘蔗基因型中的0叶和+1叶、幼嫩叶鞘和幼茎中均有表达,但SPSIII表达因甘蔗基因型不同而有所差异。

苦参碱对小麦旗叶中蔗糖磷酸合成酶活性的调节

小麦旗叶中碳水化合物水平将影响穗的生长和物质的积累 .本文实验结果表明苦参碱对小麦旗叶蔗糖生物合成有明显的影响 。

枸杞蔗糖磷酸合成酶基因的克隆及组织表达分析

利用RT-PCR及RACE技术,从药用植物枸杞中克隆了1个编码蔗糖磷酸合成酶（SPS）基因的全长cDNA,命名为LbSPS（GenBank登录号KC834608）。序列分析表明：LbSPS基因长3 677 bp,开放阅读框为3 165 bp,编码1 033个氨基酸,分子量为118.457 5 kD,理论等电点6.05。系统进化分析显示,LbSPS编码的氨基酸序列与甜瓜、马铃薯、番茄等蔗糖磷酸合成酶基因编码氨基酸序列一致性为66%～98%。qRT-PCR分析显示,LbSPS基因在枸杞花中表达量最高,叶中表达水平较低。该研究为进一步了解LbSPS在枸杞生长发育、逆境胁迫等过程中的生物学功能奠定了基础。

蔗糖磷酸合成酶(SPS)与果实品质及成熟衰老的研究进展

从蔗糖磷酸合成酶(sucrose phosphate syn thase,SPS)基本性质、SPS与果实糖的积累、相关酶类和外源刺激、乙烯和呼吸、果实软化的关系及SPS基因的克隆与表达调控等几方面综述了国内外近年来对SPS的研究进展.

甘蔗蔗糖磷酸合成酶研究进展

甘蔗是世界上重要的糖料作物,是食品加工的主要原料,而蔗糖磷酸合成酶(sucrose phosphate synthase,SPS)是甘蔗体内蔗糖合成的关键酶之一,对甘蔗中蔗糖的合成、积累和抗逆性起着重要的作用。介绍蔗糖磷酸合成酶在甘蔗蔗糖代谢中的作用和SPS家族基因的克隆、分类、表达活性和功能,分析SPS基因在甘蔗不同种中的单核苷酸位点突变、插入、缺失和氨基酸变异情况,期望为甘蔗蔗糖磷酸合成酶的进一步研究提供参考。

铁皮石斛蔗糖磷酸合成酶基因的克隆与原核表达

应用同源序列克隆法克隆了铁皮石斛蔗糖磷酸合成酶(SPS)基因cDNA全长,并进行了原核表达分析,为进一步研究该基因的时空表达、功能分析及多糖合成机理提供理论依据。结果表明:(1)铁皮石斛SPS基因cDNA全长3 502bp,编码区3 186bp,GenBank登录号JF423929。该基因编码1 061个氨基酸,与文心兰的SPS基因氨基酸序列的一致性最高为93%,与其他科植物SPS基因的氨基酸序列的一致性均高于60%。(2)原核诱导表达结果显示,SPS基因在大肠杆菌中的重组蛋白分子质量约为118.7kD,其表达与序列分析推测的结论一致。(3)生物信息学分析表明,铁皮石斛SPS基因的二级结构包括了螺旋、β-折叠和无规则卷曲,是非跨膜结构的亲水性不稳定蛋白,有2个功能结构域,分别是蔗糖合成功能域及糖基转移功能域。

甜瓜果实蔗糖磷酸合成酶基因cDNA片段的克隆及表达分析

根据在GenBank中登录的番茄、马铃薯等蔗糖磷酸合成酶基因的保守序列设计引物,采用RT-PCR方法从甜瓜花后25d的果实总RNA中扩增出目标cDNA片段,克隆到pMD18-T载体中。序列分析表明,该片段与番茄蔗糖磷酸合成酶氨基酸序列同源性为98.9%,GenBank中登记号为DQ355797。通过Northernblot检测其在甜瓜果实不同发育时期的表达变化,结果表明该基因在甜瓜果实花后25d开始表达,随着果实的成熟,表达量升高。

可可蔗糖磷酸合成酶基因家族进化及组织表达分析

在高等植物中,蔗糖磷酸合成酶（Sucrose phosphate synthase,SPS）是蔗糖合成的限速酶。在多种植物中都发现了SPS基因,而可可中尚未见相关报道。通过分析可可基因组数据库,鉴定出4个SPS候选基因,依次命名为TcSPS1、TcSPS2、TcSPS3和TcSPS4。4个基因的编码区（CDS）长度在3 075~3 228 bp之间,外显子数目为12~14,预测蛋白的平均分子量为118.15 ku,等电点均小于7。进化分析结果表明SPS基因家族分成3个亚族;TcSPS1和TcSPS2属于ClassⅠ亚族,TcSPS3和TcSPS4分别属于ClassⅡ亚族和ClassⅢ亚族。实时荧光定量PCR分析结果表明,TcSPS1与TcSPS2在树皮和果实中高量表达,TcSPS3和TcSPS4主要在叶片中表达。伴随着叶片和花蕾生长发育,各TcSPS基因表达量均呈现出上升的趋势,表明其与主要光合产物--蔗糖的合成或再合成有密切联系,参与可可“源库”器官中光合产物分配。

甘蔗蔗糖磷酸合成酶基因启动子遗传转化烟草的研究

蔗糖磷酸合成酶(Sucrose Phosphate Synthase,SPS)是调节甘蔗蔗糖合成的关键酶之一.根据课题组已经构建的甘蔗SPS5侧翼序列驱动GUS表达的载体,通过根癌农杆菌介导的叶盘转化法,转化模式植物烟草,获得26棵抗性植株.抗性植株的PCR结果表明,获得3株转基因植株.GUS染色分析说明,SPS的5侧翼序列可以驱动GUS基因表达,SPS的5侧翼序列具有启动子活性.

巴西橡胶树蔗糖磷酸合成酶基因的克隆和表达分析

分析橡胶树EST数据库,得到一个注释为SPS(蔗糖磷酸合成酶)的EST序列重叠群(contig)。通过PCR扩增和测序技术获得该基因的全长cDNA和基因组序列,命名为HbSPS1。序列分析显示,HbSPS1基因长度为5 298 bp,包含13个外显子和12个内含子。对应的cDNA编码序列(CDS)为3 156 bp,推测编码1 050个氨基酸,分子量大小为118.1 ku,等电点为6.05。采用荧光定量PCR技术分析该基因的表达模式,结果表明,HbSPS1基因主要在胶乳中表达,在乙烯利和机械伤害处理的胶乳中呈下调表达,在割胶影响下略有上调表达趋势,同时该基因在叶片发育过程中呈上调表达。说明HbSPS1基因可能参与胶乳蔗糖代谢和叶片发育调控。

甜瓜蔗糖磷酸合成酶基因全克隆及工程载体的构建

蔗糖磷酸合成酶在甜瓜果实蔗糖合成途径中起关键性的调节作用,克隆该基因并导入甜瓜低糖自交系,可改良甜瓜果实品质创新优良种质。从甜瓜幼苗叶片提取总RNA,利用RT-PCR与Southern blot方法相结合,重组子质粒经限制性内切酶酶切和PCR验证以及测序同源性比较,克隆到基因的5’(2859bp)和3’(852bp)。应用高保真Taq聚合酶PCR拼接蔗糖磷酸合成酶完整cDNA序列3692bp,该片段与GenBank中其它植物基因序列具有97%￣99%的同源性,登录号DQ364058。应用BamHⅠ、KpnⅠ、BglⅡ限制性酶切获得植物双元表达载体pROK2及基因的线性片段,通过T4连接酶反应,构建了以CaMV35S为启动子,以Tnos为终止子的工程载体pROK-SPS,该载体含有Npt-II选择标记基因。

棉花不同品种叶片和纤维中蔗糖磷酸合成酶活性变化及其与糖含量的关系

利用山农棕02、丰抗6号、中棉453个品种在大田栽培的条件下,研究了叶片和纤维中蔗糖磷酸合成酶活性的变化及与糖含量的关系。结果表明,在3个品种的叶片和纤维中,蔗糖磷酸合成酶活性均出现双峰,在开花当天最高,花后18d次之,整体呈下降趋势;与此同时可溶性总糖和蔗糖的含量变化以及光合速率的变化也成相似的变化。3个品种中,丰抗6号蔗糖磷酸合成酶活性和含糖量最高,中棉45次之,山农棕02最低。3个品种的相应观测指标之间均呈极显著差异。

甘蔗DⅢ家族蔗糖磷酸合成酶基因SofSPSDⅢ克隆及其hpRNA载体构建

【目的】克隆甘蔗DⅢ家族SofSPSDⅢ基因并构建其hpRNA表达载体,为研究该基因生物学功能奠定基础。【方法】通过同源克隆获得甘蔗SofSPSDⅢ基因部分序列,利用RACE技术获得其全长cDNA。扩增SofSPSDⅢ目的基因约500 bp序列,利用中间载体pHANNIBAL构建该片段的hpRNA结构,然后用Not Ⅰ将整个hpRNA结构切下,克隆到双元植物表达载体pART27上,构建该基因的hpRNA表达载体。【结果】通过同源克隆和RACE技术获得SofSPSDⅢ基因全长cDNA序列,该基因全长3252 bp,5′端UTR长度59 bp,3′端UTR长度292 bp,开放阅读框(ORF)长度2895 bp,带有真核生物典型的poly(A)尾巴(GenBank登录号:HQ117935)。该基因编码蛋白含有964个氨基酸,理论分子量108.03kDa,等电点pI=6.66;SofSPSDⅢ与SoSPS2、SbSPS和TaSPS9的氨基酸序列同源性分别为99.0%、98.9%和90.0%。构建获得SofSPSDⅢ基因的hpRNA载体pART-DⅢ-Ri。【结论】成功克隆甘蔗DⅢ家族SofSPSDⅢ基因并构建基hpRNA载体,可为下一步沉默该基因、进而解析该基因的生物学功能奠定基础。

甜高粱蔗糖磷酸合成酶基因(SPS3-1)的克隆与序列分析

以甘蔗蔗糖磷酸合成酶基因(SPSⅢ-2,NCBI登录号为EU278617)cDNA序列为探针,对高粱EST数据库进行同源检索、筛选和拼接,后经基因组PCR、分子克隆、序列分析验证分离了甜高粱蔗糖磷酸合成酶基因组DNA序列(SPS3-1,GeneBank登录号为FJ750250)。该序列全长6325bp,包含13个外显子和12个内含子,其cDNA序列包含一个2895bp的开放读码框,编码964个氨基酸,此蛋白属于SPSDⅢ家族。将此序列与高粱基因组DNA序列进行比较,发现SPS3-1基因位于高粱第4染色体上。将推测的甜高粱SPS3-1蛋白序列与甘蔗、水稻、玉米等物种进行同源进化分析,均表现出极高的保守性。

蔗糖磷酸合成酶研究的新进展

蔗糖磷酸合成酶(sucrose phosphate synthase,SPS)是高等植物体内控制蔗糖合成的关键酶之一,它主要通过异构调节和磷酸化修饰在酶水平调节蔗糖合成。本文简要介绍SPS家族的成员、SPS蛋白上的3个磷酸化位点,以及SPS的生物学功能、SPS与磷酸蔗糖磷酸酶的关系等。

不同甜高粱品种蔗糖合成酶、蔗糖磷酸合成酶活性与糖分积累的关系

以12个品种的甜高粱为材料,测定其叶片和茎秆在4个主要生长时期的可溶性糖含量以及蔗糖合成酶(sucrose syhthase,简称SS)和蔗糖磷酸合成酶(sucrose phosphate synthase,简称SPS)的活性变化,对2种酶的活性以及酶活性与可溶性糖含量之间的相关性进行分析,以了解甜高粱体内蔗糖合成酶和蔗糖磷酸合成酶对糖积累的影响。结果表明:在整个生长时期中,可溶性总糖含量不断提高,成熟期达到最大值。同一时期,茎秆中的2种酶活力大于叶片中的酶活力,在前期,2种酶活力差异不明显,但在生长后期,相同部位的SS活性要大于SPS活性。叶片中可溶性糖含量与SS活性呈极显著正相关(r=0.913,P<0.01),与SPS活性也呈极显著正相关(r=0.92,P<0.01);茎秆中可溶性糖含量与SS活性呈极显著正相关(r=0.989,P<0.01),与SPS活性也呈极显著正相关(r=0.983,P<0.01),说明SPS和SS是影响甜高粱糖积累的关键酶。