中国虎纹蛙多碱基重复微卫星位点的多态性

[目的]筛选出中国虎纹蛙高质量多态性的微卫星标记,用于该物种的鉴定以及遗传多样性、种群结构、遗传连锁图谱分析。[方法]利用新一代测序技术,从中国虎纹蛙部分基因组中筛选出33个三核苷酸重复、42个四核苷酸重复和1个五核苷酸重复微卫星位点,共76个多碱基重复微卫星位点。所有位点对浙江丽水学院两栖爬行动物实验室人工饲养的种群(n=30)进行了扩增和基因型分析。[结果]每个位点观察到的等位基因数和多态信息含量(PIC)的平均值分别为4个(2~7个)和0.514(0.164~0.822),观测杂合度(H_(O))和期望杂合度(H_(E))分别为0.00~0.97和0.18~0.82。有2个位点(THC141和THC377)显著偏离哈迪温伯格平衡,在11个位点中发现了显著的连锁不平衡。[结论]这些新筛选的多态性微卫星标记有助于进一步研究中国虎纹蛙的遗传多样性和开展遗传育种,为制定有效的保护策略和开展分子辅助选择提供依据。

天生斗士——虎纹蛙

两栖动物的出现,代表着动物类群从水域登陆陆地的进化历程。从泥盆纪至今,两栖动物经历了约3亿年的演化,时至今日,在不同的环境下,两栖纲动物们遍布世界各地并发展出不同的生存策略:有的利用拟态或保护色与环境融为一体,如枯叶蛙;有的利用自身毒素警告捕食者不要靠近,如箭毒蛙、蝾螈;有的利用独特的挖掘能力遁地逃生,如紫蛙;也有身形健硕、生性强悍,犹如斗士般直面危机,侵略特性拉满,虎纹蛙(Hoplobatrachus rugulosus)便属于这一类。

基于RAPD的SCAR分子标记技术鉴定虎纹蛙及引进种

为了对引进种泰国虎纹蛙加强种质监测,本文对泰国虎纹蛙和中国虎纹蛙进行了SCAR标记研究。在对2种蛙随机扩增多态DNA(RAPD)标记研究的基础上,选用随机引物OPP5和OPZ19对2种蛙进行扩增,将2个特异性扩增片段OPP5-471bp和OPZ19-512bp回收、克隆和测序,并根据序列信息设计两对SCAR引物SP5和SZ19。利用两对SCAR引物对2种蛙基因组DNA扩增的结果显示:SP5显示了其特异性,在对中国虎纹蛙的扩增中出现了单一SP5-388bp特异片段,而在泰国虎纹蛙中没有扩增产物;SZ19在对2种虎纹蛙的扩增中出均出现了单一条带,但片段大小不同,在中国虎纹蛙中为SZ19-456bp,在泰国虎纹蛙中为SZ19-497bp。3个分子标记都可作为基于RAPD成功转化后的SCAR分子标记对2种虎纹蛙进行鉴定。

中国虎纹蛙与泰国虎纹蛙的遗传多样性比较

本文应用RAPD技术,研究了中国虎纹蛙(Rana tigrina rugulosa)和泰国虎纹蛙(R.tigrina cantor)的种内种间遗传多样性及种质特异性分子标记,结果表明:中国虎纹蛙和泰国虎纹蛙多态位点比例(P)分别为53.77%和70.79%;遗传多样性指数(H)分别为0.1345和0.1780;种间的遗传相似系数(S)为0.4238,遗传距离(D)为0.6613。两种虎纹蛙遗传多样性都较丰富,但中国虎纹蛙的遗传变异程度较泰国虎纹蛙低。在OPA、OPF、OPP、OPZ几个系列随机引物的扩增中得到了可用于鉴别两种蛙的12条特异性谱带。

泰国虎纹蛙与中国虎纹蛙肌肉的营养成分比较

对泰国虎纹蛙与中国虎纹蛙肌肉的营养成分进行了比较。分析结果显示,泰国虎纹蛙肌肉中粗蛋白含量、必需氨基酸含量、鲜味氨基酸含量及支链氨基酸含量均比中国虎纹蛙高,分别高出3.03%、0.70%、0.34%和0.36%;而游离氨基酸总量、Ca、Zn、Fe、Mg等微量元素的含量却低于中国虎纹蛙;在2种蛙的氨基酸组成中,鲜味氨基酸-谷氨酸含量最高,分别为3.18%和2.97%,而在氨基酸价值的比较中,赖氨酸的分值最高,分别为171.29和167.36。综合评价,2种蛙均是优质的蛋白质源。

泰国虎纹蛙与中国虎纹蛙早期胚胎发育比较研究

比较了泰国虎纹蛙与中国虎纹蛙在控温条件下的胚胎发育过程。结果表明:两亚种蛙在右鳃封闭期与鳃盖完成期之间有明显的"角质颌出现"的特征,因而在传统分期的基础上增加了一个"角质颌出现期",从而将两者自受精卵开始到鳃盖完成期为止划分为26个时期;两亚种蛙大部分发育时期外形特征基本相同,但八细胞期细胞的排列方式,两亚种蛙神经褶期的神经沟形状、纤毛出现期的神经褶棱高度等均不同;泰国虎纹蛙的发育速度较快,自受精卵期到鳃盖完成期共耗时70.4h,中国虎纹蛙在相同的条件下则需92.5h,但在四细胞期、八细胞期、神经管期和尾芽期,泰国虎纹蛙的发育速度却较中国虎纹蛙慢。

豆粕替代鱼粉对泰国虎纹蛙生长性能的影响

为了探讨发酵豆粕代替鱼粉对泰国虎纹蛙(Hoplobatrachus rugulosus)生长性能的影响,该研究选用180只规格为24g/只~28g/只的泰国虎纹蛙为试验对象,试验共设置6个处理小组。根据发酵豆粕代替鱼粉的比例,分别为0%组、20%组、40%组、60%组、80%组和100%组。每个小组的泰国虎纹蛙30只,分3个重复,每个重复10只。试验为期60 d。结束后测定泰国虎纹蛙的增重情况。试验结果显示,发酵豆粕代替鱼粉对泰国虎纹蛙的摄食率和成活率影响不显著;增重率0%组和20%组的差异不显著;40%组、60%组和80组和0%组对比差异不显著,但是显著地低于20%组(P<0.05);100%组的增重率最低,显著地低于对照组、40%组、60%组和80%组(P<0.05),极显著地低于20%组(P<0.01);饲料效率以20%组的最高,但是和0%组、40%组、60%组和80%组的差异不显著,显著地高于100%组(P<0.05)。试验结果表明,以20%的发酵豆粕替代鱼粉,可以提高泰国虎纹蛙的生长性能。

低温胁迫下虎纹蛙的生存力及免疫和抗氧化能力

全球气候变化是造成世界范围内两栖类种群衰退和灭绝的重要因素之一。随着极端天气出现变得日趋频繁,非季节性的、短期且剧烈的气温变化可能会严重干扰两栖类动物的生存与种群稳定。监测了浙江省金华市南山野生虎纹蛙(Hoplobatrachus rugulosus)分布区冬季的环境气温,并参考监测数据在实验室条件下研究了虎纹蛙在短期梯度降温(2℃/24 h)和急性冷暴露(即冷休克)(2℃)下的生存力及冷休克对机体免疫功能和抗氧化能力的影响。结果表明,虎纹蛙在冬季(2009-12-01—2010-03-31)经历的温度范围普遍在0—14℃之间,主要遭遇的低温区间在0—4℃,主要高温区间在10—14℃。通过梯度降温实验,发现温度降至12℃累积死亡率约为28.1%,10℃为87.5%,8℃为100%。在一定温度范围内,虎纹蛙死亡率与环境温度呈显著负相关(Pearson test,r=-0.952,P<0.05)。经曲线拟合,回归方程计算可得半数致死温度为11.5℃。虎纹蛙在冷休克处理下,在第6 h累积死亡率为45%,12 h为80%,24 h达到100%。虎纹蛙死亡率与冷休克时间呈显著正相关(Pearson test,r=0.91,P<0.05),半数致死时间为7.6 h。此外,冷休克(2℃,6 h)显著抑制了虎纹蛙脾脏巨噬细胞呼吸爆发强度(t=3.827,df=6,P<0.05)、全血吞噬活性(t=5.388,df=3.037,P<0.05)及胃溶菌酶活力(t=6.37,df=6,P<0.05);肝脏(t=0.773,df=8,P>0.05)和肾脏(t=0.164,df=4.542,P>0.05)组织脂质过氧化物产物丙二醛(MDA)的含量虽无明显变化,但肝脏(t=-2.817,df=6,P<0.05)和肾脏(t=-11.302,df=6,P<0.05)组织抗氧化物谷胱甘肽(GSH)含量及肝脏(t=-3.3,df=6,P<0.05)超氧化物歧化酶(SOD)活性均显著升高。上述结果表明虎纹蛙对低温较为敏感,冷休克能够诱导机体的免疫抑制,并导致机体对抗氧化物质需求的增加。可以推测,当遭遇极端低温天气时,低温胁迫可能会严重干扰虎纹蛙生理机能,加大种群的生存压力和疾病感染的风险。

黑斑蛙、虎纹蛙和牛蛙皮肤的比较组织学

应用H.E和V.G胶原染色法对黑斑蛙(Rana nigromaculata)、虎纹蛙(Rana rugulosa)和牛蛙(Rana catesbeiana)皮肤进行了组织学观察和参数测量与比较.结果表明:三种蛙皮肤组织结构相似,但皮肤厚度、各组织层相对厚度及腺体密度存在较明显的种间差异和部位差异.虎纹蛙的皮肤最厚(0.44-0.68mm),牛蛙其次(0.28-0.60mm),黑斑蛙最薄(0.19-0.38mm);在三种蛙中,黑斑蛙躯体多数部位表皮相对厚度为15.1%-22.6%,较虎纹蛙(10.9%-17.7%)和牛蛙(9.9%-21.8%)厚.虎纹蛙和牛蛙皮肤胶原纤维层相对厚度分别为59.9%-68.7%和51.6%-75.3%,较黑斑蛙(44.4%-69.0%)厚;黑斑蛙和虎纹蛙躯体多数部位的颗粒腺密度(4.5-23.1个/mm2;8.9-25.3个/mm2)和粘液腺(54.1-152.2个/mm2;68.6-127.5个/mm2)较牛蛙(1.4-10.8个/mm2;16.8-39.3个/mm2)高.研究结果可供蛙类皮肤的合理开发利用参考.

虎纹蛙病毒主要衣壳蛋白基因的克隆及其序列

从新分离感染虎纹蛙的病毒培养细胞中提取病毒DNA作模板 ,用分别对应于蛙病毒 3型 (FV3)主要衣壳蛋白 (MajorCapsidProtein ,MCP)基因读码框两侧的寡核苷酸片段作引物进行PCR扩增 ,得到预期大小基因片段 ,进一步将此基因片段插入到pGEM T载体中 ,进行全长片段的序列测定和分析。结果表明 ,编码虎纹蛙病毒的MCP基因的读码框核苷酸数为 1392bp ,编码 4 6 3个氨基酸 ;基因的核苷酸序列与其他脊椎动物虹彩病毒的MCP基因序列比较结果显示 ,该病毒与蛙病毒属的FV3的同源性 (98% )明显高于囊肿病毒属的FLDV 1(5 2 % ) ,并且与虹彩病毒科其他成员的MCP基因序列均有所不同 。

虎纹蛙病毒的形态结构及其致病性研究

在透射电镜下观察了病毒感染细胞超薄切片中的病毒 ,发现细胞内病毒为二十面体对称结构 ,由衣壳、核心体和其间的非电子致密层构成 ,大小分别为 (12 5± 7)nm (N =2 5 ) (角对角 )、 (84± 7)nm (N =17)和13nm ,在感染细胞质中形成病毒发生基质 ,成熟病毒粒子在胞质中可积聚呈晶格状排列 ;病毒自细胞出芽释放时获得源于细胞的囊膜。回归感染证实虎纹蛙病毒的致病性 ,该病毒对虎纹蛙幼体和幼蛙敏感 ,浸泡和肌注感染死亡率为 10 0 % ;病毒可感染成蛙 ,但并不致死 ;肝脏和肾脏是病毒的感染器官 ;培养细胞内和释放进入培养液中的病毒粒子对虎纹蛙均具有感染性 ,说明虎纹蛙病毒的囊膜不是感染所必需的 ,缺乏囊膜的核衣壳也具有感染性。

虎纹蛙消化道解剖学观察

报道了虎纹蛙消化道各部的形态、组织学结构 .结果表明 :虎纹蛙消化道分为口咽腔、食道、胃、十二指肠、空肠、回肠、直肠和泄殖腔 .除口咽腔外 ,消化道管壁由粘膜层、粘膜下层、肌层和外膜组成 .各部主要区别在于粘膜层和肌层 :食道粘膜为复层纤毛柱状上皮 ,纵肌层稀少 ;胃、肠粘膜为单层柱状上皮 ,肌层由内环外纵两层平滑肌组成 ;胃和十二指肠可见粘膜肌层 .管壁皱襞的形态、腺体分布情况、肌层的相对厚度等在消化道各部也存在差异 .此外 ,还观察到食道粘膜上皮有纤毛结构 .研究表明虎纹蛙消化道结构与其食性是相适应的 .

泰国虎纹蛙红腿病病原菌的分离鉴定及药敏试验

从患红腿病的濒死泰国虎纹蛙肝脏、心脏、腹水及病变腿部肌肉组织分离获得4株菌株(TW0701、TW0702、TW0703和TW0704),根据细菌形态、培养特性、人工感染试验及API半自动微生物鉴定系统鉴定,确定4株分离株均为嗜水气单胞菌,且为泰国虎纹蛙红腿病的致病菌。以TW0701菌株为代表进行药敏试验,结果表明,该致病菌对头孢呋肟、先锋噻肟、先锋必、复达欣、氟苯尼考、菌必治、链霉素、卡那霉素、妥布霉素、头孢孟多、舒普深、磺胺二甲嘧啶、盐酸沙拉沙星、头孢西丁、环丙沙星、左氟沙星、恩诺沙星、氧氟沙星和磺胺六甲氧嘧啶(钠)等19种药物高度敏感,但对青霉素G、氨苄青霉素、苯唑青霉素、氧哌嗪青霉素、万古霉素、复方新诺明、阿莫西林、头孢噻吩、克林霉素、阿洛西林、头孢氨苄、新生霉素和头孢克洛等低度敏感或不敏感。

虎纹蛙白内障病病原的分离鉴定及其免疫防治

本文报道了海南养殖虎纹蛙白内障病的病原及其免疫学防治方法。对该典型患病个体进行病原分离并鉴定表明 ,被分离出的病原为脑膜炎败血黄杆菌。在所实验的 2 0种抗菌药物中 ,该菌只对万古霉素敏感 ,对头孢哌酮中度敏感 ,而对其他 18种药物均不敏感。通过筛选该病原强毒株制备甲醛灭活疫苗 ,对健康虎纹蛙进行免疫接种后 ,可明显提高其对该病的抵抗能力 ,表明在生产上用免疫学方法防治该病是可行的。

虎纹蛙消化道两种内分泌细胞的免疫组织化学定位

目的:研究虎纹蛙消化道5-羟色胺和生长抑素兔疫阳性细胞的形态与分布。方法:免疫组织化学技术。结果:5-羟色胺免疫阳性细胞在消化道各段均有分布。十二脂肠密度最高,直肠其次,食道最低。生长抑素免疫阳性细胞主要分布于胃幽门部和胃体,小肠各段亦有少数分布,直肠和食道中没有。结论:虎纹蛙消化道5-HT和SS免疫阳性细胞的分布和形态特点与多种动物相似。

虎纹蛙烂趾病病原菌分离鉴定与药敏试验

从患典型烂趾病的虎纹蛙病灶组织分离到1株细菌,暂命名为WD-01,经人工感染证实该细菌为虎纹蛙烂趾病的病原菌。通过形态学、生理生化特性对其进行鉴定,并用纸片法进行药敏试验。鉴定结果表明,细菌WD-01为嗜水气单胞菌。药敏试验结果表明,新霉素、利福平、先锋霉素、诺氟沙星、庆大霉素、强力霉素、链霉素、卡那霉素、土霉素和金霉素等12种药物对菌株WD-01具有明显的抑制作用。

pH值和温度对虎纹蛙消化系统蛋白酶活力的影响

采用福林-酚试剂法,就pH值和温度对虎纹蛙(Ranarugulosa)消化系统蛋白酶活力的影响进行了研究.结果表明,虎纹蛙食道、胃、前肠、后肠、直肠和胰脏蛋白酶的最适pH值分别为1.5、1.5、7.4、7.4、7.4和9.6,最适温度则均为50℃.文中对蛙类的人工养殖提出了几点建议.

养殖虎纹蛙稻田土壤酶活性及主要养分含量特征

为探明稻蛙种养对稻田主要土壤酶活性及养分含量的影响,本研究测定了稻田中套养虎纹蛙后不同种养殖时期稻田土壤酶活性及主要养分(N、P和K)含量的变化,并以施用化肥的稻田为对照。结果表明,在虎纹蛙养殖10~90 d内,试验田的过氧化氢酶活性持续下降,而脲酶、酸性磷酸酶和中性磷酸酶活性均持续增加;对照田的过氧化氢酶活性则呈先上升后下降的趋势,而脲酶活性不断下降;在试验田和对照田中,转化酶均呈先升后降的趋势,脱氢酶活性均持续增加;碱性磷酸酶活性均持续下降。在虎纹蛙养殖前10 d到养殖后60 d,试验田与对照田的碱性磷酸酶活性均呈下降的趋势,且两者间无显著性差异(P>0.05),只有在养殖90 d后,试验田的碱性磷酸酶活性明显增加且显著高于对照田(P<0.05);在虎纹蛙养殖10~60 d内,试验田的总N、P和K含量均显著低于对照田(P<0.05),90 d后才显著高于对照田(P<0.05);同时,在虎纹蛙养殖前60 d,试验田的多种土壤酶活性和主要养分含量均显著低于对照田(P<0.05)。由此可知,只有在虎纹蛙养殖90 d后,随着蛙粪积累增多,土壤酶活性和主要养分才得到显著提高,增加了试验田养分的供给。本研究结果为稻蛙种养的养分管理提供了新的理论指导。

浙江丽水虎纹蛙形态特征的两性异形和食性

用数显游标卡尺测量了407只2001-2003年9月下旬至10月上旬浙江丽水罚没的死亡虎纹蛙的体长等10个形态指标,结果表明:雌性成体体长(SUL)大于雄性成体,幼体形态无显著两性差异;ANCOVA去除SUL差异的影响后,雌性成体的头长和后肢长大于雄性成体,前肢长、眼径和耳径则小于雄性成体.前肢两侧对称性的偏移度成体大于幼体,雌性大于雄性;后肢两侧对称性成幼体和两性无显著差异.10个形态指标主成分分析的前三个主成分共解释64.6 %的变异:第一主成分中头宽、眼径和耳径,第二主成分中后肢长,第三主成分中眼间距和鼻间距分别有较高的正负载系数.用Nikon SMZ-1000解剖镜鉴别277只个体胃内容物中的食物种类,发现其秋季食物以节肢动物为主;成幼体和两性食物生态位宽度为3.42～5.25,食物生态位重叠度较高为0.93～0.98.分析表明,虎纹蛙局部形态特征的两性差异微弱,而体长两性异形差异显著;雌体具有较大的体形与食性无关,而可能与生育力选择的作用有关.