高虫草素含量蛹虫草菌的复合诱变选育研究

蛹虫草菌是冬虫夏草的近缘种,简称蛹草,不仅含有种类齐全、含量比例适宜的人体必需氨基酸,还含有大量腺苷、虫草素、腺嘌呤,是食药两用的虫草属真菌。其中,虫草素具有抗菌消炎、抗病毒、抗肿瘤、抗癌等功效,是蛹草中重要的活性成分。不同蛹草菌产虫草素能力不同,本文采用LiCl、60Coγ复合诱变,对1株蛹草菌原始菌株进行诱变,考察了LiCl不同质量浓度、60Coγ射线不同辐照剂量对诱变菌株致死率、突变率的影响,并用高效液相色谱法对筛选出的稳定突变体发酵液中的虫草素含量进行测定,筛选出高产虫草素突变体1株,虫草素含量达2.64mg/mL,为蛹虫草菌的进一步改良提供了一定的参考依据。

蛹虫草新菌株ZA10-C4的培养体系优化及虫草素高效制备

蛹虫草菌株ZA10-C4是经杂交育种得到的高产虫草素的新菌株,为了获得适合其生长的培养基,提高虫草素产量,作者通过响应面法优化培养基配方,并用大孔树脂NKA-Ⅱ吸附法提取纯化发酵液中的虫草素。ZA10-C4菌株的最佳发酵培养基配方为:麦芽糖17.99g/L、酵母提取粉41.13g/L、L-丙氨酸11.83g/L、KH_(2)PO_(4)2.00 g/L、MgSO_(4)1.50 g/L、维生素B112 mg/L。在此优化条件下,虫草素产量达到(4503.14±15.54)mg/L,较优化前提高1.66倍。同时,得到最佳提取纯化工艺为:自然pH、上样体积600 mL、上样和洗脱流量240mL/h、乙醇(体积分数70%)洗脱体积800mL。在此条件下得到的虫草素纯度为94.89%,得率为89.57%。该研究为蛹虫草新菌株ZA10-C4的大规模生产及虫草素的高效制备提供了技术参考。

虫草素及其代谢物3′-脱氧肌苷在大鼠体内的药动学

目的建立血浆虫草素及代谢物3’-脱氧肌苷(3′-Deo)的液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)测定方法,研究其在大鼠体内的药动学。方法以2-氯腺苷(2-Chl)为内标,甲醇沉淀蛋白,色谱柱为Kinetex C18(3 mm×100 mm,2.6μm),流动相为水(5 mmol·L^(-1)乙酸铵)-甲醇溶液,梯度洗脱。电喷雾离子源,正离子多反应监测。研究大鼠灌胃虫草素(10 mg·kg^(-1))后血浆虫草素及3′-Deo药动学。结果虫草素和3′-Deo分别在0.5~100和1~200 ng·mL^(-1)范围内线性关系良好,定量下限分别为0.5和1 ng·mL^(-1)。大鼠灌胃虫草素后,血浆虫草素浓度较低,主要转化为3′-Deo。虫草素和3′-Deo的峰浓度(C_(max))分别为(5.4±3.4)和(142.0±50.0)ng·mL^(-1),血药浓度-时间曲线下面积(AUC_(0-360 min))分别为(658.4±459.3)和(18034.9±4981.1)ng·min·mL^(-1)。结论该方法简单、灵敏、准确,适用于虫草素与3′-Deo血药浓度测定及药动学研究。

虫草素调控受体相互作用蛋白激酶1介导的凋亡改善缺氧/复氧诱导的人肾小管上皮细胞损伤

目的基于基因表达综合(gene expression omnibus,GEO)数据库中的基因芯片、网络药理学、分子对接和体外实验探讨虫草素治疗急性肾损伤(acute kidney injury,AKI)的作用机制。方法从GEO(GSE87025)、GeneCards 2个数据库获得AKI的疾病靶点。从TargetNet、BATMAN和GeneCards 3个数据库获得虫草素相关靶点。对AKI和虫草素相关靶点取并集,筛选出共同靶基因。进行基因本体论(gene ontology,GO)注释和京都基因与基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路富集分析后对虫草素及关键靶点进行分子对接。细胞实验设计对照组、缺氧/复氧组、缺氧/复氧+虫草素组对相关靶点进行实验验证。结果AKI和虫草素共同靶基因共12个,GO功能注释结果表明主要参与凋亡信号通路的负调控、坏死性凋亡过程等生物学过程,KEGG富集分析结果表明主要参与Toll样受体信号通路、坏死性凋亡、核苷酸结合寡聚化结构域(nucleotide-binding oligomerization domain,NOD)样受体信号通路、核因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)信号通路、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)信号通路和细胞凋亡等常见信号通路。虫草素和受体相互作用蛋白激酶1(receptor-interacting protein kinase 1,RIPK1)分子对接的最优结合能为-7.1,表明两者有较强的结合活性。蛋白免疫印迹结果表明虫草素可下调RIPK1、Bcl-2相关X蛋白、凋亡指标胱天蛋白酶表达、上调B细胞淋巴瘤/白血病-2的表达,细胞免疫荧光结果表明虫草素可下调RIPK1表达。结论虫草素可通过调控RIPK1介导的凋亡缓解缺氧/复氧诱导的人肾小管上皮细胞损伤,以达到治疗AKI的效果。

虫草素通过激活Nrf2/HO-1/NQO1通路缓解脑缺血再灌注大鼠脑组织损伤

目的探讨虫草素(cordycepin,COR)在脑缺血再灌注(cerebral ischemia reperfusion,CI/R)大鼠脑组织损伤中的保护作用及机制。方法60只Wistar大鼠分为健康对照组、模型组、模型加药组。跳台试验和Y迷宫实验检测大鼠学习和记忆力;HE染色法检测脑组织病理变化;干湿重法计算脑含水率和脑指数;TUNEL法观测脑组织细胞凋亡情况;ELISA测定大鼠血清中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase。SOD)、丙二醛(malonic dialdehyde,MDA)、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)的含量;蛋白质印迹检测Bax/Bcl-2、cleaved cas9/cas9、cleaved cas3/cas3、Nrf2、HO-1和NQO1蛋白表达水平。结果与模型组比较,COR能剂量依赖地改善大脑组织损伤,抑制氧化应激,促进Nrf2/HO-1/NQO1通路激活。结论虫草素能够改善脑组织损伤,其作用机制与上调Nrf2通路有关。

虫草素对穿支皮瓣存活的影响及其机制

目的:探讨虫草素对于穿支皮瓣存活的影响及可能机制。方法:将20只雄性SD大鼠随机分为对照组和虫草素组,每组10只。构建背部穿支皮瓣模型,虫草素组给予虫草素20mg/kg,对照组给予0.9%氯化钠溶液,连续7d。观察各组术后7d皮瓣远端坏死情况以及血流灌注情况,同时取各组皮瓣组织检测皮下水肿率。通过病理学染色、氧化应激相关试剂盒检测、Tunel染色、Westernblot等方法检测虫草素对于穿支皮瓣存活的作用以及相应组织内氧化应激、细胞凋亡和自噬指标的变化。结果:术后7d,各组穿支皮瓣远端均出现不同程度的坏死。虫草素组相较于对照组,皮瓣远端坏死率以及皮下水肿率更低,有更佳的血流灌注(P<0.05)。HE染色及Masson染色结果显示虫草素组皮瓣内微小血管更多,皮下结构和胶原排列更加有序。氧化应激相关指标检测结果显示,虫草素组的丙二醛含量下调(P<0.05)、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽含量上调(P<0.05)。Tunel荧光染色结果显示,虫草素组凋亡细胞更少(P<0.05)。Westernblot结果显示,虫草素可以调控皮瓣组织内氧化应激相关蛋白核因子E2相关因子2、血红素加氧酶-1水平升高(P<0.05),凋亡相关蛋白Bcl-2水平升高、cleaved-caspase3和Bax水平下降(P<0.05),自噬相关蛋白p-AMPK和微管相关蛋白轻链3II水平升高、p62水平下降(P<0.05)。结论:虫草素能促进穿支皮瓣远端存活,其机制可能是通过抑制氧化应激、抑制细胞凋亡和调控自噬水平起作用。

虫草素及其在生猪养殖中的应用

“禁抗令”出台后,“替抗”已成为畜牧业的热门话题。虫草素是蛹虫草的核心活性成分,具有广谱抗菌、抗氧化和调节免疫等功能,且取材和化学成分天然、不易产生抗药性、在体内无有害残留等突出优点,将有可能为“替抗”做出贡献。本文主要对虫草素的来源、合成方式、药理作用进行综述,并重点探讨虫草素在生猪养殖业中的应用进展,旨在为开发虫草素产品并应用于生猪养殖提供一定的参考信息。

米曲霉异源表达合成虫草素

【目的】通过米曲霉中异源表达虫草素合成关键基因,构建米曲霉工程菌株合成虫草素。【方法】以米曲霉尿苷/尿嘧啶和组氨酸双营养缺陷型菌株AoΔpyrGΔHisB为背景菌株,利用农杆菌介导的转化方法对虫草素合成关键基因CmCns1-CmCns3进行过表达;通过荧光显微镜观察CmCns1和CmCns2在米曲霉中的亚细胞定位;利用高效液相色谱法(HPLC)测定转基因米曲霉虫草素含量,同时对米曲霉发酵液添加合成虫草素的前体甘氨酸和腺嘌呤,探究其在米曲霉中对合成虫草素的影响。【结果】蛹虫草CmCns1和CmCns2在米曲霉中定位于脂滴;并且米曲霉中单独过表达CmCns1、共表达CmCns1和CmCns2以及共表达CmCns1-CmCns3均能合成虫草素,发酵48 h虫草素胞外产量最高达到37.74 μg/mL;向米曲霉发酵液添加甘氨酸和腺嘌呤,不能有效提升虫草素的含量。【结论】成功在米曲霉异源表达合成虫草素。

不同种类氨基酸对蛹虫草发酵液中虫草素含量的影响

[目的]研究液体培养基中添加氨基酸对蛹虫草发酵液中虫草素含量的影响,并确定8种氨基酸最佳添加浓度。[方法]考察24种氨基酸(添加浓度为1 g/L)对虫草素含量的影响,采用DPS V18.10软件进行差异显著性分析,并对促进虫草素合成作用显著的8种氨基酸添加浓度进行研究。[结果]L-赖氨酸、L-半胱氨酸、L-精氨酸、L-天门冬酰胺、L-甘氨酸、L-丙氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-组氨酸、肌氨酸对蛹虫草发酵液中虫草素含量具有不同程度的提高作用;4 g/L的L-甘氨酸对虫草素的合成促进作用最强,发酵液中虫草素含量为1022.25 mg/L。[结论]该研究为蛹虫草液体发酵生产虫草素提供参考依据。

虫草素通过调控Dickkopf相关蛋白/β-catenin信号通路诱导自噬和凋亡抑制弥漫大B细胞淋巴瘤

目的:探究虫草素是否通过Dickkopf相关蛋白1(Dkk1)/β-catenin信号诱导自噬和凋亡抑制弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)。方法:选择DLBCL SU-DHL-4细胞进行研究。MTT法检测细胞活性,用不同浓度虫草素处理DLBCL SU-DHL-4细胞,分为对照组和虫草素20、40、80μg/mL组。si-DDK1转染SU-DHL-4细胞,分为对照组、虫草素80μg/mL组和虫草素80μg/mL+si-DDK1组。流式细胞术检测细胞凋亡率,免疫荧光细胞化学检测微管相关蛋白轻链3(LC3)阳性细胞量,免疫印迹检测cleaved caspase-8、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9、cleaved多腺苷二磷酸核糖聚合酶-1(PARP1)、becline-1、自噬相关蛋白7(Atg7)、LC3Ⅱ,DDK-1和β-catenin蛋白相对表达量。结果:与对照组相比,经虫草素40、80μg/mL干预后,SU-DHL-4细胞凋亡率升高,LC3+阳性表达量显著增加,cleaved caspase-8、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9、cleaved PARP1、becline-1、ATG7、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和DDK-1蛋白相对表达量均上调,而β-catenin蛋白相对表达量下调。与虫草素80μg/mL组相比,在虫草素80μg/mL+si-DDK1组中DDK-1蛋白相对表达量下调,而β-catenin蛋白相对表达量上调;同时SU-DHL-4细胞凋亡率降低,LC3+阳性表达量显著降低,cleaved caspase-8、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9、cleaved PARP1、becline-1、ATG7和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白相对表达量均下调。结论:虫草素可通过调控Dkk1/β-catenin信号诱导自噬和凋亡来抑制DLBCL。

虫草素对脓毒症幼鼠急性肝损伤的改善作用

目的 探讨虫草素(Cor)对脓毒症幼鼠急性肝损伤的改善及对肝细胞自噬的影响。方法 将65只SD幼鼠随机分为假手术组、模型组、Cor低剂量组和Cor高剂量组,Cor低剂量、Cor高剂量组分别灌胃给予10、20 mg·kg^(-1)虫草素,1日1次,连续7 d;假手术组、模型组灌胃等量生理盐水,除假手术组外,其余各组复制脓毒症幼鼠模型。检测血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)和乳酸脱氢酶(LDH)水平;ELISA检测血清中肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)和IL-6含量;计算肝脏指数;HE染色观察幼鼠肝组织病理变化;TUNEL法检测幼鼠肝组织细胞凋亡;Western blot检测自噬相关蛋白的表达。结果 与假手术组比较,模型组、Cor低剂量、Cor高剂量组ALT、AST和LDH水平升高,血清TNF-α、IL-1β和IL-6含量增加,细胞凋亡率升高(P<0.05);与假手术组比较,模型组、Cor低剂量组肝脏指数升高(P<0.05),模型组微管相关蛋白1轻链3Ⅱ(LC3-Ⅱ)、Beclin1相对表达量降低,p62相对表达量升高(P<0.05),Cor高剂量组LC3-Ⅱ、Beclin1相对表达量升高,p62相对表达量降低(P<0.05);与模型组比较,Cor低剂量、高剂量组ALT、AST、LDH水平、肝脏指数和细胞凋亡率降低,TNF-α、IL-1β和IL-6含量减少,LC3-Ⅱ、自噬基因Beclin1相对表达量升高,p62相对表达量降低(P<0.05);与Cor低剂量组比较,Cor高剂量组ALT、AST、LDH水平、肝脏指数和细胞凋亡率降低,TNF-α、IL-1β和IL-6含量减少,LC3-Ⅱ、Beclin1相对表达量升高,p62相对表达量降低(P<0.05);HE染色显示,假手术组肝细胞细胞核圆且大,细胞排列整齐、分布均匀,肝小叶欠清晰,炎症细胞浸润较少;模型组肝细胞排列紊乱、肿胀甚至出现坏死,肝小叶结构破坏,出现灶性松散的炎症细胞浸润;Cor低剂量、高剂量组肝细胞排列相对整齐,炎症细胞浸润减轻,肝小叶结构相对清晰,Cor高剂量组肝细胞结构、排列更清晰,炎症细胞浸润更少。结论 Cor可以显著改善脓毒症幼鼠的急性肝损伤症状并诱导肝细胞自噬。

基于蛹虫草转录物组学的虫草素生物合成相关基因的表达和功能分析

蛹虫草Cordyceps militaris是我国著名的中药,而虫草素是蛹虫草重要的生物活性成分之一。通过转录物组分析野生型C.militaris、虫草素高产菌株C.militaris GYS60和低产菌株C.militaris GYS80虫草素生物合成相关基因的表达和功能变化。利用Illumina NovaSeq 6000测序获得3株菌株的转录物组数据,以鉴定差异表达基因。与C.militaris相比,在GYS60和GYS80中,分别有145和470个上调基因及96和594个下调基因;GYS60与GYS80相比,GYS60有306个上调基因和207个下调基因。这些基因经过GO和KEGG分析,与C.militaris相比,GYS60和GYS80分别有10和8个与嘌呤途径相关的基因差异表达;与GYS80相比,GYS60有12个基因差异表达。定量聚合酶链式反应验证8个关键酶的基因表达与转录物组分析一致。在GYS60中,参与虫草素生物合成的嘌呤核苷酸代谢中的氧化还原酶(CCM_07507,cmORE)、3′,5′-环AMP磷酸二酯酶(CCM_02777,cmAPE)、转移酶(CCM_04722,cmTRF)和腺苷酸环化酶(CCM_06928,cmADC)表达量显著上调。这些发现提高了我们对虫草素生物合成相关基因的理解和对其他次级代谢产物代谢通路的启示。

蛹虫草代谢产物虫草素抑制舌鳞癌裸鼠移植瘤的生长

目的评估虫草素对口腔癌的抑制作用并探讨其作用机制。方法将人口腔癌TCA-8113细胞接种于BALB/c裸鼠皮下,建立口腔癌裸鼠模型。将裸鼠模型其随机分为模型组和虫草素组,进行为期4周的治疗,之后切除肿瘤并称重,评估虫草素的抗肿瘤效果。通过HE染色评估小鼠心脏、脾脏、肝脏、肾脏和肺部的组织学变化,TUNEL染色检测肿瘤细胞死亡,并通过RT-qPCR和Western blotting评估Bax、Bcl-2、GRP78、CHOP和caspase-12的表达。结果虫草素治疗可使裸鼠皮下肿瘤生长减少56.09%。此外,虫草素治疗还与肿瘤细胞形态和凋亡死亡的显著变化相关,治疗后荷瘤裸鼠主要器官的形态未发生任何变化。虫草素处理还显著降低了Bcl-2的表达(P<0.05),同时增加了Bax、GRP78、CHOP和caspase-12 RNA和蛋白质水平的表达。结论虫草素可通过内源性线粒体途径和内质网应激途径诱导TCA-8113细胞凋亡。

虫草素的抗肿瘤作用机制研究进展

肿瘤的发病率和死亡率不断升高,其中肺癌、胃癌、结肠癌、肝癌和乳腺癌是最常见的肿瘤,已成为主要死因[1]。肿瘤的主要特征是不受控制、侵袭性的细胞生长,这是由肿瘤抑制基因的下调和(或)肿瘤促进基因的上调驱动的[2]。目前常见的肿瘤治疗方法包括手术、化疗、放疗、靶向疗法和免疫疗法等,然而这些疗法主要适用于患有局部病灶或对特定治疗敏感的肿瘤患者,因此单一种类的疗法具有很大的局限性[3]。

透性化处理酵母工程菌提高虫草素发酵产量

以酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae S288C为底盘细胞,引入蛹虫草菌中虫草素合成关键基因cns1和cns2,成功构建了产虫草素的酿酒酵母工程菌COR12,经液体发酵10 d后虫草素产量达到(43.74±0.13)mg/L。采用细胞透性化技术,通过添加表面活性剂(吐温-60、吐温-80、SDS)、有机溶剂(乙醇、DMSO)、物理处理法(热激、超声、玻璃珠振荡)等改变细胞膜通透性,弱化胞内虫草素积累诱发的反馈抑制,促进胞内虫草素外排以实现虫草素高产。结果表明,在发酵第3天时添加0.4%SDS,7 d时虫草素发酵产量最高,达到(98.53±0.98)mg/L,较对照组提高366.30%。

虫草素调节MAPK/AP-1信号通路对慢性阻塞性肺疾病大鼠肺组织损伤的影响

目的 基于丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)/激活蛋白-1(AP-1)信号通路探讨虫草素(Cor)对慢性阻塞性肺疾病大鼠肺组织损伤的改善作用。方法 利用烟熏联合脂多糖滴入气管的方法建立慢性阻塞性肺疾病大鼠模型,将造模大鼠随机分为模型组(COPD)、虫草素低、中、高剂量组(Cor-L、M、H,10、20、50 mg/kg)、阳性对照组(NAC,0.5 g/kg),另设置正常培养的大鼠为对照组(NC)。使用肺功能仪检测大鼠肺功能指标呼气峰流速(PEF)、用力肺活量(FVC);HE染色观察大鼠肺组织病理学变化;对肺泡灌洗液白细胞进行计数分离;ELISA法检测肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6和LTB4水平;微量法试剂盒检测肺组织中MDA、SOD、GSH-Px水平;Western Blot检测MAPK/AP-1信号通路蛋白表达。结果 与NC组比较,COPD组大鼠肺组织出现肺泡肿大,炎性细胞浸润等病理学变化,肺功能(PEF、FVC)、巨噬细胞比率、淋巴细胞比率、SOD、GSH-Px活性显著下降,白细胞数目、中性粒细胞比率、TNF-α、IL-6和LTB4水平、MDA含量、p-ERK/ERK、p-JNK/JNK、p-p38/p38、C-jun、C-fos蛋白表达显著上升(P<0.05);与COPD组比较,Cor各剂量组、NAC组大鼠肺组织病理学变化明显好转,肺功能(PEF、FVC)、巨噬细胞比率、淋巴细胞比率、SOD、GSH-Px活性显著上升,白细胞数目、中性粒细胞比率、TNF-α、IL-6和LTB4水平、MDA含量、p-ERK/ERK、p-JNK/JNK、p-p38/p38、C-jun、C-fos蛋白表达显著下降(P<0.05);NAC组与Cor-H组上述指标无显著差异(P>0.05)。结论 虫草素可以抑制MAPK/AP-1信号通路,减轻炎症反应和氧化应激,改善慢性阻塞性肺疾病大鼠肺组织病理损伤。

虫草素体外抗弓形虫的效果及其作用机制的探究

为探究虫草素抗弓形虫的效果及作用机制,本研究将不同浓度的虫草素与弓形虫RH株共同作用48 h后,采用CCK8法筛选对细胞安全的虫草素浓度。结果显示,以1μg/mL~200μg/mL(以对细胞的抑制率均为0判定)的虫草素为细胞的安全浓度。将巨噬细胞接种弓形虫RH-GFP株,同时分别加入1μg/mL~100μg/mL虫草素,根据弓形虫的荧光强度,计算虫草素对弓形虫的半数抑制浓度(IC50)。结果显示,虫草素对弓形虫的IC50为31.24μg/mL,且其对弓形虫的抑制作用与虫草素的浓度呈正相关。将巨噬细胞接种弓形虫RH株,同时加入100μg/mL虫草素,2 h后采用间接免疫荧光试验(IFA)检测并统计黏附与侵入细胞的弓形虫数量,分析虫草素对弓形虫黏附与侵入细胞的影响;24 h后采用吉姆萨染色后统计细胞感染率;收集上述各组细胞样品,一部分细胞采用qPCR检测细胞中弓形虫B1基因的转录水平,分析虫草素对弓形虫增殖的影响;一部分细胞采用IFA检测并统计每孔细胞100个空泡(PV)中的弓形虫速殖子的数量,分析虫草素对弓形虫复制水平的影响。结果显示,与感染RH株的对照细胞相比,虫草素处理组黏附细胞的弓形虫数量极显著上升(P<0.01),侵入细胞的弓形虫数量极显著下降(P<0.01);弓形虫对细胞的感染率及细胞中弓形虫B1基因的转录水平均极显著下降(P<0.01);虫草素处理组细胞中弓形虫速殖子数量为1或2的PV数量极显著升高,数量为4和8及以上的PV数量极显著减少(P<0.01)。上述结果表明,虫草素在体外能够显著抑制弓形虫对细胞侵袭力、细胞感染率、弓形虫的增殖及复制水平。将小鼠腹腔巨噬细胞分为3组:空白对照组(Blank control)、感染RH株的对照组(T.gondii)和虫草素与RH株共培养组(T.gondii+Cor),各组细胞培养24 h后采用ELISA试剂盒检测各组细胞上清液中各细胞因子的分泌水平;采用生化试剂盒测定各组细胞的各生化指标;采用western blot检测各组细胞中TLR4/NF-κB炎症反应信号通路相关蛋白TLR4、p-NF-κB p65和Nrf2/HO-1氧化应激信号通路相关蛋白Nrf2、HO-1的表达量。ELISA结果显示,与空白对照组相比,T.gondii组中TNF-α、IL-6和IL-1β的分泌水平均极显著升高(P<0.01);与T.gondii组相比,T.gondii+Cor组中TNF-α、IL-6和IL-1β的分泌水平均极显著降低(P<0.01)。生化指标测定结果显示,与空白对照组相比,T.gondii组中丙二醛(MDA)的含量极显著升高(P<0.01),谷胱甘肽(GSH)和超氧化物歧化酶(SOD)的含量极显著下降(P<0.01);与T.gondii组相比,T.gondii+Cor组中MDA的含量极显著降低(P<0.01),GSH和SOD的含量极显著升高(P<0.01)。Western blot结果显示,与空白对照组相比,T.gondii组中TLR4、p-NF-κB p65、Nrf2和HO-1的表达量均极显著升高(P<0.01);与T.gondii组相比,T.gondii+Cor组中TLR4和p-NF-κB p65蛋白的表达水平均极显著降低(P<0.01),Nrf2和HO-1蛋白的表达水平均极显著升高(P<0.01)。以上研究结果首次证实,虫草素在体外可能通过调控TLR4/NF-κB和Nrf2/HO-1信号通路发挥抗炎和抗氧化活性以抑制弓形虫在小鼠腹腔巨噬细胞内的增殖和复制。本研究对虫草素抗弓形虫作用及机制的初步研究及其在兽医临床中的应用提供参考依据。

虫草素通过调节COX-2/PGE2信号通路促进骨质疏松大鼠的骨折愈合

目的探讨虫草素(Cordycepin)调控环氧化酶2(COX-2)/前列腺素E2(PGE2)信号通路对骨质疏松大鼠骨折愈合的影响。方法制备骨质疏松大鼠模型,将大鼠分为Sham组、Model组、Cordycepin组(10 mg/kg腹腔注射)、Cordycepin+NS-398组(腹腔注射10 mg/kg的Cordycepin+10 mg/kg的COX-2抑制剂),分别检测骨折愈合情况、骨密度(BMD)及生物力学性能,HE染色观察骨痂组织病理学变化,ELISA法检测血清ALP、CTX-Ⅰ、OC水平及骨痂组织COX-2、PGE2、cAMP水平,免疫组化法检测骨痂组织COX-2、VEGF表达。结果与Sham组比较,Model组骨折线明显,X光片评分、BMD、骨最大负荷与刚度、ALP、OC水平显著降低、骨组织COX-2、PGE2、cAMP、VEGF表达水平显著降低,CTX-Ⅰ水平显著升高(P<0.05);与Model组比较,Cordycepin组X光片评分、BMD、骨最大负荷与刚度、ALP、OC水平显著升高、骨组织COX-2、PGE2、cAMP、VEGF表达水平显著升高,CTX-Ⅰ水平显著降低(P<0.05);NS-398可逆转Cordycepin对骨质疏松大鼠骨折愈合的促进作用。结论虫草素可能通过激活COX-2/PGE2信号通路,促进骨质疏松大鼠的骨折愈合。

基于代谢组学的蛹虫草菌株虫草素合成途径研究

通过对蛹虫草菌株代谢组数据分析研究虫草素合成途径,以蛹虫草出发菌株CM08、经过辐射诱变获得的高产虫草素正突变菌株CM09和低产虫草素负突变菌株CM10为研究对象,采用超高效液相色谱-串联飞行时间质谱联用技术测定3个菌株菌丝体的非靶向代谢组数据,并对所得数据进行多元统计分析。主成分分析(principal component analysis,PCA)结果表明,CM08、CM09和CM10的代谢物之间存在显著差异;根据正交偏最小二乘法判别分析(orthogonal partial least squares discrimination analysis,OPLS-DA)模型得到的变量权重值(variable importance for the projection,VIP)区分差异代谢物(VIP﹥1且P﹤0.05),其中CM09 vs CM08差异代谢物64种,CM10 vs CM08差异代谢物147种,主要为氨基酸、糖类与核苷类化合物;KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)代谢通路富集分析发现差异代谢物显著富集到嘌呤代谢途径、磷酸戊糖途径和ABC转运蛋白途径等;差异代谢物腺苷、二磷酸腺苷(adenosine diphosphate,ADP)-核糖、2′-脱氧腺苷、一磷酸腺苷(adenosine monophosphate,AMP)、3′-一磷酸腺苷(adenosine 3′-monophosphate,3′-AMP)和虫草素在正负突变菌株中相对含量上下调相反,说明这些差异代谢物与虫草素产量密切相关,结合已有文献报道完善虫草素合成途径为:ADP-核糖→核糖-5-磷酸→5-磷酸核糖-1-焦磷酸→次黄嘌呤核苷酸→腺苷酸琥珀酸→AMP→腺苷→3′-AMP→2′-羰基-3′-脱氧腺苷→虫草素。该研究为虫草素合成途径的研究提供重要依据。

虫草素的合成及工艺优化

目的开发并优化一条经济、安全、高效的虫草素半合成工艺路线,深入分析反应机制。方法以廉价的腺苷为起始原料,与2-乙酰氧基异丁酰溴反应生成溴代中间体3,再经二氢双(2-甲氧乙氧基)铝酸钠(Red-Al)还原脱卤得虫草素,利用HRMS、^(1)H-NMR、^(13)C-NMR、HPLC、旋光和熔点进行结构确认及纯度鉴定,分析反应机制及生成的副产物。结果通过两步反应实现了虫草素的合成,其中脱卤反应在常温常压下进行,避免了昂贵金属试剂(Pd/C)和危险源(高压氢气)的使用,极大降低了生产成本,提高了反应安全性。结论本实验报道的两步法是目前虫草素最简洁高效的半合成路线,分离纯化简单,机制明确清晰,具有良好的市场化前景。