基于网络药理学和细胞实验探讨蟾蜍灵治疗胃癌的作用机制

本研究基于网络药理学、分子对接和细胞实验探究蟾蜍灵治疗胃癌的作用机制。利用PubChem和PharmMapper数据库检索蟾蜍灵的药物靶点;GeneCards数据库收集胃癌的相关靶点,运用Venny软件和STRING数据库构建药物与疾病共同靶点的PPI网络图,通过DAVID数据库进行GO富集和KEGG通路分析。利用Cytoscape3.9.0软件进行可视化并筛选核心靶点,通过GIEPA数据库、Kaplan-Meier方法、AutoDock和PyMOL软件分析核心靶点分别与胃癌和蟾蜍灵之间的关系。最后通过细胞实验对网络药理学预测的靶点和信号通路进行实验验证。网络药理学筛选到蟾蜍灵的药物靶点285个,胃癌相关的疾病靶点909个,蟾蜍灵与胃癌的交集靶点91个,结合PPI网络度值排名、胃癌患者中表达水平以及患者生存预后相关性筛选2个核心靶点为HSP90AA1和SRC。KEGG富集分析蟾蜍灵治疗胃癌可能与PI3K-Akt、FoxO、Ras和MAPK信号通路有关。生存分析结果显示,HSP90AA1和SRC mRNA在胃癌组织中表达显著上调,且其高表达的患者总生存期显著低于低表达组。分子对接结果显示,蟾蜍灵与核心靶点具有较好的结合力。细胞实验结果表明,与对照组相比,蟾蜍灵处理胃癌细胞MGC-803后,细胞的增殖、迁移能力均下降,而细胞凋亡数增加。MGC-803细胞中HSP90AA1、SRC、Bcl-2、p-AKT和FoxO1蛋白表达水平显著下调,Bax蛋白的表达显著上调。综上所述,蟾蜍灵可能通过调控HSP90AA1和SRC核心蛋白及Akt/FoxO1信号通路发挥治疗胃癌的作用。

蟾蜍灵抗肿瘤作用的研究进展

蟾蜍灵是从蟾蜍中提取的一种具有抗肿瘤功能的活性成分,可有效抑制多种肿瘤细胞增殖,促进肿瘤细胞自噬和凋亡,并能够与其它药物联合使用降低肿瘤抗药性,产生协同治疗效果。利用纳米颗粒作为载体,能够提高蟾蜍灵的生物相容性和抗肿瘤能力。本文作者就蟾蜍灵治疗多种不同类型肿瘤的研究现状及其作用机制进行综述,以期为蟾蜍灵抗肿瘤深入研究与临床应用提供理论依据和参考。

蟾蜍灵对肝癌细胞SMMC 7721的细胞毒作用及生长相关基因表达的影响

为探讨蟾蜍灵的抗癌作用机理 ,以肝癌SMMC772 1细胞为靶细胞 ,应用噻唑蓝还原法检测细胞毒作用 ,双荧光染色法和DNA电泳技术检测细胞凋亡与坏死 ;免疫组织化学方法检测细胞生长相关基因p2 1waf1/cip1和增殖细胞核抗原 (PCNA)蛋白表达 .结果表明 ,0 .0 1μmol·L- 1及以上浓度蟾蜍灵对SMMC772 1细胞具有显著细胞毒作用 ,形态学和DNA片段化检测证实蟾蜍灵诱导的细胞死亡以凋亡为主 ;p2 1waf1/cip1在蟾蜍灵诱导下表达上调 ,同时PCNA的表达下降 ,两者呈负相关 (P <0 .0 1) .提示蟾蜍灵通过上调p2 1waf1/cip1表达 ,下调PCNA表达 。

蟾蜍灵对人非小细胞肺癌A549细胞增殖与凋亡的影响

背景与目的蟾蜍灵是从中药蟾酥中提取出来的有效成分,其抗肿瘤作用已经在许多体外肿瘤细胞中得到证实,本研究旨在探讨蟾蜍灵对人非小细胞肺癌细胞的增殖抑制、诱导凋亡作用及其机制。方法采用MTT法测定细胞活力,绘制细胞增殖抑制曲线;瑞氏-吉姆萨染色法观察细胞形态学的变化;流式细胞仪通过PI染色进行细胞周期分析及凋亡判定;Westernblot法检测Livin及Caspase-3蛋白的表达。结果蟾蜍灵以时间、剂量依赖方式抑制A549细胞增殖,48h、72h及96h抑制细胞增殖50%的药物浓度(half maximal inhibitory concentration,IC50)分别为(56.14±6.72)nmol/L、(15.57±4.28)nmol/L及(7.39±4.16)nmol/L;蟾蜍灵能诱导肺癌细胞凋亡,形态学表现为出现凋亡小体及流式细胞仪检测到的亚二倍体凋亡峰,凋亡率与对照组比较差异有统计学意义(均P<0.01);蟾蜍灵诱导细胞凋亡过程中,下调Livin蛋白表达(P<0.01),同时活化Caspase-3蛋白。结论蟾蜍灵能够抑制肺癌细胞A549的增殖,并诱导其凋亡;抑制凋亡抑制蛋白Livin的活性及活化Caspase-3可能在其抑癌机制中发挥重要作用。

蟾蜍灵对人胃癌细胞系MGc-803的细胞毒作用

蟾蜍灵(bufalin)是我国传统中药蟾酥中蟾毒的主要成分之 一，研究其抑癌作用及机制具有重要意义。采用台盼蓝染色法、噻唑蓝还原法和光镜观察bu falin对人低分化胃腺癌细胞系MGc-803的生长抑制作用。结果显示，0.01 μmol/L及以上 浓度bufalin对MGc-803细胞具有显著的抑制作用，IC50值约为0.1 μmol/L。bufal in抑制MGc-803生长的机制是致使细胞核染色质凝缩、碎裂，DNA损伤，胞浆RNA含量下降， 导致细胞死亡。

蟾蜍灵诱导白血病HL-60细胞分化及相关基因表达

目的 研究中药蟾酥中蟾毒成分蟾蜍灵 ( bufalin)的抗癌机制。方法 以早幼粒白血病 HL - 60细胞为靶细胞 ,应用电镜技术观察 bufalin诱导的细胞分化 ,免疫组化方法检测增殖细胞核抗原 ( PCNA)和细胞周期素依赖性蛋白激酶抑制因子 p2 1WAF1 的表达。结果 0 .0 0 1μmol/ L bufalin作用 HL - 60细胞 ,细胞向粒细胞方向分化 ,p2 1WAF1表达显著升高 ,而 PCNA表达显著下降 ,二者呈显著负相关 ( P<0 .0 1)。结论 bufalin诱导 HL- 60细胞分化 ,与其上调 p2 1WAF 1的表达、下调 PCNA表达有关。

蟾蜍灵在诱导HL-60细胞凋亡过程中对Bcl-2和PKC的影响

为了研究蟾蜍灵在诱导HL-60细胞凋亡过程中对Bcl-2表达与裂解和磷酸化的作用,及对蛋白激酶C(PKC)活性与PKCs亚细胞定位的影响,分别采用台盼蓝拒染法检测细胞生存率,细胞染色法观察凋亡形态,流式细胞术分析细胞周期,琼脂糖凝胶电泳检测凋亡DNA片段化,[γ-32P]同位素掺入法测定PKC活性,Westernblot分析Bcl-2及PKC蛋白表达。结果表明:①蟾蜍灵抑制HL-60细胞增殖,24、48及72小时的IC50分别为(25.8±2·1)、(8.0±1.2)及(2.3±0.3)nmol/L;②50nmol/L蟾蜍灵作用24小时可诱导HL-60细胞凋亡;③50nmol/L蟾蜍灵处理HL-60细胞6-24小时,Bcl-2蛋白表达水平明显下调,并出现23kD的裂解片段,磷酸化水平逐渐降低;④1-100nmol/L蟾蜍灵分别作用30分钟,对PKC总活性无影响,但可促使PKCβⅡ膜转位。结论:蟾蜍灵诱导HL-60细胞凋亡可能与Bcl-2表达降低、裂解及脱磷酸化有关。

蟾蜍灵对人食管鳞癌EC9706细胞增殖及凋亡的影响

目的观察蟾蜍灵对人食管鳞癌EC9706细胞增殖及凋亡的影响,探讨其对人端粒酶逆转录酶(hTERT)核-线粒体定位的影响。方法采用不同浓度蟾蜍灵作用EC9706细胞,CCK-8法测定细胞增殖抑制并计算半数抑制浓度(IC50),PI染色流式细胞仪分析细胞周期,Hoechst 33342染色荧光显微镜观察凋亡核形态改变,Annexin V-FITC/PI双染流式细胞仪检测细胞凋亡率,Western blot法及多重免疫荧光标记激光共聚焦显微镜检测hTERT亚细胞定位及蛋白表达。结果随作用时间及浓度的增加,蟾蜍灵可显著抑制人食管鳞癌EC9706细胞的增殖(P均<0.01)。100 nmol/L蟾蜍灵作用EC9706细胞时,随着作用时间的延长,G1期细胞逐渐减少,S及G2/M期细胞显著增加(P均<0.05);细胞核发生典型的凋亡形态学改变,凋亡率逐渐增加(P<0.01)。hTERT可表达于EC9706细胞线粒体中,在蟾蜍灵诱导的凋亡过程中,细胞核hTERT的表达减少,而线粒体hTERT的表达则有所增加(P<0.05)。结论蟾蜍灵可抑制EC9706细胞增殖,诱导其凋亡,细胞周期阻滞于S及G2/M期。hTERT除细胞核外还定位于线粒体中,并在蟾蜍灵诱导的凋亡过程中由细胞核向线粒体转位。

蟾蜍灵对顺铂耐药胃癌SGC7901细胞增殖与凋亡的影响及其作用机制

目的探讨蟾蜍灵(bufalin)对顺铂耐药胃癌细胞(SGC7901/CDDP)增殖及凋亡的影响及其作用机制。方法采用MTT比色法检测bufalin对SGC7901/CDDP细胞增殖的抑制作用;应用流式细胞术PI染色检测细胞凋亡;应用Western blot检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax的表达。结果 Bufalin以时间和剂量依赖方式抑制SGC7901/CDDP细胞增殖,24、48、72h的IC50值分别为106.3、53.8、10.9nmol/L。选取10、50、100nmol/L的bufalin作用SGC7901/CD-DP细胞24h,凋亡率分别为7.3%、12.6%和26.4%,呈浓度依赖性。Western blot分析结果表明,SGC7901/CDDP细胞经10、50、100nmol/L的bufalin处理后,促凋亡基因Bax表达逐渐上调,抗凋亡基因Bcl-2表达逐渐减弱。结论 Bufalin在体外能够抑制对顺铂耐药的胃癌细胞(SGC7901/CDDP)的增殖,且通过调控Bcl-2、Bax的表达而诱导细胞凋亡。

蟾蜍灵诱导人白血病HL60细胞凋亡的初步研究

目的 :探讨中药蟾蜍灵诱导白血病HL6 0细胞凋亡作用。方法 :应用台盼蓝染色法测定HL6 0细胞的生长曲线 ,应用相差显微镜、电子显微镜和DNA琼脂糖凝胶电泳等技术分析细胞凋亡。结果 :蟾蜍灵与HL6 0细胞共育时 ,能明显抑制细胞生长 ,细胞呈典型的凋亡形态学改变 :细胞皱缩 ,染色质凝集 ,沿核膜内侧分布 ,呈新月形 ,可见由膜包被细胞内容物的凋亡小体的产生 ;细胞DNA裂解成 180～ 2 0 0bp及其倍数的片段 ,电泳得到特有的梯形条带。结论 :蟾蜍灵诱导细胞凋亡是其抗肿瘤的作用机制之一。

蟾蜍灵诱导人胃癌细胞凋亡的实验研究

用MTT 法、 形态学观察法、DNA 电泳和流式细胞仪观察蟾蜍灵(Bufalin)诱导的胃癌细胞凋亡。结果表明，0.01 m mol/L 蟾蜍灵作用 MGc-803 细胞48 h， 即可显著抑制细胞生长，IC 50 值约为0.1 m mol/L。 琼脂糖凝胶电泳获得梯形图谱，流式细胞仪DNA 直方图上出现典型的亚二倍体峰，凋亡主要发生在G1/G0 期，细胞凋亡率随药物浓度和作用时间的增加而增高。以上结果提示，bufalin 对胃癌细胞具有很强的抑制作用，诱导凋亡是其主要作用机制之一。

蟾蜍灵在诱导HL-60细胞凋亡时对SYK和CBL家族蛋白的影响

为了探讨酪氨酸蛋白激酶SYK和CBL家族泛素连接酶在蟾蜍灵诱导HL-60细胞凋亡过程中的作用机制,采用台盼蓝染色检测细胞活力,采用流式细胞术检测细胞凋亡,采用Western blot和免疫沉降技术检测CBL、CBL-b表达和SYK的磷酸化。结果显示,蟾蜍灵以时间和剂量依赖方式抑制HL-60细胞增殖,24、48和72小时抑制细胞活力的IC50浓度分别约为26.3,7.8和2.0 nmol/L。高剂量蟾蜍灵从8小时即开始诱导HL-60细胞凋亡;与此同时蟾蜍灵快速活化SYK,并以时间依赖的方式下调CBL和CBL-b表达。结论:SYK活化及CBL家族蛋白表达下调可能参与蟾蜍灵对HL-60细胞的增殖抑制和凋亡诱导作用。

蟾蜍灵诱导人肺腺癌细胞凋亡作用及其机制

目的研究中药蟾酥有效成分蟾蜍灵(bufalin)对人肺腺癌细胞的作用及其机制。方法 MTT法检测蟾蜍灵对细胞的增殖抑制作用;瑞氏-吉姆萨染色法观察细胞形态学的变化;流式细胞术分析细胞凋亡和线粒体跨膜电位;Western blot法检测Bcl-2、Caspase-3蛋白的表达。结果 (1)蟾蜍灵明显抑制A549细胞增殖,48h及72h的IC50分别为(56.14±6.72)nmol/L、(15.57±4.28)nmol/L。(2)蟾蜍灵能诱导肺癌细胞凋亡,形态学表现为出现凋亡小体及流式细胞仪检测到的亚二倍体凋亡峰。(3)蟾蜍灵可以明显降低细胞线粒体跨膜电位(ΔΨm)。(4)蟾蜍灵诱导细胞凋亡过程中,下调Bcl-2蛋白表达(P<0.01),同时活化Caspase-3。结论线粒体途径是蟾蜍灵诱导肺腺癌A549细胞凋亡的主要通路之一。

蟾蜍灵诱导NB4细胞凋亡及其分子机制的初步探讨

目的:了解蟾蜍灵(bufalin)诱导对急性早幼粒细胞白血病(APL)细胞株NB4的增殖抑制和诱导凋亡作用及其分子机制。方法:以急性早幼粒细胞白血病细胞株NB4细胞为研究对象,应用细胞计数、形态学分析、电镜以及RT-PCR手段,观察蟾蜍灵对NB4细胞的作用。结果:蟾蜍灵以时间、剂量依赖的方式抑制NB4细胞的增殖,并诱导NB4细胞凋亡,同时有效降低NB4细胞中Survivin基因的表达。结论:蟾蜍灵诱导NB4细胞凋亡过程中其可能的分子机制是与Survivin基因表达下调有关。

RP-HPLC法测定大鼠血清中蟾蜍灵浓度

目的:建立反相高效液相色谱法测定大鼠血清中蟾蜍灵浓度。方法:血清样品用乙醚-乙酸乙酯(5:1)提取两次,40℃水浴氮气吹干,残留物用甲醇溶解后进样。色谱柱为Shim-pack VP-ODS柱(4.6 mm×150mm,5 μm),流动相为甲醇-水(70:30),流速1.0 mL·min～1,紫外检测波长298 nm,柱箱温度30℃。内标物为华蟾酥毒基。结果:本法最低检测浓度为0.05μg·mL～1,线性范围为0.1-1.6μg·mL-1,r=0.9977。日内精密度RSD小于4%,日间RSD小于10%,蟾蜍灵的萃取回收率为84.0%。结论:本法快速、准确、灵敏,可用于蟾蜍灵的体内药物动力学研究。

蟾蜍灵联合奥沙利铂对胃癌MGC803细胞增殖抑制及凋亡的影响

目的研究蟾蜍灵联合奥沙利铂诱导人胃癌细胞株MGC803凋亡及对凋亡因子Bax、Bcl-2的影响。方法应用MTT法检测不同浓度蟾蜍灵及奥沙利铂单药及联合对胃癌细胞MGC803增殖抑制作用;流式细胞术分析细胞凋亡和周期阻滞;Western印迹法检测Bax、Bcl-2蛋白的表达。结果 (1)蟾蜍灵及奥沙利铂单药均抑制MGC803细胞增殖,呈剂量时间依赖效应,且联合用药的细胞增殖抑制率高于单药组,差异有统计学意义。24、48 h及72 h联合指数(CI)分别为0.693、0.596、0.481;(2)药物作用细胞24 h,流式细胞仪检测10 nmol/L蟾蜍灵及10μg/ml奥沙利铂凋亡率分别为2.9%及4.3%,联合用药组为14.13%,与单药组对比有统计学差异;(3)Western印迹结果显示,蟾蜍灵、奥沙利铂单用于胃癌细胞24 h后,Bax及Bcl-2表达无明显变化,而联合组Bax蛋白表达上调到对照组145.94%,Bcl-2蛋白下调到对照组57.14%。结论蟾蜍灵联合奥沙利铂协同诱导胃癌MGC803细胞凋亡,且可能与下调Bcl-2、上调Bax蛋白有关。

蟾蜍灵在诱导K562细胞凋亡过程中下调TOPO-Ⅱα蛋白表达

目的探讨蟾蜍灵(bufalin)诱导K562细胞凋亡的分子机制。方法用流式细胞仪和形态学检测细胞凋亡;用免疫组化SP法检测TOPO-Ⅱα蛋白表达。结果蟾蜍灵在诱导K562细胞凋亡过程中,下调TOPO-Ⅱα蛋白表达;细胞外信号转导激酶抑制剂(extra-cellularsignal-regulatedkinase,ERK)PD98059能协同蟾蜍灵下调TOPO-Ⅱα蛋白表达;而四癸酰佛波酯(TPA)却拮抗蟾蜍灵的作用。结论蟾蜍灵诱导K562细胞凋亡可能与抑制ERK信号途径以及下调TOPO-Ⅱα蛋白表达有关。

蟾蜍灵诱导人胃癌SGC7901细胞自噬与凋亡的研究

目的:探讨自噬在蟾蜍灵(bufalin)诱导人胃癌SGC7901细胞死亡中的作用。方法:不同浓度的bufalin处理人胃癌SGC7901细胞,采用MTT法检测bufalin对SGC7901细胞增殖的抑制作用。透射电镜观察给药后SGC7901细胞的自噬现象;流式细胞术检测细胞凋亡。Western blot检测自噬标志LC3蛋白表达。结果:Bufalin对胃癌SGC7901细胞生长有显著的抑制作用,且此作用呈明显的时间-剂量依赖性。Bufalin给药后可诱导SGC7901细胞发生自噬;并且在bufalin给药前用氯喹阻断自噬明显提高了bufalin对SGC7901的细胞毒性(P<0.05)。结论:Bufalin能明显抑制SGC7901细胞的生长,并且诱导其发生保护性自噬。Bufalin和自噬抑制剂的联合应用可能为胃癌治疗提供新的策略。

蟾蜍灵对宫颈癌细胞的增殖抑制作用及其机制研究

背景与目的:宫颈癌仍然是妇科肿瘤致死病因的第二位,部分原因为化疗耐药。蟾蜍灵是传统中药蟾酥的成分之一,目前在国内广泛应用于肿瘤的治疗中。该研究旨在探讨蟾蜍灵对宫颈癌细胞ME180和C33A的增殖抑制作用及相关机制。方法:采用CCK8(cell counting kit-8)法检测蟾蜍灵对宫颈癌细胞增殖的抑制作用,采用葡萄糖检测分析试剂盒(glucose assay kit)进行细胞内糖代谢检测分析,采用实时荧光定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,q RT-PCR)检测细胞内葡萄糖转运蛋白1(glucose transporter1,GLUT1)和己糖激酶2(hexokinase 2,HK2)的m RNA的表达水平,采用蛋白[质]印迹法(Western blot)检测原癌基因C-MYC和缺氧诱导因子1α(Hif-1α)表达的变化。结果:CCK8法结果显示,蟾蜍灵能明显抑制宫颈癌细胞ME180和C33A细胞增殖(P=0.027,P=0.018)。糖代谢检测结果显示,蟾蜍灵处理组葡萄糖代谢水平显著降低(P=0.034,P=0.036)。q RT-PCR检测结果显示,蟾蜍灵处理组糖代谢相关指标GLUT1(P=0.019,P=0.016)和HK2(P=0.039,P=0.041)的表达水平明显下调。Western blot检测结果显示,蟾蜍灵处理后宫颈癌细胞内C-MYC和Hif-1α蛋白表达水平显著下调。结论:蟾蜍灵可以通过降低宫颈癌细胞ME180和C33A糖代谢水平,从而抑制细胞增殖。

蟾蜍灵抑制Raf/MEK/细胞外信号调节激酶信号通路活化影响人食管鳞癌细胞增殖及迁移机制研究

目的探讨蟾蜍灵通过抑制人食管鳞癌细胞Raf/MEK/细胞外信号调节激酶(ERK)信号通路的活化从而影响人食管鳞癌细胞增殖及迁移的作用机制。方法培养人食管鳞癌细胞株TE13,分为对照组、不同浓度蟾蜍灵组(蟾蜍灵10 nmol/L组、蟾蜍灵25 nmol/L组、蟾蜍灵50 nmol/L组、蟾蜍灵100 nmol/L组)、UO126组和蟾蜍灵100nmol/L+UO126组,采用Western blotting方法和免疫细胞化学方法分别检测各组Raf-1、磷酸化Raf-1(p-Raf-1)、MEK、磷酸化MEK(p-MEK)、ERK、磷酸化细胞外信号调节激酶(p-ERK)表达量和阳性表达率。划痕实验和Boyden小室实验检测各组细胞的迁移距离和穿过滤膜的细胞数量。结果蟾蜍灵25 nmol/L组、蟾蜍灵50 nmol/L组和蟾蜍灵100 nmol/L组p-Raf-1、p-ERK表达量低于对照组(P<0.05);蟾蜍灵50 nmol/L组和蟾蜍灵100 nmol/L组p-MEK表达量低于对照组(P<0.05);蟾蜍灵100 nmol/L+UO126组p-Raf-1、p-MEK、p-ERK表达量低于UO126组(P<0.05)。蟾蜍灵25 nmol/L组、蟾蜍灵50 nmol/L组和蟾蜍灵100 nmol/L组p-Raf-1、p-ERK阳性表达率低于对照组(P<0.05);蟾蜍灵50 nmol/L组和蟾蜍灵100 nmol/L组p-MEK阳性表达率低于对照组(P<0.05);蟾蜍灵100 nmol/L+UO126组p-Raf-1、p-MEK、p-ERK阳性表达率低于UO126组(P<0.05)。划痕实验结果显示,蟾蜍灵25 nmol/L组、蟾蜍灵50 nmol/L组和蟾蜍灵100 nmol/L组细胞迁移距离短于对照组(P<0.05);蟾蜍灵100 nmol/L+UO126组细胞迁移距离短于UO126组(P<0.05)。Boyden小室实验结果显示,蟾蜍灵25 nmol/L组、蟾蜍灵50 nmol/L组和蟾蜍灵100 nmol/L组穿过滤膜的细胞数量少于对照组(P<0.05);蟾蜍灵100 nmol/L+UO126组穿过滤膜的细胞数量少于UO126组(P<0.05)。结论蟾蜍灵可下调细胞内p-Raf-1、p-MEK、p-ERK表达量,提示蟾蜍灵可能是通过抑制Raf/MEK/ERK信号通路活化这一过程而发挥作用,从而抑制人食管鳞癌细胞的生长。蟾蜍灵对人食管鳞癌细胞株TE13的迁移和趋化运动能力具有明显的抑制作用。