Mitf-M基因突变对猪耳蜗血管纹发育的影响

目的研究Mitf-M基因突变是否会引起血管纹毛细血管、边缘细胞的变化,从而进一步了解Mitf-M基因突变引起Waardenburg综合征的病变机制。方法取出生后7d、10d、30d、40d的野生型和Mitf-M突变型猪共24头,分离解剖耳蜗外侧壁,运用免疫组织化学技术染色,观察野生型和Mitf-M突变型猪耳蜗血管纹毛细血管、边缘细胞在出生后不同时期的免疫荧光的差异。结果 Mitf-M突变型猪与野生型猪在出生后7d、10d及30d,血管纹毛细血管之间没有明显差异,而在40d,Mitf-M突变型猪相对野生型猪的血管纹毛细血管出现明显的减少,并有统计学意义。在7d、40d,Mitf-M突变型猪耳蜗血管纹边缘细胞的细胞骨架均无明显破坏,边缘细胞数量之间没有明显差异。结论 Mitf-M基因突变不引起血管纹边缘细胞骨架的破坏及边缘细胞数量的减少,且Mitf-M突变型猪在出生后早期30d内血管纹毛细血管没有明显变化,在40d后Mitf-M突变型猪较野生型猪的耳蜗血管纹毛细血管出现明显的减少。

小鼠耳蜗血管纹血-迷路屏障免疫组织化学研究

目的利用免疫组织化学、免疫荧光染色及激光共聚焦显微镜技术研究小鼠血管纹组织形态、血-迷路屏障的组成,为耳蜗血管纹血-迷路屏障病理生理学研究提供基础。方法快速分离出完整的小鼠血管纹组织,应用免疫组织化学、免疫荧光染色等方法对血管纹上各层组织、细胞进行标记,利用激光共聚焦显微镜详细观察其形态结构特点,观察血-迷路屏障的组成及形态特点。结果完整解剖出小鼠的血管纹组织呈自然弯曲状态,颜色为半透明淡红色,免疫荧光染色观察三层细胞,边缘细胞呈近圆形的多边形,致密排列,其紧密连接蛋白呈线性分布;基底细胞呈扁长形连成一片;毛细血管网夹于边缘细胞与基底细胞之间贯穿血管纹全程,周细胞伴行血管并包裹毛细血管;中间细胞的血管周巨噬细胞呈树枝样,其足突伸出与微血管壁紧密接触。结论边缘细胞、中间细胞、基底细胞及毛细血管网构成耳蜗血管纹的基本结构,毛细血管内皮细胞、基底膜、周细胞、血管周巨噬细胞通过细胞间的紧密连接共同组成血-迷路屏障。

耳蜗血管纹的发育及异常所导致的耳聋疾病

血管纹位于耳蜗中阶外侧壁，是维持耳蜗内环境稳定和内淋巴电位的器官。

耳蜗血管纹细胞离子转运的研究进展

本文综述了哺乳类动物耳蜗血管纹细胞的离子转运、内淋巴液生成以及耳蜗内淋巴电位产生的主要机制。详细阐述了每一种离子转运蛋白的作用,讨论了耳蜗血管纹中钾离子循环、氯离子循环和盐的平衡,以及这些平衡得以维持的机制。

刺五加注射液拮抗庆大霉素所致豚鼠耳蜗血管纹细胞凋亡的实验研究

目的研究刺五加注射液是否对庆大霉素所致耳蜗血管纹细胞凋亡具有拮抗作用并探讨机制。方法设立正常对照组、庆大霉素组、刺五加注射液组、庆大霉素+刺五加注射液组,连续10 d用药后观察4组实验动物耳蜗血管纹细胞caspase-3的表达与凋亡情况。结果用药后庆大霉素组血管纹细胞caspase-3的表达显著增高,与刺五加注射液组和正常对照组相比差异显著;通过脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记技术(Tunel)检测血管纹细胞发现正常对照组、刺五加注射液组均无Tunel染色阳性细胞,庆大霉素组血管纹细胞存在Tunel染色阳性细胞,与正常对照组和刺五加注射液组相比差异明显。结论庆大霉素作用下可使血管纹细胞发生过度凋亡,刺五加注射液可以降低血管纹细胞caspase-3的表达、抑制血管纹细胞凋亡,达到防治耳聋的作用。

EGb761减轻大鼠内耳血管纹损伤的实验研究

目的观察大鼠噪声暴露后其耳蜗电生理与血管纹细胞超微结构的改变,探讨使用银杏叶提取物(EGb761)后减轻血管纹损伤的保护作用的机制。方法实验组大鼠噪声暴露后腹腔注射EGb761,对照组动物噪声暴露后注射等量生理盐水,于处理前后对两组的听力及透射电镜所见耳蜗血管纹结构加以比较。生化检测耳蜗血管纹组织超氧化物歧化酶(superoxide dimutase,SOD)活性及丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量。结果实验组的听力损失明显小于对照组(P<0.05);耳蜗透射电镜观察发现,对照组血管纹边缘细胞核周间隙明显增宽,核异染色质明显边集,线粒体水肿,嵴断裂或消失,部分空泡化。实验组耳蜗细胞损伤明显轻于对照组。两组SOD、MDA检测差异有显著性。结论大鼠噪声暴露后应用EGb761能降低ABR阈移,其机制可能是清除氧自由基,保护血管纹细胞,从而减轻噪声性耳蜗损伤。

大鼠耳蜗血管纹边缘细胞原代培养及心钠素的表达

目的探讨心钠素(atrial natriuretic peptide,ANP)在原代培养大鼠耳蜗血管纹边缘细胞(marginal cell,MC)中是否表达。方法应用细胞培养技术原代培养MC,并进行鉴定、纯化,应用免疫细胞化学和逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测原代培养的MC中ANP及其mRNA的表达情况。结果培养细胞经免疫细胞化学检测其CK-18蛋白表达阳性,证明其为上皮来源的MC。免疫细胞化学检测在原代培养的边缘细胞胞体内发现ANP免疫反应阳性颗粒,RT-PCR方法扩增出编码ANP的目的条带。结论本实验表明原代培养的边缘细胞具有合成和分泌ANP的能力,提示边缘细胞在维持内耳微环境稳定方面具有调节作用。

耳蜗血管纹血-迷路屏障病理生理学研究进展

血管纹和螺旋韧带位于耳蜗中阶外侧壁,其中血管纹的血-迷路屏障(blood-labyrinth barrier,BLB)是高度分化的毛细血管网,用于调控耳蜗血液和细胞间液的物质交换。此屏障保护内耳不接触来自血液的有毒物质,并且选择性的透过离子、液体及营养物质至耳蜗。血-迷路屏障对维持耳蜗内稳态有重要的作用。血迷路屏障结构上包括血管纹微血管内皮细胞(endothelial cells,ECs)、周细胞(pericytes,PCs)、血管周围巨噬细胞样黑色素细胞(perivascular resident macrophage-like melanocytes,PVM/Ms)、基膜(basement membrance,BM)、复杂的紧密连接和黏合连接。ECs、PCs和PVM/Ms间的作用,类似于细胞间信号传导,对控制血管渗透性及为听功能提供适宜的环境起着至关重要的作用。在遗传缺陷、炎症、声损伤以及衰老的病理条件下,血-迷路屏障各组份间正常的相互作用遭到破坏,进而导致其通透性增加,引发听力障碍。

耳蜗毛细胞与血管纹的相互依存关系的研究

目的通过对Atoh1条件基因敲除小鼠及Mitf基因突变小鼠两个动物模型的研究,来验证毛细胞及血管纹两者的存活是否相互依赖,以及在内耳中是否存在钾离子从血管纹—毛细胞—支持细胞—血管纹循环通路。方法分别对一月龄两种模型小鼠进行ABR、CM、CAP和EP的测量。并用免疫组化和共聚焦显微镜以及耳蜗铺片、切片对两种模型小鼠的耳蜗Corti’s器和血管纹进行形态学观察。结果内淋巴的缺损可造成外毛细胞的凋亡,但内毛细胞依然能够存活。20 mV的内淋巴电位是外毛细胞存活所必须的。血管纹的生存及功能并不需要功能正常的Corti’s器的支持,同时内淋巴电位的产生及维持并不依赖毛细胞及支持细胞的钾离子循环的支持。结论成熟毛细胞的存活依赖于正常的血管纹功能和内淋巴的离子环境。然而,血管纹的存活及功能却并不依赖Corti’s器的功能。

血管纹、螺旋突及螺旋韧带的超微结构特点

用铺片法测得4只豚鼠的平均血管纹长度为21.11mm,基底膜长度为19.90mm,血管纹宽度顶圈为0.44mm,蜗底回为0.86mm。8只豚鼠的左、右耳分别用扫描、透射电镜观察血管纹、螺旋突、螺旋韧带的超微结构特点。电镜下观察到血管纹顶区有多量囊泡,有的开口于内淋巴,大量突起呈褶样,其中充满小液泡,有丰富毛细血管网,周为细胞突起紧密围绕,表明具分泌和吸收内淋巴的结构特征。血管纹与螺旋韧带、螺旋突间的细胞连接形成一有效的屏障。本实验未证实色素颗粒对机体耐受声刺激的作用。

线粒体毒素诱导突发性耳聋模型血管纹损伤机制的研究

目的研究线粒体毒素诱导豚鼠突发性耳聋模型血管纹损伤的机制。方法20只杂色豚鼠随机分为3-硝基丙酸(3-NP)组和磷酸盐缓冲液(PBS)对照组,分别经圆窗膜给予0.3 mmol/L 3-NP或PBS 10min。分别检测两组豚鼠的听性脑干反应测听(ABR),血管纹丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)及边缘细胞超微结构变化。结果与PBS对照组相比较,3-NP组ABR阈移增大、幅值减小;血管纹MDA含量增高(P<0.05),SOD活性降低(P<0.05);边缘细胞超微结构改变,尤以线粒体肿胀,空泡变最为显著。结论线粒体毒素通过氧化应激反应损伤突发性耳聋豚鼠的血管纹。

丹参在防治顺铂耳毒性中对豚鼠耳蜗血管纹的作用

目的探讨丹参在防治顺铂耳毒性中对豚鼠血管纹的作用。方法将 1 8只豚鼠随机分成 3组 ,对照组连续 5d腹腔注射生理盐水 2ml/ (kg·d) ,丹参组连续 7d肌注丹参 8g/ (kg·d) ,第 3d时加腹腔注射顺铂 2ml/(kg·d) ,观察豚鼠的一般状况和耳廓反应。应用电反应测听仪测试听觉阈值 ,应用激光多普勒探测耳蜗血流的变化 ,并铺片观察血管纹的改变 ,统计学处理。结果丹参组豚鼠实验后一般情况较顺铂组明显减轻 ,除 3只豚鼠耳廓反应迟缓外 ,余反应灵敏 ,听觉阈值为 (32 .5± 7.5 )dB ,耳蜗底转血流测试为 1 5 5 .8mV ,与对照组相比均无显著性改变 (P <0 .0 1 )。耳蜗铺片显示红细胞聚集及血管扩张程度较轻 ,偶尔可见到细胞碎片及溶解 ,未见血池现象。结论丹参通过改善血管纹功能 。

机械敏感性钾通道TREK-1在耳蜗血管纹内皮细胞的表达

目的研究机械敏感性钾通道TREK-1在大鼠耳蜗血管纹血管内皮细胞的表达情况,探讨其在内耳血流局部调节的作用与意义。方法原代培养Wistar大鼠血管纹血管内皮细胞并进行传代纯化,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)与免疫荧光分别检验TREK-1在此传代细胞mRNA转录及蛋白水平上的表达。结果RT-PCR特异性扩增出TREK-1cDNA片段,细胞免疫荧光呈阳性反应。结论大鼠耳蜗血管纹血管内皮细胞有机械敏感性钾通道TREK-1表达,推断与耳蜗局部血流调节有关。

老龄豚鼠耳蜗血管纹NOS活性与电生理关系研究

本文采用ＮＡＤＰＨｄ组织化学、图象分析及听觉电生理技术，研究豚鼠衰老过程中血管纹一氧化氮合酶（ＮＯＳ）活性的变化与蜗内电位（ＥＰ）及复合动作电位（ＣＡＰ）的关系，探讨ＮＯＳ在老年性聋发病过程中的可能作用。结果发现，３月龄豚鼠ＥＰ值最大，为８６３２±３２４ｍＶ，随着豚鼠的衰老ＥＰ值逐渐下降，ＣＡＰＮ１波振幅的变化规律与ＥＰ的变化规律一致。ＣＡＰＮ１波潜伏期有逐渐延长的趋势。组织化学染色表明，ＮＯＳ阳性反应主要位于血管纹边缘细胞的胞浆内，随着豚鼠的衰老，血管纹ＮＯＳ阳性反应逐渐减弱，除２周龄组外，ＮＯＳ活性与ＥＰ及ＣＡＰＮ１波振幅有正相关趋势。结果提示，耳蜗血管纹ＮＯＳ可能参与内耳微循环及微环境稳定的调节。

大鼠血管纹边缘细胞的原代培养及IsK的表达

目的 为进一步研究内淋巴生成的可能机制以及影响因素,提供可供研究的大量实验材料—边缘细胞(marginal cell, MC),建立大鼠来源的MC 的原代培养体系。方法 利用大鼠耳蜗的侧壁组织作为组织块种植培养。从第2天开始每日倒置显微镜观察,选特征性的表现照相。经选择性消化、差异性贴壁等方法抑制FLC 生长,纯化MC。经过MC 的形态、生长特征的观察;细胞角蛋白18、波形蛋白的免疫细胞化学;扫描及透射电镜;RT-PCR 检测IsK 蛋白mRNA 的表达等方法鉴定MC。 结果 新鲜组织块淡黄、透明,可见丰富的毛细血管网;但血管纹结构致密,倒置显微镜下不易分辨不同细胞的轮廓。MC 从组织块迁移出来多在培养第2 天,呈多角形外观、核大而圆、颜色较暗淡,细胞之间连接紧密,形成上皮单层时呈“铺路石样”外观。FLC 呈梭形,呈“鱼群样”包绕MC 生长,增殖速度快于MC。由纯化的MC 构成的上皮单层表面可见由成百上千个MC 包绕液体而成的dome,这提示MC 净向的跨上皮转运功能。原代MC 表达细胞角蛋白和波形蛋白,微绒毛丰富、细胞间连接提示其上皮起源。IsK 蛋白mRNA 的表达证实了培养上皮细胞的MC 起源。结论 离体培养的耳蜗边缘细胞具有与其在体相同的形态及生理特征。MC 原代培养体系的建立,可为进一步探讨边缘细胞的生?

川芎嗪对庆大霉素耳中毒耳蜗外毛细胞和血管纹的保护作用

目的 探讨在庆大霉素 (gentamycin ,GM )耳中毒情况下 ,川芎嗪 (tetramethylpyrazine,TMP)对豚鼠耳蜗外毛细胞和血管纹边缘细胞的保护作用。方法 12只豚鼠随机分为GM组、联合用药组、TMP组及对照组 ,用药十天后处死 ,采用透射电镜观察耳蜗外毛细胞及血管纹边缘细胞超微结构 ,扫描电镜观察血管纹边缘细胞表面形态。结果 透射和扫描电镜显示 ,联合用药组外毛细胞及血管纹边缘细胞超微及表面结构破坏均明显轻于庆大霉素组 ,特别是其中的线粒体结构破坏与数目减少更显著轻于庆大霉素组。结论 川芎嗪具有保护庆大霉素耳中毒耳蜗外毛细胞和血管纹结构的作用 。

豚鼠耳蜗血管纹黑色素的分布及其合成

目的 观察豚鼠耳蜗血管纹中黑色素和酪氨酸酶的分布特征 ,进而了解血管纹黑色素的合成。方法 对 12只杂色豚鼠 ,分别在光镜和电镜下观察血管纹中黑色素和酪氨酸酶的分布及其超微结构特征。结果 黑色素主要分布于豚鼠血管纹中间细胞内 ,基底细胞含少量黑色素 ,边缘细胞内无黑色素分布。酪氨酸酶分布于中间细胞Golgi体的分泌面和GERL囊泡 ,边缘细胞和基底细胞内无酪氨酸酶分布。结论 杂色豚鼠血管纹中间细胞为黑素细胞 ,能主动合成黑色素 ,而边缘细胞和基底细胞不能合成黑色素。

豚鼠耳蜗血管纹边缘细胞钾离子通道特性的研究

目的研究单个豚鼠耳蜗血管纹边缘细胞的基本电生理特性。方法应用耳蜗血管纹组织块培养技术和全细胞膜片钳技术,观察单个培养的豚鼠血管纹边缘细胞在电压钳模式下的电流特性。结果边缘细胞上记录到钾离子电流,该钾通道有以下特性:①具有电压依赖性;②通道的活动可被4-氨基吡啶(4-aminopyridine,4-AP)和四乙铵(tetraethylammonium,TEA)在相对高浓度下阻滞;③细胞外钙离子浓度的减少可导致该钾通道电流的降低。结论豚鼠耳蜗血管纹边缘细胞钾离子通道电流包括钙离子依赖性钾电流、外向延迟整流钾电流和A型钾电流。