嵌杯病毒主要衣壳蛋白的研究进展

嵌杯病毒(calicivirus)是无囊膜的单股正链RNA病毒,具有广泛的宿主范围因而严重威胁着人和许多其他脊椎动物的健康。由于该病毒种属流行株多变、极易传播且呈现区域性感染,致使全球范围内因杯状病毒引起的公共卫生疾病频繁暴发,近年来,其感染发病率呈明显增加的趋势。不同属成员虽然感染不同种类的宿主,但其主要衣壳蛋白的结构类似。嵌杯病毒主要衣壳蛋白中含有免疫原性关键区域,能与宿主受体结合并可能介导感染过程,且氨基酸相关的免疫原性及受体结合位点的变异是公认的病毒进化的驱动力。本文就嵌杯病毒主要衣壳蛋白的基因组结构、免疫原性、受体结合情况以及遗传演化规律等方面的研究进展进行综述,以期为后续科学研究以及该病的有效防控提供参考。

大口黑鲈虹彩病毒主衣壳蛋白单克隆抗体制备与抗原表位鉴定

以大口黑鲈虹彩病毒(Largemouth bass iridovirus,LMBV)主衣壳蛋白(Major capsid protein,MCP)为检测靶蛋白,利用原核表达系统表达MCP重组蛋白并免疫BALB/c小鼠,将免疫小鼠脾B淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞(SP/20)融合,经亚克隆筛选、小鼠腹腔接种、收集腹水等过程获得单克隆抗体;利用免疫印迹技术对所制备的单克隆抗体免疫识别的特异性以及其识别的抗原表位进行研究分析,为研制适于养殖现场快速检测LMBV的胶体金检测试纸条奠定基础。结果表明,获得了1株单克隆抗体2C9-6。特异性分析结果显示,单克隆抗体2C9-6可以特异性识别真核表达的LMBV-MCP和LMBV病毒颗粒。抗原表位分析结果表明,单克隆抗体2C9-6识别LMBV-MCP的抗原表位位于LMBV-MCP蛋白N端第1—20位氨基酸。

新型鹅星状病毒衣壳蛋白原核表达及多克隆抗体制备

为了研制针对新型鹅星状病毒(GAstV)的血清学检测方法和高效抗体,克隆新型GAstV HNZZ-4毒株的ORF2基因序列,构建pET-32a-Cap重组质粒,进行衣壳蛋白(Cap)原核表达;用重组Cap蛋白免疫兔只制备多克隆抗体,并采用Western blot和免疫过氧化物酶单层试验鉴定制备的多克隆抗体的反应原性。结果表明,重组质粒pET-32a-Cap经限制性内切酶NdeⅠ和XhoⅠ进行酶切后,得到大小约5000 bp和750 bp的2个与预期一致的条带;阳性重组质粒测序结果显示,成功构建了重组表达载体pET-32a-Cap;pET-32a-Cap原核表达获得了分子质量约为27.5 ku的GAstV重组Cap蛋白;制备的兔抗GAstV Cap多克隆抗体能够与重组Cap蛋白发生特异性反应,且能特异性结合感染LMH细胞的GAstV。综上,制备的兔源抗新型GAstV Cap多克隆抗体保留了抗原性,特异性较好。

表达鸭坦布苏病毒衣壳蛋白的重组腺病毒载体构建与鉴定

为构建鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus,DTMUV)衣壳蛋白的复制缺陷型人5型腺病毒(Ad5)为载体的重组腺病毒,研究通过一步克隆技术将DTMUV Capsid基因插入到含有结核分枝杆菌的热休克蛋白70(mHsp70)为佐剂的pShuttle-CMV-Hsp70质粒中,构建能够表达DTMUV Capsid和mHsp70蛋白的重组穿梭质粒pShuttle-DTMUV Capsid,并与含有pAdEasy-1腺病毒骨架载体的大肠杆菌BJ5183感受态细胞进行同源重组,获得重组腺病毒质粒pAd-DTMUV Capsid。载体质粒经Pac I酶切线性化后转染至HEK 293A细胞,包装重组腺病毒rAdv-DTMUV Capsid。结果显示,rAdv-DTMUV Capsid在病毒传代过程中目的基因稳定存在,且病毒滴度可达2.3×10^(8)PFU/mL。Western blot等结果表明rAdv-DTMUV Capsid在HEK 293A细胞中表达了DTMUV特异性蛋白Capsid。DEF细胞感染试验证明rAdv-DTMUV Capsid可感染鸭源细胞,且诱导IFN-α、IL-10和IL-17 mRNA表达。结果表明,研究成功制备表达DTMUV Capsid蛋白的重组腺病毒rAdv-DTMUV Capsid,能引起细胞免疫反应,可作为一种候选疫苗。

基于重组核衣壳蛋白的猪德尔塔冠状病毒间接ELISA检测方法的建立

目的:建立一种关于猪德尔塔冠状病毒(Porcine Deltacoronavirus, PDCoV)抗体的检测方法。方法:对猪德尔塔冠状病毒的核衣壳蛋白(N)进行原核表达,通过Western Blot、SDS-PAGE等方法,对重组蛋白进行鉴定;在获得正确表达的重组蛋白后,以此为抗原,对ELISA反应条件进行优化,并对其特异性、敏感性、重复性进行测试,最终建立ELISA检测方法,并对临床样品进行检测。结果:优化后的抗原包被浓度为2μg/孔,37℃孵育1 h;1%BSA 37℃封闭1 h;一抗稀释最佳浓度为1∶1 600,孵育时间为1 h;酶标二抗最佳孵育时间为60 min。重组蛋白能与猪德尔塔冠状病毒血清发生特异性反应,所建立的检测方法具有优良的敏感性、特异性、重复性。结论:本研究建立了一种针对猪德尔塔冠状病毒的间接ELISA检测方法,为猪德尔塔冠状病毒的抗体水平检测及疾病的防控提供了一种有效的方法。

靶向冠状病毒核衣壳蛋白NTD-RNA位点的小分子抑制剂虚拟筛选

核衣壳蛋白(Nucleocapsid Protein,N蛋白)是冠状病毒(CoVs)家族保守的结构蛋白,其N端结构域(NTD)与病毒RNA结合形成核糖核蛋白复合物(RNP),参与病毒复制与组装,已被认定为重要的抗冠状病毒药物靶点。以NTD-RNA结合位点为靶点,针对小分子片段库,开展基于计算机辅助药物设计方法的N蛋白抑制剂虚拟筛选。方法:建立基于受体结构的药效团模型,利用特征元素和测试集分子匹配程度选择最优模型,并运用基于受体和基于配体的方法以检验模型的可靠性。对小分子片段库进行基于Lipinski五规则、药效团模型和分子对接的虚拟筛选,筛选出可以干扰NTD与RNA结合的潜在N蛋白抑制剂。结果最佳药效团模型包含两个疏水特征和两个氢键受体,并筛选出药效团模型匹配值高、对接得分值排序靠前且结构新颖的2个化合物。结论:所筛选出的2个化合物可作为潜在的抑制剂以用于后续研究。

猪流行性腹泻病毒核衣壳蛋白的研究进展

猪流行性腹泻病毒(PEDV)是猪流行性腹泻(PED)的病原,PEDV可导致猪的急性腹泻、脱水甚至死亡。PEDV最早在1971年被报道,如今,它已成为引起仔猪腹泻的最常见病原体之一,对我国养猪行业造成极大的经济损失。核衣壳(N)蛋白是PEDV主要的结构蛋白质之一。本文对PEDV N蛋白的核定位信号、生理功能、与宿主细胞互作和检测方法四个方面的研究进展综述,以期能对N蛋白的了解更够更加深入,并为PED防控提供参考作用。

稳转oHSV2主要衣壳蛋白VP5人宫颈癌细胞系的构建

为建立稳定表达溶瘤Ⅱ型单纯疱疹病毒主要衣壳蛋白(VP5)的人子宫颈癌HeLa-VP5细胞系,探究VP5蛋白是否调控自然杀伤细胞(NK)的细胞毒性。运用piggyBac转座系统,通过lipofectamine 3000^(TM)脂质体转染法,将pPBDP-UL19和pSPBT质粒转入HeLa细胞,利用嘌呤霉素(Puro)筛选稳定细胞株,用有限稀释法得到单克隆细胞,利用western blot鉴定HeLa-VP5细胞系中VP5蛋白的表达,以及利用流式细胞术检测HeLa-VP5中GFP的表达,最后实时监测法比较改造前后细胞系的生长活性变化。通过嘌呤霉素抗性筛选和有限稀释挑取单克隆,获得3株HeLa-VP5单克隆细胞;western blot鉴定发现3株HeLa-VP5细胞系VP5蛋白均有表达;流式检测单克隆细胞系GFP阳性率均达到99%;活细胞实时监测法检测发现HeLa-VP5细胞系与亲本细胞HeLa细胞具有一致的生长活性。HeLa-VP5稳转细胞系构建成功,作为评估VP5蛋白是否调控自然杀伤细胞(NK)细胞毒性的靶细胞,为揭示oHSV2发挥抗肿瘤作用机制提供理论基础。

《烟草花叶病毒衣壳蛋白核酸干扰素母药》等14项团体标准正式发布

根据《中国农药工业协会团体标准管理办法》的相关规定,中国农药工业协会批准T/CCPIA 241-2024《烟草花叶病毒衣壳蛋白核酸干扰素母药》等14项团体标准,其中产品类标准10项,管理类标准4项。标准2024年4月15日发布,自2024年4月15日起实施。现予公告。

猪圆环病毒3型核衣壳蛋白多肽抗体间接ELISA检测方法的建立及应用

旨在建立检测猪圆环病毒3型(Porcine circovirus type 3,PCV3)血清抗体的间接ELISA方法以及摸清广西地区PCV3的流行情况。试验以PCV3的核衣壳蛋白多肽作为包被抗原,通过对包被抗原的最佳工作浓度、血清稀释度、封闭剂、酶标抗体工作浓度及作用时间、底物反应时间,阴性和阳性判断标准,敏感性、特异性及重复性等进行研究,建立了检测PCV3间接ELISA方法。随后,应用建立的方法检测2021—2023年广西地区采集的912份猪血清中PCV3抗体存在的情况。抗原最佳包被量为1.25μg/孔、血清稀释度为1∶800、封闭剂为5%的脱脂奶粉、酶标抗体工作浓度为1∶10000、二抗作用时间为60 min、底物反应时间为15 min。阴性和阳性判断标准OD_(450)≥0.55,为阳性;OD_(450)≤0.48,为阴性;当0.48<OD_(450)<0.55时,为疑似阳性,需对疑似样品再次检测。该方法与猪圆环病毒2型(PCV2)、猪瘟(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征(PRRSV)和伪狂犬病(PRV)等病毒抗体无交叉反应。批内与批间重复性试验的变异系数分别低于5%与8%,说明基于PCV3核衣壳蛋白多肽建立的间接ELISA方法具有良好的敏感性、特异性及重复性,检测方法稳定可靠。利用所建立的方法进行血清学调查时发现,广西地区PCV3抗体阳性率达到36.62%,说明广西地区猪群中PCV3的感染率较高,应引起重视。

猫冠状病毒核衣壳蛋白的可溶性表达与多克隆抗体反应性鉴定

为制备猫冠状病毒(feline coronavirus, FCoV)核衣壳(nucleocapsid, N)蛋白的特异性抗体,本研究将Ⅰ型FCoV(ZJU1709)的N蛋白基因全长c DNA亚克隆到pCold TF原核表达载体上,通过低温诱导表达、镍柱亲和纯化获得可溶性重组N蛋白;进一步以纯化的重组N蛋白为免疫原制备兔多克隆抗血清(多抗血清),再通过酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)、蛋白质印迹法(Western blotting, WB)、间接免疫荧光试验(indirect immunofluorescence assay, IFA)等多种方法对兔多抗血清进行反应性鉴定。结果显示:经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside, IPTG)和低温诱导,成功表达出分子量约为100 kDa的可溶性重组N蛋白,在非变性条件下亲和纯化获得的重组N蛋白质量浓度达到1.4 mg/mL;N蛋白兔多抗血清的ELISA效价可达1×10^(6),与真核表达的重组蛋白Flag-N以及FCoV感染细胞中的N蛋白均具有良好的WB和IFA反应性。交叉反应性结果显示:该多克隆抗体能与α属冠状病毒中不同亚型的FCoV以及犬冠状病毒(canine coronavirus,CCoV)、猪传染性胃肠炎病毒(porcine transmissible gastroenteritis virus,TGEV)、猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)的N蛋白发生反应,但不与β属冠状病毒中的严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome-related coronavirus 2, SARS-CoV-2)和γ属冠状病毒中的传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus, IBV)的N蛋白发生反应。综上所述,以pCold TF原核系统表达的可溶性重组N蛋白具有良好的免疫原性,以该蛋白制备的FCoV N蛋白兔多抗血清能识别多种来自不同物种的α属冠状病毒N蛋白,但与β、γ属冠状病毒N蛋白没有交叉反应性,这为进一步研究FCoV复制机制以及开发高效的抗原和抗体检测技术奠定了基础。

大黄鱼肿大细胞病毒不同毒株的细胞培养及主要衣壳蛋白基因比较

为建立大黄鱼肿大细胞病毒的培养方法,明确其分类地位,用肿大细胞病毒检测呈阳性的大黄鱼幼鱼病料(FD201807和SA201808)肾组织匀浆液感染鳜仔鱼细胞系(mandarin fish fry cell line-1,MFF-1)并连续传代,从病料组织匀浆液和细胞冻融液中提取病毒DNA,克隆病毒主要衣壳蛋白基因(mcp),测序后与NCBI GenBank中的虹彩病毒科肿大细胞病毒属病毒mcp以及2018—2020年所检出的15株大黄鱼肿大细胞病毒mcp进行比对分析。结果显示,病毒传至第4代才可引起MFF-1细胞病变,细胞病变的主要特征为细胞脱壁、变圆、折光度增强;感染时间越长脱壁细胞越多,同时培养液中的颗粒增加;透射电镜下可见感染细胞的细胞质散在大小为130~150 nm的六边形病毒粒子和空壳。感染细胞的病变周期随传代代次的增加而缩短,第15代次的FD201807株感染细胞80%细胞病变的时间为3 d,第15代次的SA201808株感染细胞80%细胞病变的时间为7~8 d。mcp序列比对和聚类分析发现,SA201808株与FD201807株的mcp序列存在21个碱基差异,二者的mcp序列分别与大黄鱼虹彩病毒(largeyellowcroakeriridovirus,LYCIV)LYCIVZhoushan(GenBank:MW139932.1)和花鲈虹彩病毒(Lateolabrax maculatus iridovirus,LMIV)(GenBank:MH577517.1)相近。15株从大黄鱼病料检出的肿大细胞病毒中,12株的mcp序列与SA201808株聚类;3株与FD201807聚类。本研究利用MFF-1细胞系分离培养了大黄鱼肿大细胞病毒,揭示了大黄鱼肿大细胞病毒存在差异,为更好地了解大黄鱼肿大细胞病毒提供了数据参考。

鸭圆环病毒无核定位信号衣壳蛋白的原核表达及其在间接ELISA中的应用

鸭圆环病毒(DuCV)是一种具有长期免疫抑制特性的病原体,其Cap蛋白是DuCV的主要结构蛋白和主要免疫保护抗原,构成病毒的核衣壳,对DuCV的血清学诊断具有重要意义。为了开发出适合DuCV的检测方法,本研究在重组Rosetta大肠杆菌细胞内对无核定位信号的DuCV Cap蛋白进行了表达,建立了基于无核定位信号Cap蛋白检测DuCV血清抗体的间接ELISA方法(Cap-ELISA)。结果:Cap-ELISA包被抗原的最佳浓度为280 ng/孔,血清稀释比为1∶1600;检测样本的阴阳临界值为0.339,灵敏度达到1∶12800,并对DuCV抗体检测具有特异性;与常规PCR方法的符合率为92.7%,用Cap-ELISA对山东部分地区的樱桃谷鸭血清进行了间接ELISA检测,总阳性率为88.9%,说明该方法适合在DuCV血清学诊断中应用。

针对SARS-CoV-2核衣壳蛋白的单克隆抗体的制备和鉴定

目的研制SARS-CoV-2的N蛋白单克隆抗体,并对其特异性识别真核表达N蛋白等特性进行鉴定,为下一步应用奠定材料基础。方法利用大肠杆菌表达并纯化SARS-CoV-2重组N蛋白,制备并筛选分泌N蛋白特异性单克隆抗体的阳性B细胞杂交瘤,制备腹水后利用间接ELISA法测定单抗的效价、亚型和亲和力;通过Western blot、间接免疫荧光试验分析其与原核、真核表达SARS-CoV-2重组N蛋白的特异性结合能力;通过间接ELISA法评价其在不同冠状病毒N蛋白检测中的应用潜力。结果成功地表达和纯化SARS-CoV-2重组N蛋白,筛选获得1株特异性识别重组N蛋白的单克隆抗体并命名为11F4,其亚型为IgG1,腹水效价为2.0×10^(7)以上,亲和力为4.44×10^(8)M^(-1);Western Blot分析表明其能与SARS-CoV-2重组N蛋白特异性反应,间接免疫荧光试验显示其能特异性识别HEK-293T细胞表达的SARS-CoV-2 N蛋白,表明该蛋白免疫反应性良好;间接ELISA法结果表明其可特异性识别真核细胞表达的SARS-CoV-2 N蛋白,而与MERS-CoV和HCoV-229E的N蛋白无交叉反应。结论成功获得可特异性识别细胞表达及体外制备的SARS-CoV-2 N蛋白的单克隆抗体,具备特异性检测SARS-CoV-2的潜能,为下一步研究提供了重要生物材料。

番茄环纹斑点病毒核衣壳蛋白N的RT-LAMP检测方法的建立

番茄环纹斑点病毒(Tomato zonate spot virus,TZSV)属正番茄斑萎病毒属(Orthotospovirus),严重影响番茄、辣椒等作物的产量及经济价值。本研究根据TZSV的核衣壳蛋白N的基因序列设计逆转录环介导等温扩增(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)反应引物,建立了TZSV的RT-LAMP检测方法。结果显示,该方法能够特异扩增TZSV,与侵染辣椒的番茄斑萎病毒和烟草花叶病毒不发生反应;RNA最低检测限为0.01 pg/μL,灵敏度为普通逆转录PCR(RT-PCR)的10倍;田间样品检测应用结果表明,RT-LAMP扩增和可视化检测结果与RT-PCR一致。综上,本研究建立的RT-LAMP快速检测方法可有效应用于TZSV的田间检测。

戊型肝炎病毒基因3型衣壳蛋白与Huh-7细胞互作蛋白的筛选

试验旨在筛选与戊型肝炎病毒基因3型(HEV)衣壳蛋白(ORF2)互作的宿主蛋白,构建ORF2的真核表达质粒,转染肝癌细胞(Huh-7)后进行免疫共沉淀(Co-IP)试验,将产物进行蛋白质谱分析,筛选与ORF2互作的细胞蛋白,并进行生物信息学分析。结果显示,重组质粒pCAGEN-Myc-ORF2在Huh-7中正确表达,据蛋白质谱分析获得了与ORF2互作的37个候选蛋白;生物信息学分析发现,这些蛋白主要参与RNA剪接的调控、细胞质翻译等生物过程,同时也形式参与如钙黏蛋白结合、泛素-蛋白质连接酶等功能,并且影响核糖体合成途径、参与新型冠状病毒感染等。

ARV拮抗宿主天然免疫新机制:内衣壳蛋白σA

禽呼肠孤病毒(ARV)是呼肠孤病毒科正呼肠孤病毒属成员,基因组由10个节段双股RNA组成,该病原在鸡群中流行相当普遍。ARV感染能够引起禽类多种疾病,包括病毒性关节炎、腱鞘炎、矮小综合征、吸收障碍综合征等,其中以病毒性关节炎和腱鞘炎为主要特征。该病原常导致家禽生产性能下降、干扰疫苗免疫效果,是一种家禽重要的免疫抑制性疾病,对我国养禽业危害严重。

SARS-CoV-2核衣壳蛋白的生物信息学分析、纯化及多克隆抗体制备

目的分析新型冠状病毒(SARS-CoV-2)核衣壳(N)蛋白的生物学性质、纯化及多克隆抗体制备。方法NCBI检索感染人的冠状病毒N蛋白氨基酸序列,采用Clustal Omega软件对其进行序列比对。利用SOPMA软件预测SARS-CoV-2 N蛋白的二级结构;应用Pondr和IUPred软件预测SARS-CoV-2 N蛋白的固有无序结构域;运用MoRFchib软件预测SARS-CoV-2 N蛋白的分子识别特征序列;利用IEDB网络分析其B细胞表位。纯化的N蛋白免疫BALB/c小鼠,分离小鼠血清,制备多克隆抗体;ELISA法测定血清中多克隆抗体滴度;MTT法检测N蛋白刺激小鼠脾细胞增殖情况。结果SARS-CoV-2 N蛋白与SARS-CoV N蛋白的同源性高于97%。N蛋白二级结构的无规卷曲占55.13%,α螺旋占21.24%,β折叠占16.71%,β转角占6.92%。N蛋白含有大量固有无序样结构,具有4个分子识别特征序列和11个线性B细胞表位。全长为51.5 kDa N蛋白可诱导BALB/c小鼠分泌高滴度抗体,并能导致淋巴细胞增殖。结论SARS-CoV-2 N蛋白含有大量固有无序结构域并获得了高滴度多克隆抗体。

衣壳蛋白靶向灭活——一种新型抗病毒策略

衣壳蛋白靶向灭活(CTVI)是一种新型抗病毒策略,它是通过将病毒衣壳蛋白与核酸酶(金黄色葡萄球菌核酸酶、核糖核酸酶Barnase、大肠杆菌RNase HI等)的融合蛋白装配到病毒粒子中,使核酸酶接触并降解病毒核酸,从而达到抑制病毒复制的目的。该策略已经在人免疫缺陷病毒、鼠白血病病毒、乙肝病毒、登革病毒等抗病毒研究中取得良好效果,展示了广阔的应用前景。

兔出血症病毒衣壳蛋白VP60基因克隆与序列分析

自感染RHDV致死的兔肝脏组织中提纯病毒 ,提取病毒总RNA ,以RT_PCR方法扩增得到RHDVVP6 0基因全长片段 ,克隆到T载体中 ,经酶切分析及PCR鉴定后进行序列测定。同一毒株不同克隆产物进行 3次测序 ,测序结果已输送到GeenBank中 (注册号为AF45 376 1)。将测得序列与GeneBank中记录的RHDV不同分离株进行比较。比较结果表明 :各毒株间核苷酸的同源性为 91%～ 98% ,氨基酸同源性为 94%～ 99% ,氨基酸变异多发生在高变区 ,进一步证明了毒株的高度保守性 ,为明确我国RHDV地方株VP6 0蛋白的分子特征。