人补体受体1型SCR1-3功能域基因的克隆表达及生物活性鉴定

目的实现人补体受体1型功能域SCR1-3基因的克隆、表达及生物学活性鉴定。方法从人外周血中提取总RNA,通过逆转录获得cDNA,PCR扩增获得编码CR1-SCR1-3基因序列;克隆到毕赤酵母分泌表达质粒pPIC9K,构建重组质粒pPIC9K-CR1-SCR1-3,菌落PCR、双酶切鉴定后测序;线性化重组质粒电转化毕赤酵母KM71基因组中,经菌落PCR技术筛选在G418平板上生长的多拷贝阳性转化子;摇瓶发酵和甲醇诱导,SDS-PAGE和Western-blot鉴定目的蛋白表达;镍柱亲和层析纯化目的蛋白;用体外抑制补体溶血反应实验测定目的蛋白的生物活性。结果获得了人CR1-SCR1-3编码区序列,测序结果与与GenBank中的相应序列一致;SDS-PAGE和Western-blot表明目的基因在毕赤酵母中实现了分泌表达;体外实验证实经纯化后的CR1-SCR1-3能够明显抑制补体溶血。结论成功构建重组表达质粒pPIC9K-CR1-SCR1-3,在毕赤酵母中实现了CR1-SCR1-3的分泌表达,该蛋白具有较高的抑制补体生物活性。

人补体受体1型衍生分子融合基因CR1-SCR2D的构建、表达及生物学活性鉴定

目的构建和表达具有抑制补体生物活性的双功能域人补体受体1型衍生分子CR1-SCR2D。方法基于我室前期工作,将CR1-SCR1-3、人工α螺旋肽段linker、SCR15-17 3个DNA片段依次克隆到改造载体pPIC9k(+)和pPICZαB,构建出表达质粒pPICZαB-CR1-SCR2D;电转化毕赤酵母X-33得到阳性重组子,甲醇诱导目的蛋白CR1-SCR2D表达,SDS-PAGE和Western blot鉴定表达结果;经纯化获得CR1-SCR2D并进行糖基化鉴定后,用CH50和AH50法鉴定目的蛋白在体外抑制补体的生物活性。结果成功构建了目的基因的表达质粒pPICZαB-CR1-SCR2D,基因测序正确;SDS-PAGE和Western blot证实目的基因在毕赤酵母中实现了分泌表达;经镍柱纯化后得到较纯的CR1-SCR2D,糖基化鉴定证明其存在糖基化;CH50法和AH50法结果显示CR1-SCR2D均有较CR1-SCR1-3和CR1-SCR15-17更好的抑制补体生物学活性。结论成功构建了双功能域人补体受体1型衍生分子融合基因CR1-SCR2D,在毕赤酵母中实现了CR1-SCR2D的分泌表达,该融合蛋白对经典/MBL途径及旁路途径补体激活均具有较好的抑制作用。