猪瘟病毒E2基因的定点突变、在大肠杆菌中的高效表达及表达产物的免疫原性

用重组PCR技术对猪瘟病毒石门株E2基因进行了定点突变 ,然后将突变后的基因克隆至表达载体质粒pET 2 8a(+ )中 ,构建成重组质粒pETE2。将pETE2转入受体菌BL2 1(DE3 )plysS中 ,在IPTG的诱导下 ,重组转化菌可高效表达目的基因 ,表达量平均可达菌体蛋白总量的 2 8%。免疫印迹和间接ELISA表明所表达的蛋白是CSFV特异性的。

克螟稻秸秆cry1 Ab基因表达产物对土壤生物学活性的影响

通过实验室条件下的秸秆还土试验 ,比较了转基因克螟稻及其亲本稻秸秆对土壤各微生物生理群的数量、土壤酶活性以及土壤呼吸强度的影响差异。与亲本对照相比 ,转基因克螟稻秸秆的添加对土壤好氧性细菌、放线菌和真菌的数量没有显著性影响 ;土壤氨化细菌、自生固氮菌和纤维素降解菌的数量在培养中期有些差异 ,但差异并不持续 ;对土壤蛋白酶、中性磷酸酶、脲酶和土壤呼吸强度没有显著性影响 ;土壤脱氢酶对转基因克螟稻秸秆的添加极其敏感。转基因克螟稻秸秆处理土壤中脱氢酶的活性在培养的前 9周明显地高于非转基因秸秆处理土壤 (p <0 0 5 )。尽管如此 ,培养 63d后 ,两种秸秆处理土壤脱氢酶活性差异逐渐消失。试验结果表明 。

重组人G-CSF大肠杆菌表达产物的纯化及鉴定

将RT－PCR扩增的人粒细胞集落刺激因子（hG－CSF）结构基因与表达载体pJGW1重组，并在大肠杆菌中高效表达。经SDS－PAGE分析，rhG－CSF表达量占菌体可溶性蛋白的25％以上。将其复性后，经CM52离子交换层析纯化，产物经SDS－PAGE分子量测定、肽谱分析、等电点测定表明与天然hG－CSF具有相同性质。免疫印迹证实rhG－CSF抗原特异性良好。用小鼠骨髓细胞集落形成法测定活性达1×108U／mg。

阿拉伯糖苷酶基因的克隆、表达及表达产物的酶稳定性

阿拉伯糖苷酶 /木糖苷酶是木聚糖类半纤维素生物降解和转化所必需的酶类。本文在国内首次报道对该酶的研究 :通过PCR从产乙醇热厌氧杆菌ThermoanaerobacterethanolicusJW2 0 0克隆出编码高度热稳定性阿拉伯糖苷酶 /木糖苷酶的基因 ,与组氨酸标签融合 ,以高拷贝质粒pAlter Ex1在大肠杆菌中得到高效表达 ;基因表达产物通过热处理和亲和层析柱纯化后 ,酶纯度达电泳均一。纯化重组酶稳定性检测表明 ,得到的阿拉伯呋喃糖苷酶在pH4 .2～ 8.2之间酶活力稳定 ,75℃的半衰期为 1h ;β 木糖苷酶在pH 5 .0～ 8.2之间有较高的稳定性 ,酶 1h半衰期温度为 84℃。

应用GPV VP3基因重组原核表达产物建立检测抗体的ELISA方法研究

利用鹅细小病毒（GPV）VP3基因的原核表达蛋白作为包被抗原建立了检测GPV抗体的间接ELISA及Dot-ELISA方法。经确定两种方法的抗原包被浓度为125μg／mL，其中间接-ELISA 100μL／孔、Dot-ELISA 5μL／点。间接-ELISA中HRP标记的兔抗鹅IgG的工作浓度是1：200，检测血清的最适稀释度是1：400，阳性判定标准为OD492≥0．20，且P／N≥2．0。用此方法检测弱毒疫苗免疫血清，其抗体滴度在1：400～1：51200。Dot-ELISA的结果与间接-ELISA的结果一致。

家蚕抗菌肽CMIV基因结构改造及表达产物的研究

参照天然抗菌肽ＣＭＩＶ组分的氨基酸序列，作了近５０％的改动，根据大肠杆菌偏爱的密码子，设计并人工合成了抗菌肽基因片段．将人工合成的抗菌肽类ＣＭＩＶ基因先重组到测序载体ｐＵＣ１１８上，经过序列分析，发现克隆于载体ｐＵＣ１１８上的基因片段与设计的序列完全一致．再将该基因片段重组到表达载体ｐＥＴ２８（ａ）上，抗菌肽以融合蛋白的形式表达．融合蛋白经镍－金属离子胶亲和层析纯化后，再用ＣＮＢｒ裂解。

转基因植物中外源基因及其表达产物转移的途径

随着转基因植物商品化应用的增多 ,全面了解转基因植物潜在的生态风险性尤为重要。国内外对“转基因植物中外源基因向野生亲缘物种漂移的可能性”、“昆虫对抗虫转基因植物的耐受性”以及“转基因植物对生物多样性的潜在影响”等问题已进行了广泛研究。对转基因植物中外源基因及其表达产物的几种可能转移途径作了概述。着重介绍了“经花粉散布或与野生亲缘物种杂交等途径引起的外源基因转移”以及“转基因植物对土壤生态系统的影响”等方面的研究情况。此外 ,还对“鉴定外源基因及其表达产物存在的方法”进行了简要探讨。

肝再生增强因子的cDNA克隆、表达及表达产物的生物活性研究

以肝部分切除后再生肝组织为起始材料，利用RT-PCR扩增出大鼠肝再生增强因子（ALR），亚克隆于pGEM-T载体，核苷酸序列测定证实为大鼠ALR；将ALRcDNA亚克隆于pBV220质粒，构建了原核表达栽体，并获高效表达菌株，特异表达蛋白占细菌总蛋白的15％，原核表达的ALR在体外缺乏促进大鼠原代培养肝细胞及SMMC-7721肝癌细胞DNA合成的活性，但在体内1／3肝部分切除模型中可刺激肝细胞DNA合成；ALR在生物学活性方面与肝脏刺激物（HSS）存在一定差别，ALR和HSS应是两种不同的活性因子．ALR还具有促肝损伤修复的作用，对其深入研究可能为临床治疗严重肝病提供有效的药物.

传染性法氏囊病病毒主要结构蛋白基因及其表达产物免疫学试验

用传染性法氏囊病病毒（ＩＢＤＶ）ＶＰ２、ＶＰ３重组质粒ＤＮＡ及其大肠杆菌表达产物全菌裂解液油乳剂苗肌肉注射１４日龄仔鸡，免疫后１４和２１ｄ测定血清ＥＬＩＳＡ抗体效价，并于免疫后２１ｄ用ＩＢＤＶ南京野毒株攻击。结果显示：（１）ＶＰ２基因重组质粒ＤＮＡ除可诱导产生较高的ＥＬＩＳＡ抗体外，还可明显降低仔鸡ＩＢＤＶ攻击所引起的急性发病率和死亡率；（２）ＶＰ３－ＧＳＴ融合蛋白表达产物全菌裂解液可较早地诱导产生ＥＬＩＳＡ抗体，但对ＩＢＤＶ野毒株攻击只提供部分保护；（３）ＶＰ２和ＶＰ３表达产物无明显协同作用。

鲮生长激素cDNA的克隆及其重组表达产物的促生长活性

利用RT-PCR技术从鲮脑垂体组织中克隆出生长激素cDNA片段，克隆的mcGH全长567bp，编码由188个氨基酸残基组成的GH成熟肽。构建了表达载体pQE30-mcGH，转化大肠杆菌M15(pREP4)，在初步优化发酵条件的基础上实现了鲮mcGH在大肠杆菌中的高效表达，表达的重组蛋白占菌体总蛋白的32．13％，经westem blotting分析证实所表达的重组蛋白是mcGH。表达产物主要以包涵体的形式存在。重组蛋白变性、复性后，经Nichelating Sepharose亲和层析纯化，SDS-PAGE显示，纯化的mcGH纯度约为94％。纯化的mcGH腹腔注射莫桑比克罗非鱼(Oreochromis mossambicus)，经4周处理后，实验组1和2的体长增长率分别比对照组快9．38％和9．75％，体重增长率分别快23．42％和62．48％。经t检验统计分析表明，表达的重组mcGH具有显著的促罗非鱼生长作用(P<0．05)。

hhlim基因表达产物的亚细胞定位及其在细胞肥大中的意义

hhlim是从胎儿心脏中新近分离和克隆得到的与心脏发生相关的基因 ,其表达产物作为转录因子参与多种基因的转录调控和细胞的发育与分化过程 .用细胞转染方法将外源性hhlim基因导入处于分化过程中的小鼠成肌细胞C2C12 ,发现该基因强制性表达可使C2C12细胞体积明显增大 .RT PCR和蛋白质印迹结果表明 ,hhlim促细胞肥大与诱导α 肌动蛋白 (α actin)过表达及重新启动胚胎基因BNP表达有关 .用绿色荧光蛋白 hhlim融合蛋白表达载体转染处于分化过程的C2C12细胞 ,发现转染不同时间 ,表达产物的亚细胞定位发生动态变化 ,表现为先在胞核和胞质中均有分布 ,而后定位于胞质的变化规律 .应用免疫共沉淀证实 ,hhlim在胞质中以与α actin相互缔合的方式存在 .

花粉特异F-box基因及其表达产物可能参与的SCF途径

泛素蛋白体目标性降解蛋白途径是许多细胞学过程的重要调节体系,底物蛋白泛素化涉及3个酶激反应,其中,作为E3连接酶的SCF复合体对底物的识别是通过亚体F-box蛋白C末端的特异性结构实现的。利用染色体步移等方法,最近在一些配子体型自交不亲和植物S-RNase基因近旁相继发现了一类花粉特异性表达的F-box基因,从而预示泛素介导的SCF蛋白降解途径可能参与配子体自交不亲和反应。

转柞蚕抗菌肽D基因辣椒的目的基因及表达产物检测

应用现代生物技术,从核酸和蛋白质水平对转柞蚕抗菌肽D基因辣椒第4代的目的基因进行了检测。发现所分离的柞蚕抗菌肽D基因与原设计的序列一样;辣椒组织中也含有抑菌物质,经与天然抗菌肽D对比,表明抗菌肽D基因得到了表达。

一种高温酸性α-淀粉酶基因的高效表达和表达产物分析

一种高温酸性α-淀粉酶基因经密码子优化后在巴斯德毕赤酵母中得到了高效表达,表达的重组α-淀粉酶rBD5063具有α-淀粉酶的活性,表达量达到60mg/L.对rBD5063进行了纯化并对多组分的表达产物进行了研究.rBD5063作用最适pH值为5.0,在pH3.5～10.0范围内酶活性保留50%以上,最适温度在105～110℃之间,在90℃下酶活性半衰期约30min.低浓度Ca2+对激活rBD5063活性和维持稳定性是必需的,高浓度对活性会产生轻微抑制作用,Mg2+、SDS和Trition X-100都能够部分抑制rBD5063活性,Cu2+和EDTA严重抑制rBD5063活性.表达产物水解可溶性淀粉主要产物是单糖和低聚寡糖.表达产物包括分子量分别是62、56、44kD的3种活性组分,在通常情况下主要以大分子量活性多聚体的形式存在.重组α-淀粉酶rBD5063不存在N-连接的糖基化,但是存在O-连接的糖基化现象,O-连接对rBD5063的热稳定性和最适温度没有显著影响.

鸡类胰岛素生长因子Ⅰ的克隆、表达及其表达产物的生物学活性研究

应用RT-PCR方法对雏鸡肝脏总RNA中鸡类胰岛素生长因子Ⅰ基因cDNA进行扩增,然后将特异性片段连接到pMD18-T载体,测序结果表明,与已知序列同源性为100%。然后将特异性片段连在pRLC载体上进行表达,经Tricine-SDS-PAGE分析,原核表达产物为7.6kD的重组蛋白,占菌体总蛋白的23%,Western印迹表明重组蛋白具有IGF-Ⅰ抗原活性。表达产物以包涵体形式存在,经7mol·L-1盐酸胍的变性液溶解及0.5mol·L-1精氨酸复性液处理,表达产物随后进行脱盐、凝胶层析纯化、MTT法分析其对NIH3T3和鸡胚成骨细胞的增殖效应,结果表明重组鸡IGF-Ⅰ具有较高的生物学活性。

旋毛虫Ts87基因在大肠杆菌中的表达及表达产物的纯化

目的 为进一步研究和应用旋毛虫Ts87基因 ,本文原核表达了PET - 2 8a(+) /Ts87重组质粒 ,并纯化鉴定了该蛋白。方法 将Ts87基因片段克隆入原核表达载体PET - 2 8a(+) ,形成重组质粒PET - 2 8a(+) /Ts87,转化后经IPTG诱导得到表达蛋白 (约 4 0kDa) ,利用固定化金属离子 (Ni2 + )配体亲和层析纯化目的蛋白 ,进行复性 ,并用兔人工感染旋毛虫血清鉴定表达产物。结果与结论 成功构建了PET - 2 8a(+) /Ts87,SDS -PAGE显示融合蛋白主要以包涵体形式存在 ,经过亲和层析得到纯化的目的蛋白 。

恶性疟原虫FCC1/HN株CSP抗原基因表达产物在小鼠体内的免疫应答研究

目的： 利用ｐｃＤＮＡ３ 质粒作为载体， 在人宫颈癌细胞（ＨｅＬａ 细胞） 中高效表达恶性疟原虫环子孢子蛋白 （ＣＳＰ）， 观察表达产物诱导ＢＡＬＢ／ｃ小鼠免疫的应答水平。方法： 目的基因ＰｆＣＳＰ在ＨｅＬａ 细胞中表达， 将纯化的表达产物免疫接种小鼠， 通过ＥＬＩＳＡ、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ 分析、Ｔ 淋巴细胞增殖实验、ＮＫ 细胞活性检测和Ｔ淋巴细胞亚群测定， 观察其诱导ＢＡＬＢ／ｃ小鼠产生体液免疫和细胞免疫的应答水平。结果： ＥＬＩＳＡ 检测抗体滴度达１∶６ ４００；Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ 结果在３８．３ ｋＤａ 相应位置出现较清晰的显色条带；表达产物能特异刺激小鼠脾淋巴细胞增殖、ＣＤ４＋ 与ＣＤ８＋ 细胞有所增加， 并能提高小鼠ＮＫ细胞活性。结论： 真核表达系统ｐｃＤＮＡ３－Ｐｆ／ＨｅＬａ表达产物能特异刺激小鼠产生体液免疫和细胞免疫的应答，

苏云金芽孢杆菌cry基因在大肠杆菌中表达产物和生物活性

研究了几种Btcry基因于大肠杆菌 (Escherichiacoli)中表达产物在pH 10 0的 5 0mmol/L碳酸钠和 2 0mmol/L乙醇胺溶解液中的溶解性 ,发现同样的Cry蛋白在碳酸钠中的溶解度大于乙醇胺。通过胰蛋白酶消化 ,明确Cry1Ca7、Cry1Ia8酶解产物为 38kD多肽 ;Cry1Ie1、Cry1Cb2、Cry2Ab4酶解产物为 4 1kD多肽 ;Cry1Ac酶解产物为 6 0kD多肽。采用FPLC层析方法对 6种原毒素及其酶解后得到的毒素多肽进行了分离纯化 ,比较了原毒素和毒素的杀虫活性的差异。其结果表明 ,Cry1Ac的原毒素和毒素对棉铃虫初孵幼虫的校正死亡率均为 10 0 % ,Cry2Ab4的原毒素的毒力高于其酶解毒素。

EtMIC-2表达产物对鸡三种艾美耳球虫的保护试验

鸡艾美耳球虫病由隶属顶复门7种艾美耳球虫（E.tenella、E.necatrix、E.acervulina、E.maxima、E.brunetti、E.praecox、E.mitis）引起,常混合感染,有很高的发病率和死亡率,轻者则影响鸡的增重和饲料转化率。微线是顶器的结构之一,位于子孢子和裂殖子前端,EtMIC-2是其50 kDa左右的酸性蛋白,在虫体入侵时表达,该蛋白可能在虫体入侵时起重要作用。用Pet载体经原核表达该蛋白,7、14日龄经口服、肌注不同剂量工程活菌和菌体裂解蛋白二次免疫鸡,免疫后1周用3种艾美耳球虫（E.tenella、E.acervulina、E.maxima）攻虫,发现相对增重率随菌体蛋白含量增加呈现增强趋势,E.tenella攻虫表现最有效的是口服PBS200μg活菌组为96％,E.ac-ervulina、E.maxima分别为96％、87％。从攻虫后7～14 d卵囊排出曲线看,每天排卵囊数和相对卵囊产量均低于红对照;相对卵囊产量,E.tenella攻虫后,口服PBS 200μg活菌组最低,为17％,E.acervulina、E.maxima攻虫后,口服PBS 200μg裂解菌组最高,分别为90％、93％。从增重与卵囊产量来看,EtMIC-2对E.tenella、E.ac-ervulina和E.maxima这3种球虫有一定的免疫保护作用,尤其口服200μgPBS活菌时,对E.tenella保护作用最明显。说明来源于E.tenella子孢子的Etmic-2基因的表达产物对E.tenella、E.

Sj28GST基因克隆和高效表达产物的纯化

目的 从日本血吸虫中国大陆株成虫cDNA文库中克隆 2 8kDa谷胱甘肽 -S -转移酶 (Sj2 8GST)基因 ,获得用于疫苗和T细胞表位研究的高纯度重组融合蛋白 2 8GST -TRX。方法 应用引物特异性PCR技术 ,从日本血吸虫中国大陆株成虫cDNA文库中扩增Sj2 8GST基因 ,经琼脂糖凝胶电泳结合碱基序列分析鉴定后 ,采用定向克隆技术构建Sj2 8GST -TRX融合蛋白重组表达载体并诱导其在大肠杆菌BL2 1(DE3)的表达 ,用Western -blotting测定以融合蛋白方式表达的Sj2 8GST的免疫原性 ,通过包涵体纯化结合Ni+柱亲和层析获得高纯度重组融合蛋白。结果 Sj2 8GSTPCR产物为约 6 4 0bp ,其碱基序列 (6 33bp)和推导的氨基酸序列 (2 11aa)与GenBank报道一致 ;获得了Sj2 8GST -TRX重组质粒 ;2 8GST -TRX融合蛋白在大肠杆菌以包涵体形式高效表达 ;在分子量为约 4 3kDa处有一能与羊抗Sj2 8GST抗体产生特异性反应的含 2 8GST融合蛋白条带 ;包涵体纯化法结合Ni+ 亲和层析可获得高纯度的重组融合蛋白。结论 获得到了日本血吸虫中国大陆株 2 8GST分子的全长基因和高纯度重组 2 8GST -TRX融合蛋白 ,该融合蛋白具有天然Sj2 8GST免疫原性。