外源基因表达系统的研究进展

最近20多年来,随着重组DNA技术的迅速发展,对于克隆基因表达问题的研究也日渐深入,并积累了相当丰富的知识。外源基因的表达系统包括原核表达系统和真核表达系统,它们各有优缺点,在选择时应衡量使用。

植物细胞色素P450基因的异源表达系统研究进展

细胞色素P45 0氧化酶是一类具有多种催化功能含血红素的氧化酶系。由于参与多种类型的氧化反应 ,在植物生命活动中有重要功能 ,其研究一直受到重视。自 1 990年第一个植物P45 0基因成功克隆以来 ,到 2 0 0 2年年底 ,已有 60 0多个P45 0基因被克隆 ,有 1 0 0多个基因在细菌、酵母、杆状病毒昆虫细胞等异源表达系统中成功表达并鉴定了功能。拟对植物P45 0的大肠杆菌、酵母、杆状病毒昆虫细胞表达系统的特点进行比较 ,对在各表达系统中成功表达并进行了功能鉴定的植物P45 0进行归纳 ,并对目前植物P45 0异源表达的现状和应用进行概述。

杆状病毒表达系统表达BCoV纤突蛋白及其对小鼠的免疫原性

旨在为表达牛冠状病毒(bovine coronavirus,BCoV)的纤突蛋白(S蛋白),并评价其作为免疫原免疫小鼠后的免疫效果。本研究以BCoV/SWUN/HXD-4/2021株的全长S基因为模板,针对昆虫细胞进行密码子优化和合成,构建重组质粒pFastBac-Dual-S,与DH10Bac同源重组后转染昆虫细胞收获重组杆状病毒rpFastBac-S,利用基因组PCR、免疫印迹法(Western blot)和间接免疫荧光试验对其进行鉴定,测定杆状病毒滴度。优化和筛选感染剂量对蛋白表达的影响,超速离心纯化蛋白,免疫小鼠和评估其免疫效果。结果显示:优化后全长4108 bp的BCoV S基因CAI(密码子适应指数)从0.39调整为0.87,平均GC含量从35.8%调整为50.6%。经双酶切、PCR验证,重组质粒与重组杆粒均构建成功。用5μg重组杆粒Bacmid-S转染Sf9细胞并传代至第四代后细胞病变趋于稳定,感染杆状病毒约20 h后产生典型病变,收获重组杆状病毒进行鉴定。PCR电泳结果显示重组杆粒携带S目的蛋白基因;间接免疫荧光试验显示,试验组观察到特异性绿色荧光;Western blot结果显示重组杆状病毒rpFastBac-S所表达的蛋白为S目的蛋白,目的条带位于250 ku左右,感染剂量MOI=0.5时蛋白表达量最高。将50μg蛋白、20μg CpG免疫增强剂与等体积MF59佐剂充分混合乳化后,肌肉注射免疫小鼠,间接ELISA试验结果显示,小鼠免疫蛋白后产生了IgG特异性抗体,且抗体水平高于佐剂对照组(P<0.001),最高抗体效价达1∶12800;微量中和试验结果显示,小鼠血清中和效价最高达1∶224,试验组中和效价平均值高于灭活病毒组,但统计学差异不显著(P>0.05)。本研究利用杆状病毒表达系统表达了牛冠状病毒S蛋白,并对S蛋白免疫保护效果做了进一步评价,为后续牛冠状病毒疫苗研究提供了理论依据。

重组人骨形态发生蛋白-7表达系统研究进展

骨形态发生蛋白-7(BMP-7)在胚胎发育、肾脏保护、骨形成、代谢、再生等各个方面发挥着重要的作用,现已进入了临床应用阶段。我们简要综述了重组人BMP-7(rhBMP-7)的原核表达系统及真核表达系统,并对各表达系统的优缺点进行了分析。

病毒样颗粒常用表达系统及应用研究进展

病毒样颗粒(VLPs)是由一种或多种病毒结构蛋白自组装而成的纳米颗粒,这些结构蛋白可以排列成几层,也可以包含脂质外膜。由于缺乏遗传物质,因此VLPs无法感染宿主细胞,但其具有高度的免疫原性,能够诱导不同于常规灭活疫苗的免疫应答。VLPs可利用包括细菌、酵母、植物、昆虫和哺乳动物细胞等多种系统进行生产。与传统疫苗相比,VLPs具有不可比拟的优势,因此在生物医学领域越来越受欢迎。迄今为止,已开发出一系列基于VLPs的候选疫苗,用于免疫和预防各类传染病。同时,最近VLPs因在靶向药物传递和基因治疗的成功应用而受到关注。本文主要综述了VLPs的常用表达系统及应用研究进展。

大肠埃希氏菌表达系统在猪亚单位疫苗中的应用

大肠埃希氏菌表达系统是目前应用最广、研究最为透彻的外源蛋白表达系统,具有遗传背景清楚、易培养和控制、转化操作简单、表达水平高、成本低、周期短等优点深受疫苗研究者的青睐,但也存在易形成包涵体和无法对蛋白修饰等问题需要对其进行优化。生猪作为我国最重要的经济动物,其疫病安全防控对养猪业和我国人民的健康可持续发展有重要意义。论文对近年来大肠埃希氏菌表达系统在猪病毒性亚单位疫苗中的研究进展进行概述,为促进大肠埃希氏菌表达系统改进及其亚单位疫苗后续应用提供参考。

牡蛎疱疹病毒结构蛋白真核表达系统构建及多聚化特性

牡蛎疱疹病毒(OsHV-1)在全球范围内导致牡蛎、扇贝与蚶类的大规模死亡,成为双壳贝类养殖产业的重要威胁。为了解OsHV-1的结构与致病机制。本研究利用人胚胎肾细胞(HEK293t),构建OsHV-1主要核衣壳蛋白(ORF104和ORF33)的真核表达系统,并对ORF104和ORF33潜在相互作用进行分析。实验首先通过特异性PCR扩增技术得到orf 104和orf 33的基因序列,根据其编码蛋白的理化性质、跨膜区与三维结构等生物信息学分析结果,选择pCDNA3.1(+)构建两种基因的重组表达质粒。重组质粒经大肠杆菌扩增、提取后,利用转染试剂Lipo8000™将pCDNA3.1(+)-orf 104与pCDNA3.1(+)-orf 33分别单独或共转染至HEK293t。然后,将转染后的细胞培养18 h后裂解收集蛋白。最后利用蛋白免疫印迹(Western blot,WB)与负染电镜检测两种目的蛋白的表达情况。结果显示,实验成功构建了OsHV-1衣壳蛋白ORF104和ORF33的重组表达质粒载体,通过真核细胞表达得到大小约为135与35 ku的目的蛋白。研究表明,表达质粒可在真核表达系统中实现蛋白单独转染与共转染,共转染蛋白间可能存在相互作用的趋势并形成多聚体,其中,ORF33自身即可形成分子质量不同的多聚体。本研究首次利用真核表达系统开展OsHV-1关键结构蛋白的表达,为进一步开展该病毒结构蛋白功能与互作,以及病毒入侵机制研究奠定基础。

基于杆状病毒-昆虫细胞表达系统的猪脑心肌炎病毒样颗粒的表达及鉴定

脑心肌炎(encephalomyocarditis)是由脑心肌炎病毒(encephalomyocarditis virus,EMCV)引起的以猪的脑炎、心肌炎为主要特征的病毒性人畜共患病,可感染多种哺乳动物,目前国内尚无有效疫苗。本研究旨在开发一款安全有效的疫苗以防控该病。采用P1、3CD共表达的构建策略,利用杆状病毒-昆虫细胞表达系统获得EMCV病毒样颗粒(virus-like particals,VLPs)并将其免疫小鼠,初步评价其在小鼠体内的免疫应答效果。结果显示,免疫组小鼠特异性抗体滴度达到1∶192以上,中和抗体滴度达到1∶64以上,且与ISA206佐剂混合使用可诱导机体产生更高的抗体水平。IL-4、IFN-γ、IL-5、TNF-α细胞因子水平均可达到20 pg·mL^(-1),且明显高于PBS组。综上,本研究获得的EMCV病毒样颗粒疫苗可以诱导机体产生良好的细胞免疫和体液免疫应答,还能诱导炎症细胞因子的产生,有助于激发机体的免疫反应,增强疫苗的保护效果,为EMCV的防控提供了理论依据和技术储备。

鳜弹状病毒糖蛋白在杆状病毒表达系统中的表达与鉴定

近年来,鳜弹状病毒引起的病害频发,该病毒传播快,致病性强,是引起鳜病害的主要病原之一。鳜弹状病毒基因组编码5个结构蛋白,其中糖蛋白G是病毒表面的主要抗原,为实现该抗原蛋白的大量表达,利用分子克隆技术将鳜弹状病毒糖蛋白G片段插入杆状病毒穿梭载体pFastBac1中转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞后,筛选阳性克隆获得重组转移载体pFastBac-G,再将其转化至大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,经蓝白斑与抗性筛选后获取重组杆粒rBacmid-G,随后利用脂质体转染法将重组杆粒转染Sf9昆虫细胞制备重组杆状病毒。将获取到的P3代重组病毒感染Sf9昆虫细胞进行重组蛋白的SDS-PAGE检测,成功表达后利用镍离子亲和层析柱纯化目的蛋白,随后对重组蛋白进行Western blot鉴定,结果显示在大于50 ku处有一条特异性条带,而对照组无条带,表明制备的抗原能与抗体特异性结合。结果表明,鳜弹状病毒糖蛋白G在杆状病毒表达系统成功表达。本试验结果可为鳜弹状病毒糖蛋白G疫苗的研发和大规模生产提供技术支撑。

ENO1蛋白及其相关活性位点缺失突变蛋白在昆虫杆状病毒表达系统中的表达与鉴定

目的:利用昆虫杆状病毒表达系统(昆虫BEVS)表达糖酵解酶α-烯醇化酶(ENO1)及其3种酶活性位点缺失突变的ENO1蛋白ENO1-M1、ENO1-M2和ENO1-M3,为后续宫颈癌的代谢治疗研究奠定基础。方法:利用分子克隆技术将优化后ENO1序列插入pFastBacTM1载体,获得含有目的基因的重组质粒pFastBac-ENO1。分别缺失ENO1发挥糖酵解酶功能的3个活性位点,进行优化后将其插入pFastBacTM1载体,获得3个活性位点缺失的重组质粒pFastBac-M1、pFastBac-M2和pFastBac-M3。通过转座、转染后获得重组杆状病毒rBV-ENO1、rBV-M1、rBV-M2和rBV-M3,利用WB法对目的蛋白的表达及特异性进行检测。结果:成功扩增重组杆粒rBacmid-ENO1、rBacmid-M1、rBacmid-M2和rBacmid-M3,获得大小约2000 bp的基因片段,与预期大小相符。昆虫BEVS可表达ENO1蛋白及其3个酶活位点缺失的重组蛋白ENO1-M1、ENO1-M2和ENO1-M3,其分子量约为52000,与预期相符。WB法鉴定这些蛋白能与特异性标签His-tag发生反应。结论:通过昆虫BEVS成功表达目的蛋白ENO1及其酶活性位点缺失蛋白ENO1-M1、ENO1-M2和ENO1-M3,这些蛋白具有反应原性,为后续测定这些蛋白与ENO1单抗亲和力创造了条件。

乳铁蛋白的重组表达系统及法规管理现状概述

乳铁蛋白是一种铁结合糖蛋白,广泛存在于哺乳动物的乳汁和黏膜分泌物当中。乳铁蛋白具有广谱抑菌、抗病毒、免疫调节等生理功能,在婴幼儿配方乳粉、营养补充剂、化妆品等领域都有应用。近年来,随着基因工程技术的不断发展,来自不同物种的乳铁蛋白在常见的原核体系、真核体系与转基因哺乳动物中均得到了成功表达,重组产物的表达量及其与天然乳铁蛋白的结构相似度也在不断提升。该文对乳铁蛋白的生物学活性、重组表达系统以及目前的法规管理情况进行综述,并讨论了重组乳铁蛋白的研究难点和未来发展方向。

杆状病毒表达系统中NLS序列对鸭圆环病毒Cap基因表达的影响及其免疫原性研究

为了研究核定位信号肽(Nuclear localization signal,NLS)序列对鸭圆环病毒(duck Circovirus,DuCV)Cap蛋白表达的影响,并探究不同免疫策略下重组蛋白的免疫原性,试验将去除和未去除NLS序列的DuCV Cap基因分别克隆至杆状病毒载体pFastBacⅠ中,通过杆状病毒表达系统进行表达,分析NLS序列对Cap蛋白表达的影响。采用不同的免疫策略,分别以原核表达系统构建的重组蛋白rCap(rCap组)、杆状病毒表达系统构建的rvAc-Cap(rvAc-Cap组)及rCap与rvAc-Cap联合(Prime-Boost组)作为免疫源免疫Balb/c小鼠,并设置PBS对照组,定期采血,检测DuCV IgG抗体水平、淋巴细胞增殖指数(SI)和γ干扰素(IFN-γ)、白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-4(IL-4)等细胞因子水平,评价其免疫效果。结果表明:利用杆状病毒表达系统成功表达出重组杆状病毒rvAc-Cap和rvAc-NLS-Cap,且去除NLS序列的Cap基因表达水平更高;小鼠免疫重组蛋白rCap后,重组蛋白rCap与重组杆状病毒rvAc-Cap均能够刺激小鼠产生特异性IgG抗体,三免后Prime-Boost组的IgG抗体水平最高,而与其他免疫组差异不显著(P>0.05);三免后各免疫组淋巴细胞增殖指数显著高于PBS对照组,差异显著(P<0.05);各免疫组IFN-γ、IL-2和IL-4水平与PBS对照组比较差异显著(P<0.05),且Prime-Boost组水平最高。说明在杆状病毒表达系统中去除NLS序列可以提高Cap基因的表达;重组杆状病毒rvAc-Cap能够活化小鼠的免疫系统,刺激小鼠机体产生体液免疫与细胞免疫,而Prime-Boost免疫策略有效提高了免疫效果。

哺乳动物细胞表达系统研究进展

哺乳动物细胞表达系统具有强大的翻译后修饰功能,表达的重组蛋白更接近人源构象,因此被广泛用于治疗性重组蛋白的生产,其中应用最广泛的是中华仓鼠卵巢细胞。基因组学、转录组学、蛋白质组学以及代谢组学等研究的不断深入促进了哺乳动物细胞表达系统的不断完善。本文立足于哺乳动物细胞表达系统的研究现状,对表达载体的优化、宿主细胞和位点特异性重组等方面的最新进展进行综述。

毕赤酵母表达系统

选择合适的表达系统是蛋白质体外成功表达的关键。毕赤酵母表达系统是一种新的、极具潜力的真核表达系统,其在蛋白质表达方面具有其它系统不可比拟的优点,正在得到越来越广泛的应用。较详细地综迷了毕赤酵母表达系统的特点、组成及影响其表达的因素等。

巴斯德毕赤酵母表达系统研究进展

巴斯德毕赤酵母外源基因表达系统是近年来发展的一种优秀的真核表达系统 ,与传统的大肠杆菌和酿酒酵母表达体系相比 ,其具有的诸多优势使之研究价值及应用价值不断体现。综述了其在生物学特性、表达载体、基因整合、外源蛋白的分泌、诱导表达及发酵等方面的基础研究及新近研究进展。

大肠杆菌表达系统和酵母表达系统的研究进展

由于DNA重组技术和蛋白组技术的发展与成熟,外源基因表达技术备受关注。其在生物、食品、工业以及医学领域发挥着举足轻重的作用。以原核生物细胞及真核生物细胞作为表达系统,进行目的基因序列的表达以生产蛋白疫苗、核酸疫苗和生物酶制剂等是近年来发酵工业的新型领域。原核和真核表达系统是近年来研究和应用最广泛和最成熟的外源基因表达系统。对近年来关于大肠杆菌表达系统和酵母表达系统的研究进展进行了综述。

大肠杆菌和酵母表达系统的研究进展

20世纪70年代以来,分子生物学及基因组学迅猛发展,其在生物及医学领域发挥着越来越重要的作用。在发酵工业中,分子生物学技术广泛应用于菌种的遗传改造和基因工程菌株的构建,以期提高发酵产物的产量并丰富发酵产物的类型。其中,利用原核及真核表达系统进行外源基因的扩增、表达以生产蛋白疫苗、核酸疫苗和酶制剂等是近十年来发酵工业的新兴领域。本文从表达载体和宿主菌改造两方面综述近些年来大肠杆菌及酵母表达系统的新进展与新技术。

人工饲料组成对BmNPV-Bm表达系统外源基因表达活性的影响

为进一步提高家蚕杆状病毒—家蚕 (BmNPV Bm)表达系统的表达活性 ,通过改变人工饲料中桑叶粉、大豆粉、玉米粉和水分的添加量 ,探讨了人工饲料的营养组成对BmNPV Bm表达系统外源植酸酶基因表达活性的影响。在大豆粉含量相同的条件下 ,植酸酶基因表达活性随桑叶粉含量的增加而降低 ,桑叶粉含量为 10 %时表达量最高 ;在桑叶粉含量相同的情况下 ,大豆粉含量为 35 %时表达量最高 ;饲料含水量以添加干物重的 1 9倍时表达量最高。外源基因的表达活性与蚕体重的生长表现出一致的趋势。

T7 RNA聚合酶表达系统的真核化及其偶联表达系统的建立

为了使T7RNA聚合酶(T7RNAP)表达系统真核化,首先,利用两种方法建立能够表达T7RNAP的真核细胞:(1)共转染表达T7RNAP的真核表达重组质粒于靶细胞;(2)利用稳定表达T7RNAP的BHK-21细胞系。然后,将FMDV内部核糖体进入位点(IRES)序列和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因定向克隆进原核载体pET-40a-c(+)的T7启动子下游,得到的重组质粒pIERS-EGFP-E。用该质粒分别转染上述两种细胞,在紫外显微镜下都能够观察到绿色荧光,表明真核化的T7RNAP偶联表达系统建立。并利用流式细胞仪对偶联表达水平进行了分析。这为利用该系统真核高效表达外源蛋白奠定了坚实的基础。用实验证明了FMDV5′端含有IERS具有介导非帽依赖性的翻译的功能,为以IERS为基础的双顺反子表达系统的建立及深入研究IERS与相关蛋白的功能奠定了基础。T7RNAP偶联表达体系是一种良好的外源基因表达体系。

基因表达系统研究进展

随着世界分子生物学的研究不断发展,基因表达技术有了很大的提高。到目前为止,人们已经研究出多种原核和真核表达系统用以生产重组蛋白。原核生物表达系统主要有大肠杆菌表达系统、枯草芽孢杆菌表达系统等;真核生物表达系统主要包括酵母表达系统、丝状真菌表达系统等。各种表达系统各具优缺点,对其进行了详细介绍。