嗜热毛壳菌端粒酶的表达纯化及酶学特性分析

为进一步探究端粒酶的酶学特性,以嗜热毛壳菌(Chaetomium thermophilum, Thermo)端粒酶为研究对象,通过生物化学、生物信息学等方法得到4种不同长度的Thermo端粒酶蛋白,分别与体外转录得到的Thermo端粒酶RNA进行组装。通过端粒酶体外延伸试验检测组装体的反转录活性,进一步分析影响其反转录活性的各种因素。结果表明,4种不同长度的Thermo端粒酶蛋白重组质粒经大肠杆菌表达系统诱导表达后均可得到相应的Thermo端粒酶蛋白,且纯度均在90%以上;体外孵育试验表明,在10 mmol/L HEPES-KOH(pH 8.0)、1 mmol/L MgCl2、100 mmol/L NaCl、3 mmol/L KCl、体积分数25%Glycerol、10units/μL Rnasin的条件下,端粒酶蛋白与RNA的摩尔浓度比达到1∶1及以上时,两者能有效复合;端粒酶体外延伸试验发现,结构完整的Thermo端粒酶组装体具有很强的反转录活性,可使18nt-DNA引物反复延伸。TEN结构域不完整并未减弱Thermo端粒酶组装体的反转录活性,说明其在反转录过程中未发挥显著作用。T-PK区或TWJ区缺失的组装体均不能使18nt-DNA引物发生延伸,表明RNA结构的完整性是端粒酶发挥反转录功能的必要条件。

莱姆病螺旋体端粒解离酶的表达纯化及其晶体衍射分析

【目的】对莱姆病螺旋体(Borrelia burgdorferi)端粒解离酶(telomere resolvase,ResT)进行原核可溶性表达纯化,并筛选高衍射度的ResT-DNA复合物晶体,为探究ResT-DNA复合物的结构和功能奠定基础。【方法】合成pET28 b-ResT表达质粒,构建原核表达载体pSUMO-ResT,分析ResT可溶性蛋白在BL21(DE3)、BL21(DE3)pLysS、BL21 Gold(DE3)pLysS、BL21 Codon Plus(DE3)、Rosetta(DE3)和Rosetta(DE3)pLysS中的表达量,获得最优的ResT原核表达菌株。基于AlphaFold预测的ResT蛋白模型,利用定点突变及ResT可溶性蛋白表达分析,获得高效可溶性表达ResT突变体。经Ni-NTA亲和层析、HiTrap Heparin HP亲和层析及分子筛层析对ResT突变体ResT(W94H)进行蛋白纯化。利用EMAS检测ResT(W94H)与DNA的结合能力。使用蛋白晶体接种(seeding)和交叉接种(cross-seeding)方法,利用多种商业化结晶试剂盒筛选并优化ResT-DNA复合物的结晶条件,对复合物晶体进行X射线衍射分析。【结果】BL21 Gold(DE3)pLysS菌株是ResT最佳的高效可溶性表达菌株,W94H突变体比野生型具有更强的可溶性表达。获得了高纯度(95%)且高质量浓度(15 mg/mL)的ResT(W94H),其能够与底物DNA形成稳定的ResT-DNA复合物。在18℃下,ResT-DNA最佳结晶条件是:PEG3350150 g/L、二甲苯二酸钠0.1 mol/L(pH 6.6)、NaCl 0.15 mol/L,ResT-DNA晶体分辨率最高为3.52,晶体空间群为P4。【结论】得到了高纯度ResT(W94H)蛋白,获得了ResT-DNA复合物晶体。

志贺氏杆菌分泌蛋白Dnak的表达纯化与多克隆抗体的制备及应用

目的表达轮状病毒感染的乳鼠体内志贺氏杆菌分泌蛋白Dnak(Hsp70),并制备Dnak多克隆抗体。方法以提取的志贺氏杆菌基因组为模板PCR扩增Dnak片段,与pET-24a(+)和PCDNA3.1分别连接构建原核表达质粒pET24a(+)-Dnak和真核表达质粒PCDNA3.1-Dnak;pET24a(+)-Dnak原核表达质粒转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达,经镍柱纯化Dnak蛋白。以纯化后的重组蛋白为免疫原免疫C57BL/6小鼠制备多克隆抗体,采用间接ELISA检测效价,Western Blot法检测灵敏度和特异性。利用制备的多克隆抗体在GST Pull-down实验中检测Dnak与轮状病毒非结构蛋白Nsp2的相互作用。真核表达质粒PCDNA3.1-Dnak转染至HEK293T细胞,以制备的DnaK多克隆抗体为一抗,Western blot法检测Dnak在细胞中的表达。利用MEGA11及Genedoc软件分析此志贺氏杆菌与志贺菌属其他细菌Dnak氨基酸序列同源性。结果重组质粒pET24a(+)-Dnak与PCDNA3.1-Dnak经测序比对包含与此志贺氏杆菌(Shigella:PRJNA804371)序列一致的基因,证明质粒构建成功。诱导表达的重组Dnak蛋白主要以可溶性形式存在,相对分子质量约为75 kDa,浓度可达0.62 mg/mL;Dnak鼠多克隆抗体可与重组Dnak蛋白发生特异性反应,效价为1∶32000,至少可以在1∶6000稀释度下检测到Dnak蛋白。GST Pull-down实验可以检测到Dnak与轮状病毒非结构蛋白Nsp2发生相互作用。转染PCDNA3.1-Dnak重组质粒的HEK293T细胞可以表达Dnak蛋白。经MEGA11和Genedoc软件比对PRJNA804371株与宋内志贺菌(Shigella sonnei)、痢疾志贺菌(Shigella dysenteriae)、鲍氏志贺菌(Shigella boydii)、福氏志贺菌(Shigella flexneri)Dnak氨基酸序列同源性较高。结论成功表达志贺氏杆菌Dnak蛋白,具有良好反应性与免疫原性;制备的鼠多克隆抗体效价及灵敏度较高可满足后续实验需要。

限制性核酸内切酶Asc I蛋白质的表达纯化、酶活测定及小角散射结构解析

限制-修饰系统(RMS)是细菌为了防御外来DNA入侵而进化产生的一种保护机制。RMS系统可分为Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型和Ⅳ型。Asc I是一种Ⅱ型限制性核酸内切酶,能识别8-bp DNA基序。尽管Asc I已经被广泛应用于分子克隆研究中,然而目前尚无关于Asc I蛋白质的表达、纯化以及结构机制等方面的研究报道。本研究基于大肠杆菌重组表达体系建立了Asc I重组蛋白质的高效表达和纯化方法,从每升细菌培养物中可获得约2.5 mg纯度大于95%的Asc I蛋白质。进一步的酶学性质研究表明,Asc I酶切反应的最适温度是37℃,最适pH为7.5~8.5,反应依赖于Mg^(2+)和Mn^(2+)等二价金属离子。基于小角X射线散射(SAXS)分析技术,我们还建立了Asc I蛋白质及其与底物DNA复合物在溶液状态下的三维空间模型,并结合点突变对该模型进行了验证。总之,本研究对Asc I蛋白质的重组表达、纯化、酶活性质以及结构机制进行了比较系统地研究,为了解RMS系统的工作机制提供了结构基础,同时也为Asc I作为分子克隆工具酶的进一步开发和改造提供了理论依据。

人源SOD1及其突变体的表达纯化及酶学性质

分析人源SOD1(hSOD1)、牦牛SOD1序列,定点突变得到hSOD1突变体Mt1SOD1(E25G、P29T、E101V、C112S)和Mt2SOD1(I18T、N20H、K31V、C112S),全合成经密码子优化的hSOD1、Mt1SOD1、Mt2SOD1、牦牛SOD1序列后,将其重组克隆到表达载体pET-28a(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3)获得重组菌。重组菌经1 mmol/L IPTG诱导,在含800μmol/L Cu^(2+)和20μmol/L Zn^(2+)的LB培养基中,25℃、180 r/min诱导培养16 h,4种SOD1均以可溶性形式高效表达,镍亲和层析可有效纯化重组SOD1。100 mL LB摇瓶培养获得的hSOD1活性为71094 U/mg,产率为4.57 mg。Mt1SOD1活性为128506 U/mg,产率为3.13 mg。Mt2SOD1活性为58700.1 U/mg,产率为5.47 mg。牦牛SOD1活性为42969.5 U/mg,产率为6.81 mg。对hSOD1、Mt1SOD1的酶学性质研究表明,在25℃~55℃,酶活力基本保持不变,75℃保温30 min,hSOD1相对酶活力保持在50%左右,Mt1SOD1保持30%酶活性。在pH 3.6~10.4条件下放置30 min,两种SOD1均能保持70%以上的酶活力。研究通过定点突变获得高活性高稳定性的hSOD1和Mt1SOD1,为SOD1在医疗、保健、化妆品等领域的应用奠定基础。

家蚕碱性磷酸酶原核表达纯化、结构与活性分析

【目的】碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)是生物体内磷酸代谢的关键调控酶。不同物种ALP的性质与其生理功能密切相关。研究家蚕(Bombyx mori)ALP(BmALP)的性质和结构,为揭示ALP在昆虫体内的生理功能和调控机制提供依据。【方法】取5龄3 d家蚕中肠组织,利用Trizol法提取总RNA,然后以其为模板反转录合成cDNA。以家蚕中肠cDNA为模板,利用Primer Premier 6.0软件分别设计上下游引物,通过PCR克隆BmALP。将BmALP与不同的表达载体分别进行双酶切,然后连接并转化表达菌株,利用大肠杆菌表达重组蛋白。比较不同表达载体在上清中的表达情况,选择可溶性重组蛋白表达最好的载体,利用Origami B(DE3)细胞大量表达重组蛋白,借助Ni-NTA亲和层析纯化重组的His-Trx-BmALP蛋白,然后加入Prescission蛋白酶在4℃酶切20 h,再次利用Ni-NTA亲和层析去除融合标签His-Trx。利用凝胶过滤层析分析BmALP分子量及其在溶液中的状态,利用圆二色光谱研究BmALP的二级结构及其随温度的变化。通过酶活分析研究BmALP的最适pH、最适温度、Km、结构稳定性及金属离子对其酶学活性的影响。【结果】从家蚕中肠组织提取了总RNA,反转录合成了cDNA,并以该cDNA为模板成功克隆了BmALP。分别构建了BmALP的pSKB2、ppSUMO和pET32M.3C 3种表达载体。表达分析发现,pET32M.3C载体有助于重组的融合蛋白His-Trx-BmALP以可溶性蛋白的形式在细胞裂解后的上清液中表达,然后利用pET32M.3C载体大量表达重组蛋白,并通过Ni-NTA亲和层析纯化获得了可溶性的His-Trx-BmALP。加入Prescission蛋白酶酶切,再次通过Ni-NTA亲和层析去除了融合标签His-Trx。凝胶过滤分析显示BmALP在溶液中形成稳定的二聚体结构。圆二色光谱研究表明BmALP包含有α-螺旋结构,其含量随温度的升高逐渐减少。酶活分析揭示BmALP的最适pH和最适温度分别为11.0和45℃。测定BmALP的Km值为1.40 mmol·L^(-1)。在10℃处理2 h后,BmALP的残余活性最高;35℃处理2 h后,其活性完全丧失。Mg2+和Zn2+促进了BmALP催化反应的进行,其最适浓度分别为40和5 mmol·L^(-1)。在20 mmol·L^(-1)浓度范围内,Cu2+激活了BmALP活性,其中10 mmol·L^(-1)时激活效果最好,浓度超过20 mmol·L^(-1)时,Cu2+则抑制了BmALP活性。【结论】克隆了家蚕碱性磷酸酶基因BmALP,表达纯化了BmALP蛋白并分析了其结构和性质,为深入研究其结构和功能打下了基础。

6×His-tag在抗菌肽表达纯化中的应用及其对抗菌肽活性的影响

为方便抗菌肽的体外表达和纯化,以蝎子防御素为对象,在其编码基因末端加入6×His-tag,在酵母表达系统中表达,获得有活性的防御素Sd和融合蛋白Sd-His。进一步纯化、体外抑菌活性及热酸稳定性等试验发现,6×His-tag不但没有降低防御素的抑菌活性,反而有稍微的增强趋势。结果表明,6×His-tag可用于抗菌肽的融合表达且不影响其活性,为抗菌肽的表达纯化提供了一个更简便有效的方法。

口蹄疫病毒3D蛋白在体外的表达纯化及二级结构分析

口蹄疫(FMD)是严重影响全球农业经济的高度传染的毁灭性的疫病.3D蛋白是口蹄疫病毒(FMDV)编码的RNA聚合酶,参与病毒RNA的复制.利用PCR扩增得到了FMDV的3D基因片段,然后将其克隆到原核表达质粒pET-28a(+)上,构建重组表达质粒pETFM3D.转化宿主菌BL21(DE3)后,利用1 mmol/L的IPTG进行诱导表达.SDS-PAGE和Western boltting分析结果表明,得到了稳定、过量表达的可溶性的3D蛋白质.目的蛋白质经NI亲和层析柱一步纯化就达到95%,再经Q-sepharose柱纯化后达到97%.通过圆二(CD)色谱测定和计算3D蛋白质在不同的pH(2、4、6、8和10)和不同的温度下(25～85℃)的二级结构.上述结果表明,表达的可溶性3D蛋白质具有高表达、易纯化和稳定性好等特点.

肺炎链球菌假想蛋白SPD0414的表达纯化及保守性分析

目的:获得纯化的肺炎链球菌(S.pn)重组假想蛋白SPD0414,并分析其在常见S.pn菌株中的保守性。方法:利用PCR方法扩增SPD0414蛋白胞外区核酸序列,将其克隆到原核表达载体ppSUMO内,转化到E.coliBL21(DE3)中,经IPTG诱导表达后Ni-NTA树脂纯化重组蛋白。用SDS-PAGE和Western blot鉴定蛋白特异性及纯度。通过纯化蛋白免疫BALB/c小鼠制备其多克隆抗体,并用间接ELISA检测多克隆抗体的效价,Western blot方法分析多克隆抗体的特异性,同时,鉴定该蛋白在6种常见肺炎链球菌分离株的保守性。结果:克隆的SPD0414序列与Gene Bank中的数据相符,并实现了重组SPD0414蛋白高水平的可溶表达纯化蛋白免疫BALB/c小鼠获得高滴度、高特异性的的多克隆抗体,Western blot验证SPD0414蛋白在6株常见肺炎链球菌菌株中均有表达。结论:成功制备了高滴度、高特异性的SPD0414多克隆抗体,证实了SPD0414在肺炎链球菌不同菌株间保守性较高,为肺炎链球菌多肽联合疫苗的研制奠定了基础。

人Polycomb家族成员NSPc1蛋白的原核表达纯化及多克隆抗体制备

目的Polycomb家族成员NSPc1多克隆抗体的制备与检测。方法应用PCR技术扩增人NSPc1编码区全长序列并插入到pET-43.1a(+)载体中,在大肠杆菌BL21中表达融合蛋白HIS-NSPc1。利用所表达的融合蛋白中含有的6×His标签进行亲和纯化。用所获得的纯化蛋白免疫新西兰大白兔,获得兔抗人NSPc1多克隆抗体。用Western blot检测抗体免疫反应的特异性。结果在大肠杆菌中表达并纯化了人NSPc1重组蛋白,纯度达95%,用其免疫新西兰大白兔,成功制备了相应兔源多克隆抗体,Western blot实验中该抗体可以特异识别内源及外源性NSPc1蛋白。结论原核表达的NSPc1融合蛋白可以被纯化,并具有足够的蛋白免疫原性,所制备的相应多克隆抗体具有良好的特异性,可以运用于NSPc1基因的功能研究。

牛SRY蛋白表达纯化与体外功能鉴定

利用PCR技术从北京黑白花奶牛(Bostaurus)的基因组DNA中克隆了SRY(Sex-determiningregionontheYchromosome)基因编码区全长序列。序列分析表明牛SRY基因的HMG区(Highmobilitygroup)呈现高度的保守性,与人、小鼠、猪等的相似性达到70%。将SRY基因与pET-28a(+)载体相连,构建表达载体pET-28a/SRY;把该表达载体转入大肠杆菌BL21(DE3),以IPTG诱导30℃诱导4h,SRY蛋白可高效表达,表达产物占总蛋白量的26%。对表达产物进行了Western-blotting检测,并采用亲和层析技术获得了高纯度的牛SRY蛋白。通过PCR技术分别获得牛、人、鼠的苗勒氏管抑制物(MullerianInhibitingsubstances,MIS)启动子,凝胶阻滞试验证明,牛SRY蛋白可与人及牛的MIS启动子结合,但与鼠的Mis启动子不发生相互作用。

丙型肝炎病毒解旋酶在大肠杆菌中的表达纯化及鉴定

解旋酶(helicase)在HCV基因组复制中负责RNA的解链,在复制中起着关键的作用。利用反转录PCR,从HCV患者血液中扩增出解旋酶基因,克隆入原核表达载体pProEXHTb,成功构建了HCV解旋酶原核表达质粒pProEXHTb-helicase。重组质粒转化DH5α大肠杆菌,经IPTG诱导表达后,表达产物经SDS-PAGE和Westernblot证实系解旋酶,并用镍离子亲和层析方法获得纯化解旋酶。

人Neuritin在原核表达系统的构建及表达纯化

Neuritin是一种新发现能促进神经突起和轴突分支的蛋白,为了更清楚的研究它的生物学功能,在已克隆Neuritin cDNA的基础上,PCR扩增出Neuritin ORF,与原核表达载体pET32a重组后,成功的构建了Neuritin原核表达质粒pET32a-Neuritin。重组质粒转化B121大肠杆菌,IPTG 诱导后,表达产物用SDS-PAGE和Western blot证实系Neuritin,用镍离子亲和层析的方法获得了纯化的Neuritin蛋白。

胱硫醚β-裂解酶的表达纯化及性质研究

通过PCR从大肠杆菌(E.coliK12)基因组DNA中扩增出胱硫醚β-裂解酶(Cystathionineβ-lyase,CBL)基因,构建了能高效表达CBL的重组菌E.coliBL21(pETDuet-1-CBL)。重组菌在30℃、0.5 mmol.L-1IPTG存在条件下诱导9 h,可溶性CBL的表达量达18 mg.L-1,占到菌体可溶性总蛋白的23%。将重组菌超声破碎后上清液经His-Trap Fast Flow亲和层析一步纯化得到CBL,回收率为71%,纯度达到94%,纯化后的CBL单位酶活为134.6 U.mg-1。为防止CBL溶液冻融后发生聚沉,向纯化后的酶液中加入5%甘油,-20℃保存。重组酶的最适反应温度为35℃,酶活性稳定的温度范围为20～35℃。重组酶的最适反应pH值为8.0,4℃下在pH值8.0的缓冲溶液中保温10 h酶稳定性最高。重组酶的KmL-cystathionine值为3.78 mmol.L-1,VmaxL-cystathionine值为0.928 mmol.L-1.h-1。本研究建立了基于CBL催化反应产物丙酮酸与2,4-二硝基苯肼显色原理测定CBL酶活性的新方法。

结核分枝杆菌分泌蛋白MPB64表达纯化

目的表达并纯化结核分枝杆菌重组蛋白pET32a-MPB64。方法将构建好的表达载体pET32a-MPB64测序后,转化到大肠杆菌BL21(DE3)内。经IPTG诱导,在大肠杆菌BL-21中表达,用SDS-PAGE和免疫印迹分析表达产物并进行蛋白纯化。结果质粒pET32a-MPB64经测序,结果与Geneback中的结核分枝杆菌标准菌株H37RV核苷酸序列基本一致;SDS-PAGE分析表明,该融合蛋白以可溶性的形式表达,其分子质量约为24 kDa,蛋白表达量约占菌体总蛋白的20%;该蛋白经MagExtractor-His-tag-磁珠纯化试剂盒纯化后浓度达2.49mg.mL-1;Western-blot结果显示融合蛋白可与抗His-Tag标签的单克隆抗体结合。结论成功得到高纯度的重组目的蛋白pET32a-MPB64,为进一步制备其单克隆抗体奠定了基础。

新型内含肽介导PHB系统表达纯化PoIFN-α的研究

为简化猪α干扰素蛋白（PoIFNα）的纯化步骤,以蛋白质自切割元件内含肽（Intein）替代蛋白酶,并以细菌自身产生的聚β-羟基丁酸酯（PHB）颗粒替代亲和配基,构建了新型内含肽介导PHB纯化PoIFNα的体系.结果显示,构建的基因工程大肠杆菌系统可成功实现PoIFNα的表达和纯化;φ（乳酸钠）=2.7%时,比较适宜工程菌的PHB累积;当诱导自切割反应温度为20℃,pH=6.5,反应时间为24~36 h时,可以实现内含肽C端高效自切割,纯化出的PoIFNα产量为20~30 mg/L.实验为重组猪α干扰素的工业化规模生产奠定了基础.

辣椒疫霉病无毒基因RXLR128001克隆与蛋白表达纯化

本文从强致病辣椒疫霉菌SD33分离克隆了1个效应分子RXLR128001基因,利用生物信息学软件BLAST and Signal P4.1 Server,分析了该效应分子的基因序列结构。在此基础上进行了该基因大肠杆菌(Escherichia coli)表达与纯化,界定了适宜该基因高效表达的诱导条件,经过亲和层析和离子交换层析,获得了RXLR128001基因较高纯度的蛋白,以利于后续晶体的培养与优化研究。

易通过冷冻食品传播的新冠病毒解旋酶的表达纯化及酶活研究

通过原核表达方式纯化得到新冠病毒解旋酶(SARS-CoV-2-Nsp13),并利用荧光各向异性和凝胶阻滞试验探究了其体外结合DNA、RNA底物的亲和力及解旋双链DNA的最佳解旋条件。结果表明,SARS-CoV-2-Nsp13解旋酶具有结合单链DNA(ssDNA)、带有5'尾链的双链DNA(5'Oh-dsDNA)及RNA发卡结构(RNA-HP)的活力,亲和性依次为5'Oh-dsDNA≈RNA-HP>ssDNA,结合曲线呈S型。SARS-CoV-2-Nsp13解旋酶与DNA、RNA底物的结合具有协同性。SARS-CoV-2-Nsp13解旋酶可以解旋带有5'尾链的双链DNA,解旋的方向为5'-3',发挥完全解旋活性的酶浓度为3μmol/L;而该解旋酶解旋DNA双链的活性相对较弱,解旋活性在NaCl浓度达到80 mmol/L时受到明显的抑制。研究结论可为深入理解冠状病毒解旋酶的生化活性及工作机理提供参考和帮助。

猪肺脏PTEN基因的克隆与表达纯化

为了研究猪磷酸酶和张力复合物(PTEN)在感染高致病性猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)后的表达量变化,验证PTEN在PRRSV感染肺脏过程中引起的肺损伤和呼吸窘迫综合征的作用,试验对猪的PTEN基因进行了克隆表达,并对其蛋白进行了纯化。结果表明:成功地克隆并表达了猪PTEN基因。

SSA/Ro60自身抗原的基因克隆与表达纯化

目的 克隆人SSA/Ro60自身抗原并表达纯化,为辅助诊断自身免疫提供物质基础。方法 采用RT-PCR技术扩增SSA/Ro60基因,定向插入pPICZ表达载体,转入毕赤酵母表达系统,将获得的重组蛋白行SDS-PAGE和Western blotting鉴定。结果 扩增出约1.5kb的SSA/Ro60全长序列,获得相对分子质量60×103的重组蛋白,经鉴定具有SSA/Ro60抗原性。结论成功克隆并表达SSA/Ro60,为诊断自身免疫疾病奠定基础。