新城疫病毒F蛋白碱裂解位点修饰及外源基因的插入对新城疫LaSota疫苗株致病力的影响

新城疫是危害养禽业发展的重要传染病。新城疫病毒(NDV)具有高度传染性和高致病性,融合蛋白(F)的F1/F2裂解位点存在多个碱性氨基酸并由此形成的泛组织嗜性一直以来被认为是NDV致病的主要决定因素。本研究利用已经构建NDV弱毒LaSota疫苗株反向遗传操作平台,将LaSota病毒F蛋白的碱裂解位点由GGRQGR↓L分别突变为GRRQRR↓F和GRRQRR↓L,在未加入TPCK胰酶的情况下分别成功拯救出突变修饰LaSota疫苗病毒株rL-FmF和rL-FmL,通过测定鸡胚平均致死时间(MDT)、脑内致病指数(ICPI)和静脉内致病指数(IVPI)等指标对其毒力进行评估,结果rL-FmF和rL-FmL的ICPI值由LaSota的0.36分别上升为1.18和1.05,但MDT均大于90小时,IVPI仍然均为0,表明碱裂解位点的突变可显著增强致病力。为了检测外源基因插入对病毒致病力的影响,进一步以rL-FmF为载体,分别构建并拯救出表达H5亚型禽流感病毒血凝素HA和增强绿色荧光蛋白EGFP基因的重组病毒rL-FmF-HA和rL-FmF-EGFP,经测定ICPI分别为0.67和1.10,但MDT均大于90小时,IVPI仍然均为0。结果表明,对rLaSota病毒F蛋白裂解位点2个非碱性氨基酸突变为碱性氨基酸,无论F2蛋白氨基端为F或L,均可显著增强其脑内接种致病力,接近中发型毒株标准,但对静脉内接种致病能力均无显著影响,而对鸡胚致死能力均保持rLaSota病毒缓发型特点(MDT≥90);外源基因的重组、表达可不同程度致弱病毒,其致弱程度与外源基因及其表达产物性质有关。结果提示,影响NDV致病力不仅仅局限于F蛋白裂解位点氨基酸序列;通过F裂解位点修饰及HA基因插入可以获得致病力较高但基本接近缓发型标准的重组病毒。

新城疫强毒株F蛋白裂解位点串联基因的构建及其原核表达

目的构建鸡新城疫(ND)强毒株多裂解位点串联基因表达载体,为建立NDV强弱毒株的ELISA鉴别方法奠定基础。方法人工合成一段包含4种不同NDV强毒株裂解位点的基因Fe(F prote in multitude epi-position),其中各裂解位点之间用Linker(GGGGS)使其串联,然后进行2倍和4倍拷贝,并定向克隆至原核表达质粒pET-28a(+)中,构建重组表达质粒pET-28a(+)/2Fe和pET-28a(+)/4Fe,进行表达和Western blot鉴定。结果构建的原核表达重组质粒pET-28a(+)/2Fe和pET-28 a(+)/4Fe测序正确。Western blot检测结果表明,2Fe、4Fe蛋白均与新城疫强毒株F48E9阳性血清呈阳性反应,而与新城疫弱毒株V4阳性血清呈阴性反应。结论已成功构建NDV强毒株F蛋白裂解位点串联基因表达载体,为建立NDV强弱毒株的ELISA鉴别方法提供理论依据。

血凝素蛋白裂解位点对H5亚型禽流感病毒侵入细胞的影响

目的通过RT-PCR反应获得了H5N1亚型禽流感病毒完整的血凝素基因(HA)并克隆到真核表达载体pcDNA3上,通过转染293T细胞进行了瞬时表达验证。方法采用PCR定点突变技术,将其HA基因裂解位点的氨基酸组成由RKKR↓GLF突变为RSSR↓GLF,使其具有低致病性AIV的分子特征,并构建了表达突变后HA基因的真核表达载体pcDNA-Hm。将pcDNA-H5和pcDNA-Hm分别与MuLV假病毒构建体系的两种质粒pHIT60和pHIT111共转染转化了SV40大T抗原的人胚肾细胞293T后,收集转染细胞上清,通过Western-blot和细胞感染性实验来研究假病毒的特性。用缺乏囊膜蛋白和已经证实可以形成MuLV假病毒的水泡性口炎病毒糖蛋白G作为对照。结果转染后形成假病毒进行裂解后进行Western-blot证明两种HA蛋白都能够整合到各自的假病毒颗粒表面,野生型的HA可以检测到三条带,分别与HA0、HA1和HA2大小相符,而突变后的HAm则仅能检测到一条带,与HA前体大小相符,说明其失去了裂解活性。通过感染293T、COS-7和NIH3T3三种不同的靶细胞后发现野生型的HA所形成的假病毒MuLV-H5具有感染性和泛嗜性,而突变后的HA所形成的假病毒则失去了感染性。结论可以得出HA蛋白裂解位点的氨基酸组成不仅对H5亚型禽流感病毒的致病性有影响,对禽流感病毒侵入细胞也具有至关重要的作用。

不同HBV感染者病毒前C区信号酶裂解位点变异的检测

运用错配聚合酶链反应 (PCR)和限制性片段长度多态性 (RFLP)分析方法 ,检测乙型肝炎病毒(HBV)基因前C区信号酶裂解位点 (T186 2 )变异在重型乙型肝炎、乙型肝炎无症状携带者 (AsC)、乙型肝炎病毒感染后肝硬化 (LC)及慢性肝炎 (CH)病人中的发生率 ,以探讨T186 2变异在各组肝病中的临床意义。T186 2变异在 4组病人中的发生率分别为 :重型乙型肝炎 17.3% (9/ 5 2 ) ,AsC无一例变异 ,LC 2 .7% (1/ 37) ,CH 2 .3% (1/44 )。重型乙型肝炎病人T186 2变异率与AsC、LC和CH比较 ,差异有显著性意义 (P <0 .0 1) ,而AsC与LC、CH比较 ,T186 2变异差异无显著意义 (P >0 .0 5 )。提示T186 2变异与乙型肝炎病毒引起的急性重症肝炎或慢性肝炎急性加重有关。

鸽新城疫病毒分离株F0裂解位点的基因克隆及序列分析

为探索鸽新城疫的流行特点，在分子水平上阐明鸽新城疫病毒分离株与鸡新城疫病毒株之间的相互关系，我们用ＲＴ－ＰＣＲ技术获得了分离株Ｆ０裂解位点附近３００ｂｐ的基因片段，将其克隆到ｐＵＣ１９载体上得到一重组克隆ｐＮＤＶ２１，序列分析表明，插入片段与鸡新城疫强毒Ｔｅｘａｓ相应区域的同源性为８７．７％；而与弱毒株Ｄ２６／７６及ＬａＳｏｔａ的同源性分别是９１．７％和９８％。其Ｆ０裂解点的氨基酸顺序为Ｇｌｙ－Ａｒｇ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ－Ａｒｇ。

NDV融合蛋白裂解位点基因的重组昆虫杆状病毒表达载体的构建与鉴定

将新城疫病毒（ＮＤＶ）Ｆ４６Ｅ９株和ＬａＳｏｔａＥ４株的融合蛋白裂解位点（Ｆｃ）基因从本实验室构建的重组质粒ｐＵＣＦ４６Ｆｃ和ｐＵＣＬａＦｃ中用ＥｃｏＲＩ和ＳａｌⅠ切出。将这２个毒株的Ｆｃ基因定向克隆入昆虫杆状病毒表达载体ｐＳＸＩＶＶＩ＋Ｘ３的ＥｃｏＲＩ和ＳａｌⅠ位点之间，获得２个毒株的Ｆｃ基因克隆ｐＸ３Ｆ４６Ｆｃ和ｐＸ３ＬａＦｃ。重组质粒用ＥｃｏＲＩ／ＳａｌⅠ、ＰｓｔⅠ酶切法、ＰＣＲ和核酸探针法进行了鉴定，证明插入的基因来自ｐＵＣＦ４６Ｆｃ和ｐＵ－ＣＬａＦｃ，插入的位置和方向都正确。这２个载体的构建为Ｆｃ基因在昆虫细胞系统的表达创造了条件。

弗林蛋白酶裂解位点在微生物感染宿主中的作用

弗林蛋白酶(Furin)裂解位点广泛存在于微生物前体蛋白中,它在病原感染宿主的过程中被Furin识别并裂解活化,从而使病原微生物进入细胞并发挥致病作用;它还与病原感染宿主过程中的毒力、宿主和细胞嗜性等相关;它可能还是微生物传播效率和规模影响因素之一。为此,本文对其在微生物感染宿主中所起的作用进行了详细综述,以期为微生物致病机制的研究和阻断药物的开发提供参考。

新城疫病毒融合蛋白裂解位点基因的分离克隆及在原核细胞中的表达

用ＳＰＦ鸡胚繁殖新城疫病毒（ＮＤＶ）Ｆ４６Ｅ９株（强毒）、ＬａＳｏｔａＥ４株（弱毒），对病毒进行纯化，抽提ＲＮＡ。用１对均为２７个碱基的引物进行ＲＴ－ＰＣＲ，扩增出了２个毒株的融合蛋白裂解位点（Ｆｃ）基因。将Ｆｃ基因定向克隆入ｐＵＣ１８的ＥｃｏＲＩ和ＳａｌⅠ位点之间，获得２个毒株Ｆｃ基因克隆ｐＵＣＦ４６Ｆｃ和ｐＵＣＬａＦｃ，用ＥｃｏＲＩ／ＳａｌⅠ双酶切法、ＰｓｔⅠ单酶切法、ＰＣＲ法和核酸探针法对其进行了鉴定。将鉴定好的ＬａＳｏｔａＥ４Ｆｃ基因定向导入表达载体质粒ｐＢＶ２２１，获得重组子ｐＢＶＬａＦｃ。ＰＣＲ和内切酶酶切法鉴定表明，Ｆｃ插入的位置和方向都正确无误。用Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α通过热诱导法进行了表达。用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ法检测了表达产物。结果表明，有１条能够与ＮＤＶ多抗反应的特异条带，分子量约１５７００，与预期大小一致。

H5N2亚型禽流感病毒血凝素裂解位点碱性氨基酸对应mRNA核苷酸的二级结构分析

以H5N2亚型禽流感病毒毒株血凝素蛋白裂解位点碱性氨基酸为研究对象,对其密码子偏好性和对应mRNA序列的折叠二级结构特点进行研究和分析。旨在探讨裂解位点氨基酸对应mRNA核苷酸片段的二级结构与病毒致病力的关系,希望能对禽流感病毒的研究提供一些基础性信息。将mRNA样本按照序列等步长递增的方法,用RNAstructure 4.1程序预测这些样本的动态延伸折叠二级结构。序列和结构的分析结果:裂解位点的碱性氨基酸对富含腺嘌呤的密码子有强烈偏好;与碱性氨基酸对应的mRNA片段上的核苷酸主要位于折叠二级结构的单链环区,少数位于配对螺旋区。结果表明:裂解位点氨基酸对应的mRNA核苷酸形成发夹端环的大小与其碱性氨基酸的多少具有正相关性。

弗林蛋白酶裂解位点对IBV致病性的影响机制

传染性支气管炎病毒(IBV)属于γ冠状病毒,是人类分离到的第一种冠状病毒,主要损伤鸡的呼吸系统和泌尿生殖系统,严重影响我国及世界养禽业的健康发展。IBV主要编码4个结构蛋白:S、E、M和N。其中,S蛋白含有S1/S2和S2’两个裂解位点。近年研究表明,S2’位置的弗林蛋白酶裂解位点(FCS)对MHV和SARS-Co V侵入易感细胞的途径具有重要调控作用,对IBV Beaudette株的传代细胞适应性起决定作用,FCS的缺失会导致Beaudette株无法在细胞系中正常生长。

血凝素裂解位点插入碱性氨基酸序列会提高AIV致病性

H9N2禽流感病毒（AIV）的低致病性常引起隐性感染,故很难将其彻底根除。了解H9N2AIV能否获得像H5和H7AIV那样的高致病性对控制禽流感至关重要。日本北海道大学与科学技术振兴机构科研人员在一个非致病性H9N2AIV毒株A／chicken／Yokohama／aq-55／2001（Y55）的HA裂解位点插入一对di-碱性氨基酸残基，对其致病性进行研究。

乙型肝炎病毒前C信号肽酶裂解位点变异对HBeAg表达的影响

目的 探讨乙型肝炎病毒前C信号肽酶裂解位点变异后乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)表达的改变。 方法 以聚合酶链反应结合限制性片段长度多态性 (PCR RFLP)方法筛检前C信号肽酶裂解位点变异的病例 ,经PCR扩增出编码HBeAg的前C/C区基因并克隆于EB病毒真核表达载体 (EBO) ,以脂质体介导方法将变异株与野株分别转染HepG2细胞 ,利用SEAP报告系统监测转染效率 ,用酶联免疫吸附方法 (ELISA)和免疫印迹 (Westernblot)方法检测转染不同病毒株的细胞外和细胞内HBeAg的量。 结果 转染野株的细胞培养上清经ELISA方法可检测到HBeAg阳性 ;而转染变异株的细胞培养上清中HBeAg为阴性。培养细胞内部以Westernblot方法检测发现野株可表达三种蛋白 ,即HBeAg(分子量 170 0 0 )和两种HBeAg前体 (2 2 0 0 0和 2 5 0 0 0 ) ,而变异株只能检测到两种HBeAg前体 ,且变异株的HBeAg前体密度带明显比野株强。 结论 乙型肝炎病毒前C信号肽酶裂解位点变异后可能影响HBeAg的翻译后加工 ,导致大量的HBeAg前体在细胞中蓄积 ,这可能导致HBV感染者血清HBeAg阴性。

临床细菌与H3N2流感病毒共感染特征及病毒血凝素裂解位点的变异研究

目的了解流感样病例中临床细菌与H3N2流感病毒共感染及病毒血凝素(HA)裂解位点的变异特征。方法收集2013年1月至2018年12月的流感样病例样本12250份,实时荧光PCR检测H3N2流感病毒。选取部分流感阳性病例样本,采用实时荧光PCR的方法进行金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌和B型流感嗜血杆菌的检测,分析其临床感染特征。分离流感病毒,RT-PCR扩增病毒HA,测序,构建进化树,并分析裂解位点氨基酸变异特征。结果2013年以来,每年都有H3N2流感病毒的流行,H3N2在流感阳性病例中的占比为44.69%。随机选取2013—2018年间流感流行高峰的H3N2阳性病例样本295份,29.2%的病例存在临床细菌感染。对分离到的210株H3N2流感病毒进行HA裂解位点测序,68株存在变异,其中63株为K342R单氨基酸位点变异,裂解位点由PEKQTR转变为PERQTR。裂解位点未变异样本的细菌共感染率为31.25%(45/144),裂解位点变异样本的细菌感染率为23.53%(16/68),二者的差异没有统计学意义(χ2=1.34,P>0.05)。杭州地区流行的H3N2流感病毒主要属于3C.3a和3C.2a两个进化簇,裂解位点发生K342R变异的病毒属于3C.3a进化簇。结论H3N2流感病毒在杭州地区的流感病毒流行中占据重要地位。流感阳性病例存在着一定程度的细菌共感染。裂解位点变异具有一定的地域流行特征,但与细菌共感染没有显著相关性。

猪源新城疫病毒F蛋白裂解位点对BHK-21细胞特异性膜融合的影响

目的研究猪源新城疫病毒F蛋白裂解位点区氨基酸序列对其特异性膜融合作用的影响。方法采用基因定点突变及基因重组的方法,测定突变猪源新城疫病毒JL01株F蛋白裂解位点区基因序列,并将阳性突变质粒与猪源新城疫病毒HN基因共转染BHK-21细胞,通过面积判断法和细胞计数法分析细胞融合效率。结果突变株RF4细胞融合效率为0.58±0.10,与野毒株的0.55±0.02接近。RF5融合效率较高,为0.69±0.05;RF3融合效率较低,为0.25±0.02。结论猪源新城疫病毒F蛋白裂解位点的改变对其特异性膜融合作用有一定影响。

焦磷酸测序技术在检测甲型H1N1血凝素基因裂解位点突变中的应用

目的基于焦磷酸测序技术建立甲型H1N1流感病毒血凝素(HA)基因裂解位点突变的快速检测方法,探讨其临床应用价值。方法采用RT-PCR扩增甲型H1N1病毒血凝素基因中的HA片段,在生物信息学分析的基础上,针对甲型H1N1病毒血凝素基因含有裂解位点序列片段,分别设计一套生物素标记的PCR引物和测序引物,运用焦磷酸测序技术对含甲型H1N1病毒裂解位点基因片段进行序列测定,同时分析青岛地区甲型H1N1流感病毒流行株的裂解位点基因特征。结果建立了基于焦磷酸测序技术检测甲型H1N1流感病毒裂解位点突变方法,实现甲型H1N1流感病毒HA基因裂解位点的高通量检测,青岛地区甲型H1N1流感病毒裂解位点344氨基酸序列没有发生变异。结论本研究所建立的方法具有自动化程度高和结果准确等特点,适用于甲型H1N1流感病毒裂解位点进行快速高通量检测。

H5N1亚型禽流感病毒血凝素裂解位点碱性氨基酸对应mRNA核苷酸的二级结构分析

以H5N1亚型禽流感病毒(avianin fluenza viruses,AIV)毒株血凝素(hemagglutinin,HA)蛋白裂解位点碱性氨基酸为研究对象,研究其密码子的偏好性及对应mRNA序列折叠二级结构的特点.将mRNA样本按照序列等步长递增的方法,用RNAstructure 4.1程序预测这些样本的动态延伸折叠二级结构.结果表明,裂解位点的碱性氨基酸对富含腺嘌呤(A)的密码子有强烈偏好;与碱性氨基酸对应的mRNA片段上的核苷酸主要位于折叠二级结构的单链环区,极少数位于配对螺旋区.此外,本研究还从理论上提出了防治H5N1亚型AIV感染的对策,考虑以位于环区的mRNA核苷酸,运用RNAi的方法阻止H5N1亚型AIV的HA的表达。

雌激素对去卵巢大鼠不同脑区APPβ位点裂解酶表达的影响

目的观察内外源雌激素对卵巢切除大鼠大脑皮层、海马CA1区APPβ位点裂解酶(BACE)表达的影响。方法21只雌性W istar大鼠随机分为假手术对照组、卵巢切除组(OVX组)、卵巢切除后补充外源性雌激素组(E2组)。放免法测量大鼠血中雌激素含量。免疫荧光标记细胞化学法计数皮层区、海马CA1区BACE蛋白表达阳性细胞。结果与对照组和E2组比较,OVX组大鼠皮层区、海马CA1区BACE阳性细胞数显著增加(P均<0.01),血液雌激素含量显著降低(P均<0.01)。E2组与对照组比较,两组之间各观察部位BACE表达阳性细胞数和血液雌激素含量无显著差异(P均>0.05)。结论体内外雌激素含量的变化可影响大鼠皮质和海马区域BACE表达。

洛伐他汀对淀粉样前体蛋白β位点裂解酶表达和活性的影响

目的研究洛伐他汀对淀粉样前体蛋白β位点裂解酶(β-site APP cleaving enzyme,BACE1)表达和活性的影响。方法予洛伐他汀对SH-SY5Y细胞系进行处理;通过噻唑蓝比色(MTT)法观察其对细胞活力的影响;采用酶法测定胆固醇含量,采用荧光光度法测定BACE1活性,采用WesternBlot方法检测BACE1蛋白的表达量。结果与对照组相比,5μmol/L洛伐他汀组作用24h后细胞胆固醇水平下降33.0%(胆固醇与总蛋白含量的比值:3.33vs.4.97;F=5.13,P=0.020),同时BACE1活性下降13.8%(343.14vs.398.22;F=3.773,P=0.035);5μmol/L洛伐他汀组作用48h后细胞胆固醇水平下降49.2%(胆固醇与总蛋白含量的比值:2.65vs.5.22;F=12.239,P=0.001),同时BACE1活性下降38.0%(274.75vs.443.14;F=13.610,P<0.01);洛伐他汀组BACE1蛋白表达量与对照组相比无统计学差异(P>0.05)。结论洛伐他汀不影响BACE1蛋白的表达,但可以抑制BACE1蛋白的活性,同时伴细胞胆固醇水平降低,这为阿尔茨海默病(Alzheimersdisease,AD)的防治提供了新的思路。

卵巢切除大鼠脑内APPβ位点裂解酶表达的变化(英文)

目的观察卵巢切除大鼠脑内不同部位淀粉样蛋白前体蛋白(APP)β位点裂解酶(BACE)表达的变化,探讨雌激素缺乏与APP代谢系统可能存在的内在联系。方法成年健康雌性Wistar大鼠14只,随机分为卵巢切除组(模型组)和对照组,每组7只。BACE免疫荧光标记细胞化学染色,激光共聚焦显微镜下观察海马CA1区、皮质区BACE阳性细胞的表达情况。结果对照组BACE阳性细胞表达极少,模型组皮质区、海马CA1区BACE阳性细胞数较对照组显著增多(t=5.59、6.27,P<0.01)。结论卵巢切除大鼠脑内BACE表达增多,推测雌激素与BACE存在相互作用的关系。

微环境变化对PC12细胞淀粉样前体蛋白β位点裂解酶1表达的影响

目的·研究微环境变化对PC12细胞淀粉样前体蛋白β位点裂解酶1(β-site amyloid precursor protein cleaving enzyme 1,BACE1)表达的影响。方法·分别采用毒胡萝卜素(thapsigargin,Tg)、脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)、过氧化氢(H_2O_2)、缺氧培养箱和低糖培养基对PC12细胞模拟轻度内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)、炎症环境、轻度氧化应激、低氧和低糖环境,用Western blotting和荧光定量PCR检测BACE1蛋白和BACE1 mRNA的表达水平。结果·PC12细胞用0.13μmol/L Tg处理12 h或用0.01 mg/mL LPS处理36 h后,BACE1蛋白和m RNA水平显著上调(均P<0.05);而用0.13 mmol/L和0.25 mmol/L H_2O_2处理12 h,以及低氧环境和低糖环境下,BACE1蛋白和m RNA均未观察到显著变化(均P>0.05)。结论·轻度ERS和炎症环境可以使PC12细胞BACE1的mRNA和蛋白表达上调。