视黄酸信号通路调控咽弓神经嵴影响斑马鱼牙齿发育的研究

目的研究视黄酸（RA）信号通路在斑马鱼颅神经嵴迁移至咽弓神经嵴对牙齿发育的影响。方法将野生型斑马鱼胚胎与转基因斑马鱼胚胎各分为3组,分别采用1×10-7~6×10-7 mol·L-1梯度浓度的RA（RA处理组）、1×10-7 mol·L-1的4-二乙氨基苯甲醛（DEAB）（DEAB处理组）、与RA处理组相应浓度的二甲基亚砜（DMSO对照组）处理24 hpf胚胎9 h。制备dlx2a、barx1、dlx2b基因的反义探针,运用整胚原位杂交技术检测野生型斑马鱼48~72 hpf胚胎的dlx2a、dlx2b、barx1基因表达,荧光显微镜观察转基因斑马鱼4 dpf胚胎。结果获得3个基因的反义m RNA探针。与DMSO对照组相比,1×10-7 mol·L-1RA处理组barx1、dlx2a在咽弓神经嵴的表达明显增强,并有由咽弓神经嵴向后段咽弓牙齿萌出位点迁移的趋势,绿色荧光向周边咽弓扩散;4×10-7 mol·L-1 RA处理组胚胎致畸率和死亡率极高,3×10-7 mol·L-1 RA处理组1/3胚胎发育迟缓。DEAB处理组神经嵴发育不良,barx1、dlx2a表达降低,dlx2b在牙齿位点的表达有所延迟。结论 RA能够通过调控咽弓神经嵴发育过程,进而调控牙齿发育前体细胞,最终达到调控牙齿发育的过程。

视黄酸信号通路在腐霉利致青春期小鼠睾丸损伤中的表达特征

[背景]腐霉利(PCM)暴露可致雄性小鼠生殖器官损伤,但其是否与视黄酸(RA)信号通路有关尚不明确。[目的]探讨RA信号通路在PCM致青春期小鼠睾丸损伤中的表达特征。[方法]取64只健康雄性ICR小鼠(3周龄)适应性饲养1周后,随机均分为对照和低、中、高剂量染毒组,每组16只,连续21 d经口灌胃,给予PCM剂量分别为0、50、100、200 mg·kg^(-1)。停止给药1周后处死小鼠,取其血清和双侧睾丸,检测血清中睾酮含量,观察睾丸切片中的组织学变化,用实时荧光定量PCR法、Western blotting法分别测定小鼠睾丸组织中RA信号通路相关基因及凋亡基因Casp9、Casp12 mRNA的表达丰度及CYP26A1、ALDH2、CASP9蛋白水平。[结果]与对照组相比,各剂量染毒组小鼠的整体外观、睾丸外观均无明显改变。病理切片观察:低剂量染毒组小鼠睾丸生精小管出现轻微萎缩,精子生成减少,中、高剂量染毒组小鼠睾丸出现明显的病理损伤(如生精小管管腔扩张,生精上皮受损,精原细胞数量下降,支持细胞部分缺如);随着PCM剂量增加,小鼠生精上皮损伤程度逐渐加重,生精小管中精子数量降低。4组小鼠肛门和生殖器距离、睾丸质量、睾丸容积、睾丸脏器系数的差异均无统计学意义(均P>0.05)。低、中、高剂量染毒组小鼠体重分别为(34.91±1.89)、(34.88±1.75)、(32.94±1.37)g其中高剂量染毒组低于对照组的(35.93±1.99)g;血清睾酮质量浓度分别为(313.77±5.32)、(305.31±3.47)、(304.80±5.28)pg·mL^(-1),均低于对照组的(319.05±1.92)pg·mL^(-1)(均P<0.05);随着PCM剂量增加,小鼠体重和血清睾酮质量浓度均有下降趋势。高剂量染毒组小鼠Rbp1、Stra6 mRNA表达丰度均高于对照组(均P<0.05);中、高剂量染毒组小鼠Aldh2、Aldh1a1、Aldh1a3、RA核受体相关基因(Rar和Rxr)mRNA表达丰度高于对照组(均P<0.05);中、高剂量染毒组小鼠Cyp26a1、Cyp26b1 mRNA表达丰度均低于对照组(均P<0.05);中、高剂量染毒组小鼠凋亡基因Casp9、Casp12 mRNA表达丰度均高于对照组(均P<0.05)。各剂量染毒组小鼠CYP26A1蛋白表达量均低于对照组(均P<0.05),其表达量随PCM浓度增加有下降趋势;中、高剂量染毒组小鼠ALDH2蛋白表达量和各剂量染毒组小鼠CASP9蛋白表达量均高于对照组(均P<0.05),其表达量随PCM浓度增加有升高趋势。[结论]PCM可损伤青春期小鼠睾丸组织,其RA信号通路、Casp9基因、Casp12基因和CASP9蛋白被激活。

视黄酸信号通路在布洛芬致小鼠卵巢损伤中的表达

目的 观察视黄酸(retinoic acid,RA)信号通路在布洛芬(ibuprofen, IBU)致小鼠卵巢损伤的表达,并分析其作用。方法 将7周龄ICR小鼠随机分为低、中、高剂量组和对照组,每组各14只,低、中和高剂量组连续7 d经口分别给予50、100和200 mg/kg·dIBU,对照组给予等体积生理盐水。停止给药1周后处死小鼠、称体重、取双侧卵巢并称其重量、计算卵巢脏器系数。苏木素-伊红(HE)染色后观察卵巢组织学改变,ELISA法检测血清雌二醇(estradiol, E2)水平,qRT-PCR方法检测RA信号通路相关基因的表达丰度,Western blot检测ALDH2和CYP26A1蛋白的表达水平。结果 高剂量组小鼠体重(29.362±1.035) g低于对照组(31.775±1.640) g,差异有统计学意义(P<0.05);随着IBU剂量增大,卵巢组织更加松散、颗粒细胞排列更加紊乱。中和高剂量组小鼠血清E2浓度分别为(47.89±3.44) pg/ml和(22.33±5.44) pg/ml,均低于对照组(58.52±12.58) pg/ml,差异有统计学意义(P<0.05);中、高剂量组卵巢组织中的合成视黄酸的Aldh2、Aldh1a1、Aldh1a2和Aldh1a3基因丰度高于对照组,高剂量组卵巢组织中视黄酸核受体(Rar和Rxr)相关基因丰度高于对照组,中、高剂量卵巢组织中代谢视黄酸的Cyp26a1、Cyp26b1和Cyp26c1基因丰度低于对照组,中、高剂量组卵巢组织凋亡基因Jnk家族丰度高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05);各实验组卵巢组织中参与RA合成的蛋白ALDH2表达高于对照组,各实验组卵巢组织中参与RA代谢的蛋白CYP26A1表达低于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 中、高剂量IBU可能使卵巢内RA合成和代谢改变而使其受到损伤。

视黄酸信号通路在腐霉利致青春期小鼠子宫损伤中的表达

目的观察视黄酸信号通路的关键基因和蛋白质在腐霉利致青春期小鼠子宫损伤中的表达,分析该信号通路与雌性生殖损伤的关系。方法将3周龄雌性ICR小鼠适应性喂养1周后按体重随机分为低、中、高剂量染毒组和对照组,每组8只,低、中、高剂量染毒组连续21天经口分别给予50、100和200 mg/(kg·d)腐霉利,对照组给予等体积大豆油。染毒结束后处死小鼠取双侧子宫,观察子宫横断面切片的组织学变化,采用实时荧光定量PCR检测视黄酸信号通路相关基因的表达丰度,用蛋白质印迹法检测ALDH2、CYP26a1蛋白的表达水平。结果低、中、高剂量染毒组小鼠体重分别为(27.50±1.49)、(27.72±1.40)和(26.89±1.19)g,均低于对照组(31.48±1.14)g(P<0.05);且随着腐霉利剂量的增加,子宫内衬单层柱状上皮和固有层管状子宫腺的密度逐渐降低、子宫皱襞越来越不明显。各染毒组adh1、ad/2、aldh1a1基因表达水平较对照组上调(P<0.05);中、高剂量组aldh1a2和aldh1a3基因表达水平高于对照组(P<0.05);高剂量组视黄酸核受体rarα、rarγ、rxrα、rxrβ基因表达水平较对照组高(P<0.05);而高剂量组cyp26a2、cyp26a3基因表达水平较对照组低(P<0.05);中、高剂量组jnk家族基因表达水平明显高于对照组(P<0.05)。各染毒组ALDH2蛋白表达量均较对照组高,且随染毒剂量增加而升高(P<0.05);各染毒组CYP26a1蛋白表达量与对照组的差异无统计学意义。结论视黄酸信号通路在腐霉利致小鼠子宫损伤中被激活,而后调控jnk家族凋亡基因表达上调,导致子宫损伤。

视黄酸通路与颅面部器官发育的研究进展

脊椎动物颅面部器官的发育需要一系列复杂有序信号分子的共同协调和参与,任何一个环节的调节失控均会导致颅面部畸形的发生。视黄酸是维生素A在体内的生物活性形式,通过一系列合成酶和降解酶的作用在组织中保持正常的浓度水平,并通过作用于核内视黄酸受体调控下游靶基因的转录过程。在胚胎发育中,视黄酸信号通路在颅神经嵴细胞发育为颅面部组织细胞的过程中起着至关重要的调控作用。深入了解视黄酸信号通路与颅神经嵴细胞发育的关系对于降低颅面部器官畸形的发病率具有重要意义。

低水平铅和1-硝基芘联合暴露致小鼠下丘脑和垂体损伤中视黄酸通路的改变

目的观察低水平铅(Pb^(2+))和1-硝基芘(1-nitropyrene,1-NP)联合染毒致小鼠下丘脑和垂体损伤中视黄酸通路的表达,探讨该通路改变与下丘脑和垂体损伤的关系。方法将84只4周龄ICR小鼠按体重随机分为对照组、Pb^(2+)染毒组(0.008 mg/L)、1-NP染毒组(0.1 mg/kg)以及低(0.008 mg/L Pb^(2+)+0.004 mg/kg 1-NP)、中(0.008 mg/L Pb^(2+)+0.02 mg/kg 1-NP)、高剂量(0.008 mg/L Pb^(2+)+0.1 mg/kg 1-NP)联合染毒组,每组14只。其中Pb^(2+)由醋酸铅提供,添加于去离子水中,小鼠自由饮水;1-NP经腹腔注射。记录每日饮水量和摄食量;连续染毒21天后称体质量,光镜下观察下丘脑和垂体组织学改变、原子吸收法测定脑组织中铅含量;实时荧光定量PCR检测视黄酸通路成员及Jnks基因的丰度;Western Blot法检测乙醛脱氢酶2(acetaldehyde dehydrogenase 2,ALDH2)、细胞色素P450家族成员26A1(CYP26a1)蛋白的表达水平。结果各组小鼠每周平均饮水量和摄食量无差异。Pb^(2+)染毒各组小鼠脑组织Pb^(2+)含量高于对照组。高剂量联合染毒组小鼠体重[(27.4±1.9 g)]低于对照组[(29.8±2.3)g](P<0.05)。中、高剂量联合染毒组血清促卵泡激素水平[分别为(265.01±2.99)、(260.42±3.61)pg/mL]低于对照组[(279.00±1.30)pg/mL](P<0.05)。下丘脑和垂体组织中,中、高剂量联合染毒组Adh1、Adh2、Rar和Rxr基因丰度,ALDH2蛋白水平均高于对照组(P<0.05),低、中、高剂量联合染毒组CYP26a1基因丰度及蛋白水平均低于对照组(P<0.05),高剂量联合染毒组Jnks基因丰度均高于对照组(P<0.05)。结论0.008 mg/L Pb^(2+)+0.1 mg/kg 1-NP连续染毒21天可致小鼠下丘脑和垂体损伤,并激活视黄酸信号通路。

敲除RIG-I基因的PK-15细胞系的建立及RIG-I对猪圆环病毒2型感染的作用

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建敲除RIG-I基因的PK-15细胞,初步探究视黄酸诱导基因I(retinoic acid-inducible gene-I,RIG-I)对猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)感染的作用。本研究根据CRISPR/Cas9靶点设计原则,设计了针对猪RIG-I基因的2条sgRNA,构建重组载体pUC19-RIG-I-sgRNA1和pUC19-RIG-I-sgRNA2,转染PK-15细胞,通过流式细胞仪分选单细胞、测序、Western blot检测RIG-I敲除情况。PCV2感染细胞后,通过荧光定量PCR分析RIG-I及其下游分子mRNA水平,IPMA方法及TaqMan定量PCR检测病毒增殖水平。结果显示,筛选出的1株RIG-I基因缺失37 bp的PK-15细胞,Western blot检测RIG-I蛋白不表达。PCV2感染正常PK-15细胞48 h和72 h后,RIG-I mRNA水平上调,表明PCV2可激活RIG-I。敲除RIG-I基因,可下调MAVS、STING、IRF3、IFN-β的mRNA水平,抑制PCV2在PK-15细胞中复制,初步表明RIG-I信号通路促进PCV2在PK-15细胞中复制。本研究为PCV2感染的天然免疫机制研究提供了良好的细胞模型。

双同源盒诱导小鼠胚胎干细胞向胚外内胚层分化的机制研究

目的·探索双同源盒(double homeobox,DUX)蛋白对小鼠胚胎干细胞(mouse embryonic stem cell,mESC)向胚外内胚层(extraembryonic endoderm,XEN)分化潜能的影响及可能的作用机制。方法·使用慢病毒体系在mESC中构建过表达DUX细胞系,利用流式细胞术检测DUX过表达前后2细胞样细胞(2-cell-like cell,2CLC)的比例,并使用实时定量聚合酶链反应(real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测2细胞期特异性基因,如内源性Dux、锌指和SCAN结构域的蛋白质4c(zinc finger and SCAN domain containing 4c,Zscan4c)、锌指蛋白352(zinc finger protein 352,Zfp352)和鼠内源性反转录病毒-聚合酶(murine endogenous retrovirus-L polymerase,MERVL-pol)的表达。RT-qPCR检测过表达DUX的mESC多能性因子[nanog homeobox(Nanog)、kruppel-like transcription factor 4(Klf4)、性别决定区Y框蛋白2(sex determining region Y-box 2,Sox2)、八聚体结合转录因子4(octamer-binding transcription factor 4,Oct4)]和自然分化状态下各胚层标志性基因[内胚层(endodermal):GATA结合蛋白4(GATA binding protein 4,Gata4)、Gata6、Sox17;外胚层(ectodermal):微Ⅲ型β微管蛋白3(tubulin beta 3 classⅢ,Tubb3)、巢蛋白(Nestin);中胚层(mesodermal):心脏和神经嵴衍生物表达转录本1(heart and neural crest derivatives expressed 1,Hand1)、肌源性分化蛋白1(myogenic differentiation 1,Myod1)、激酶插入结构域受体(kinase insert domain protein receptor,Flk1)]的表达。挖掘公共转录组测序(RNA sequencing,RNA-seq)数据,通过分析胚外内胚层标志基因的表达水平,明确DUX对mESC向胚外内胚层分化的影响;通过对差异基因的功能及通路进行基因本体论(Gene Ontology,GO)富集分析、京都基因和基因组数据库(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)富集分析和基因集富集分析(gene set enrichment analysis,GSEA),找出DUX作用的信号通路;深入分析已有的染色质免疫共沉淀技术结合二代测序(chromatin immunoprecipitation sequencing,ChIP-seq)数据,探究DUX的潜在靶基因。结果·2CLC比例升高和2细胞期标志基因表达上调,证明已成功构建过表达DUX细胞系。分子生物学实验显示过表达DUX后可有效维持mESC的多能性,与公共RNA-seq数据分析结果一致;差异基因分析发现,内胚层基因出现特异性上调;诱导mESC自然分化后,RT-qPCR检测实验表明XEN标志基因(Gata4、Gata6、Sox17)的mRNA表达出现显著上调(P<0.001),而中胚层、外胚层基因没有特异性变化。GSEA结果提示DUX可能激活了视黄醇代谢信号通路,ChIP-seq数据解析进一步揭示在DUX结合的peaks中存在已知的视黄酸受体motif,可激活下游与XEN发育相关的靶基因。结论·DUX与视黄酸信号通路密切关联,预示其激活了视黄酸信号通路,促进mESC倾向XEN分化。

视黄酸核受体γ重组腺病毒构建及其鉴定

目的构建携带大鼠视黄酸核受体γ（retinoic acid receptor γ，RARγ）的重组腺病毒，为研究RAR3,在骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）成神经分化中的作用奠定基础。方法体外扩增大鼠础研基因，将其定向克隆至腺病毒穿梭质粒pAd Trace—TOX构建重组质粒pAdTrace—RARγ，并在BJ5183菌中与骨架质粒pAd Easy-1重组获得腺病毒载体pad—RARγ，Pac I酶切后转染HEK293细胞包装腺病毒。腺病毒Ad—RARγ感染大鼠MSCs，Real—time PCR和Western印迹检测RARγ的表达。结果PCR，酶切及测序均证实础研正确克隆至腺病毒质粒载体中，Ad—RARγ对MSCs感染率达60％～70％，并明显增强础研基因和蛋白的表达。结论成功构建携带RARγ的重组腺病毒，并具有上调大鼠MSCsRA脚基因和蛋白表达的功能。