慢病毒介导小鼠K26/KAP26.1基因过表达对相关基因的调控作用

【目的】利用慢病毒介导过表达技术,明确小鼠K26和KAP26.1基因过表达后对角蛋白关联蛋白基因KAP6.2、KAP7.1、KAP8.2、KAP11.1和对骨形态发生蛋白基因BMP-4、BMPR-IB的影响,探究小鼠绒毛细度变化的影响机制,达到人为调控(如慢病毒载体技术)使相关基因过表达,改善动物绒毛品质的目的,为哺乳动物绒毛细度调控的研究奠定理论基础,【方法】试验在辽宁省生物技术与分子药物研发重点实验室完成,小白鼠采自大连医科大学实验动物中心,选取出生后5周龄昆明种雄鼠。在Genebank查找到小鼠基因K26(Gene ID:NM_001033397)及KAP26.1(Gene ID:NM_027105.2)序列,根据目的基因序列设计引物,将质粒转入生长状态良好的293T细胞,构建小鼠K26和KAP26.1基因慢病毒过表达载体,将含有目的基因K26及KAP26.1的慢病毒表达载体分别转染小鼠皮肤成纤维细胞,用荧光显微镜观察其转染情况,确定慢病毒表达载体转染成功后,从病毒感染后的细胞中抽提总RNA,将RNA反转录成c DNA后放入Eppendorf Realplex荧光定量PCR仪,检测K26和KAP26.1基因过表达对KAP6.2、KAP7.1、KAP8.2、KAP11.1、BMP-4和BMPR-IB基因表达的影响。【结果】经RT-PCR检测,证明小鼠慢病毒载体p Lenti6.3-K26-IRES-EGFP和p Lenti6.3-K26.1-IRES-EGFP构建成功。经荧光场对比,发现目的慢病毒载体转染293T细胞72h时转染率最高。经PCR检测,证实包装好的目的慢病毒K26及KAP26.1转染小鼠成纤维细胞72 h后转染成功。经RT-PCR检测与SPSS Statistics 19软件分析目的基因表达量与阳性对照组(空载体质粒组,BLACK)、阴性对照组(小鼠表皮成纤维细胞,NC)表达量之间的显著性差异,发现K26基因过表达会导致KAP26.1基因上调,反之亦然,说明K26和KAP26.1基因之间存在一定的协同作用;K26和KAP26.1基因过表达后,均能导致KAP6.2、KAP7.1、KAP8.2、KAP11.1基因下调;K26基因过表达能使BMP-4基因表现为上调,而BMPR-IB基因表现为下调;KAP26.1基因过表达时,BMP-4和BMPR-IB基因均表现为上调。【结论】K26与KAP26.1基因在毛囊的内根鞘中起到协同作用,K26和KAP26.1基因的高表达会抑制KAP6.2、KAP7.1、KAP8.2、KAP11.1基因的表达,影响m TOR下游蛋白合成信号,进而起到调节绒毛粗细的作用;K26和KAP26.1基因过表达均能使BMP-4基因表现为上调,BMP-4是BMP信号通路的激活剂,能够激活BMP信号通路向下游转导,进而影响到毛囊的发育周期;K26基因过表达下调BMPR-IB基因的表达,而KAP26.1基因过表达上调BMPR-IB基因的表达,BMPR-IB基因是BMP信号的Ⅰ型受体,当BMPR-IB受体减少时,会抑制BMP信号向下游转导,从而使绒毛生长周期重新开始;当BMPR-IB受体增加时,会促进下游信号分子转录,进而影响毛囊发育周期。说明K26和KAP26.1基因过表达均能激活BMP信号通路,并由BMP和m TOR信号调节KAP6.2、KAP7.1、KAP8.2、KAP11.1、BMP-4和BMPR-IB基因的表达,但K26与KAP26.1基因对BMPR-IB基因的相反调节作用有待深入研究。

羊毛KAPs家族基因及转录因子AP-1调控作用预测的研究进展

羊毛是养殖业重要的畜产品,具有较高的经济价值。角蛋白关联蛋白(KAPs)是羊毛纤维主要的蛋白质成分,包含诸多亚家族,构成了羊毛的主体,同时也决定了羊毛的各类经济性状。羊毛生长发育过程中角蛋白关联蛋白基因(KRTAPs)受到各种转录因子调控,KRTAPs表达具有高度的组织特异性和时空性,转录因子是KRTAPs表达的核心调控因素。本文主要从KAPs分类及其家族基因与羊毛性状的关系、转录因子AP-1的分类和功能以及KRTAPs启动子区域AP-1结合位点的预测等方面进行概述,以期为探究羊毛组分及其基因相关功能和羊毛性状的分子育种提供理论参考。

新吉细毛羊KAP24.1基因多态性及羊毛性状的相关性分析

为了解角蛋白关联蛋白(KAP)24.1基因在新吉细毛羊群体中的多态性与其毛用性状的关联性,试验采用DNA测序法对新吉细毛羊基因组编码区进行测序,找出基因突变位点,然后采用PCRSSCP技术对497只新吉细毛羊KAP24.1基因编码区序列进行多态性分析,并利用最小二乘模型对其多态性与产毛量、纤维直径、拉伸长度进行关联性分析。结果表明:在编码区有两处突变点,一处在348 bp处发生C→T的突变,脯氨酸突变为亮氨酸;另一处在414 bp处发生T→C的突变,丝氨酸突变为脯氨酸,均属于错义突变,KAP24.1基因的AA、AB、BB和CC基因型与纤维直径不相关(P>0.05),BB基因型的产毛量和拉伸长度显著大于AB基因型、CC基因型(P<0.05)。说明KAP24.1基因可以作为新吉细毛羊产毛量和拉伸长度主要候选基因之一,BB基因型可以作为分子标记用于预测绵羊产毛量和拉伸长度。