基于量子点的非洲猪瘟病毒抗体荧光免疫层析试纸研制

为了研发灵敏、准确的非洲猪瘟快速诊断试纸产品,本研究基于免疫层析技术原理,以非洲猪瘟病毒(ASFV)p72蛋白三聚体为检测抗原,量子点(QDs)为标记材料,金黄色葡萄球菌A蛋白(SPA)为检测线,p72单克隆抗体为质控线,建立了非洲猪瘟病毒抗体荧光免疫层析试纸,并对试纸的检测性能进行鉴定。结果:荧光免疫层析试纸检测ASFV标准阳性血清的效价为1∶102400,与猪瘟病毒、口蹄疫病毒、伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸道综合征病毒及猪圆环病毒2型阳性血清抗体无交叉反应,在临床样本检测中与商业化ASFV抗体检测试剂盒的符合率为92.92%。综上,该试纸具有良好的灵敏度、特异性、准确性及稳定性,可用于临床样品中ASFV抗体的快速筛查。

减蛋综合征病毒抗体胶体金免疫层析试纸条的研制及初步应用

为建立快速检测减蛋综合征病毒(EDSV)抗体的方法,基于EDSV的Fiber蛋白,制备快速检测EDSV抗体的免疫层析试纸条,为养禽业提供针对病原微生物的感染预警及免疫评估。利用胶体金标记EDSV Fiber蛋白抗原为探针,将羊抗鸡IgG和抗Fiber蛋白的抗体包被到硝酸纤维膜上,分别作为质控线和检测线,对家禽EDSV抗体水平进行监测。结果表明,制备的EDSV免疫层析试纸条具有高度特异性,与其他家禽病毒抗体无交叉反应,仅与EDSV抗体反应,在试纸条上产生可见的检测线;并且制备的试纸条具有高度稳定性,在室温条件下可至少保存6个月。应用制备的检测EDSV抗体的免疫层析试纸条对从河南、安徽、山东等地养鸡场采集的576份鸡血清样本检测,与血凝抑制试验(HI)结果进行平行比较,二者的Kappa值为0.878,具有良好一致性。综上,制备的检测ESDV抗体的免疫层析试纸条具有高度的特异性、敏感性、稳定性和易操作性,对EDSV抗体的临床检测具有实际应用价值。

水产品中甲醛快速显色试纸的构筑与应用

为实现水产品中甲醛含量的现场快速检测,本研究基于溶胶-凝胶法将高碘酸钾、乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)构筑于滤纸表面,制得纳米显色前体物;利用4-氨基-3-联氨-5-巯基-1,2,4-三氮杂茂(AHMT)甲醛显色反应原理,使甲醛与AHMT在纳米显色前体物表面富集缩合并经高碘酸钾氧化,最终形成蓝紫色纳米显色复合物;通过自行开发的SHotPic 1.0软件分析试纸显色程度,快速得到待测水产品中的甲醛含量。结果表明,甲醛含量与试纸显色深浅呈线性关系,相关系数达0.9719;纳米显色复合物在底物富集效应及纳米限域效应共同作用下显色蓝移并加深;试纸显色后经软件半定量可快速检测样品中甲醛含量,最低检出限为0.34 mg·kg^(-1)。本研究可为新型纳米显色剂开发和食品中有害化合物的快速直读显色分析提供理论指导和实践参考。

基于紫胶红素的靶标有色化免疫层析试纸条联检大肠杆菌O157∶H7和沙门氏菌

为摆脱免疫层析试纸条对配对抗体的依赖,文章设计了一种新型靶标有色化免疫层析试纸条,使用紫胶红素和十二合水硫酸铝钾媒染剂,通过先媒后染的方法,实现了免疫层析试纸条的“可视化”。验证结果显示,该试纸条对大肠杆菌O157∶H7和沙门氏菌的检测限均达到了106 CFU/mL;同时,与常见食源性致病菌间不存在交叉反应,在鸡胸肉、鸡蛋、牛奶等食品基质中能够在增菌9 h内检出。文章成功设计了一种操作简单、检测成本低,更易国产化的快速检测免疫层析试纸条,为后续免疫层析试纸条的设计提供了新思路。

污水中十二烷基磺酸钠快速检测试纸的研制

基于结晶紫与十二烷基磺酸钠在pH为7.00的缓冲溶液下发生反应,建立了一种十二烷基磺酸钠的快速检测试纸来判断污水中是否含有阴离子表面活性剂。结果发现,当浸渍1 mg/L结晶紫溶液的试纸和pH为7.00的缓冲溶液混合时(结晶紫溶液与缓冲溶体积比是3∶1)显色更明显;十二烷基磺酸钠浓度与显色深浅呈正比。该十二烷基磺酸钠检测试纸的检测最低值为0.05 mg/L,最高值为2 mg/L。配制样品测定结果的相对误差范围为1.167%~4.233%,表明该方法具有良好的准确性。

胶体金免疫层析试纸条在生物毒素检测领域的研究进展

胶体金免疫层析试纸条是一种常用的检测方法,广泛应用于疾病诊断、生物毒素检测等领域。该技术基于胶体金标记的特异性抗原(抗体)与待检样品中的目标分子相互作用,在试纸条上形成可见的测试线或信号变化。其流程包括样品预处理、标记抗体制备、试纸条组装步骤。胶体金免疫层析试纸条可以用于快速检测食品中的毒素残留、环境中的有害物质以及临床诊断中的相关指标。该技术具有无创、快速、灵敏和准确的特点,在临床应急检测和大规模筛查中能快速获得结果。文章总结了胶体金免疫层析试纸条技术及其在生物毒素检测中的研究进展,并分析了当前胶体金免疫层析试纸条技术的优缺点,展望了该技术在生物毒素检测领域的未来发展方向。

基于胶体金-适配体的层析试纸条检测玉米中黄曲霉毒素B_(1)

黄曲霉毒素B_(1)(AFB_(1))因其剧毒性及在粮食中分布广泛而成为人类健康和粮食安全的重大风险因素之一,因此建立快速、灵敏的检测方法十分必要。利用胶体金和适配体作为金标探针,构建一种新型层析试纸条以实现玉米中AFB_(1)的快速检测。根据体系中AFB_(1)存在会减弱生物素标记的适配体与金标探针的结合,从而导致试纸条检测线的颜色强度降低或消失,进而实现对AFB_(1)高效灵敏检测。在最佳条件下,试纸条检测AFB_(1)的检出限值低至0.5 ng/mL,在0.5~500 ng/mL范围内快速准确检测且对AFB_(1)具有高度的特异性。本研究制备的适配体试纸条能够成为玉米中AFB_(1)检测的有效方法,具有良好的应用前景。

一种通用型半抗原免疫层析试纸的制备及在双咪苯脲上的应用

为了提高单克隆抗体筛选效率,降低免疫层析检测方法建立门槛,利用生物素标记人工抗原为探针,以亲和素固定于硝酸纤维素膜上为检测线,建立了通用型半抗原免疫层析试纸,并将其应用于双咪苯脲(IM)单克隆抗体的筛选及残留检测。结果表明,利用碳二亚胺法成功制备了IM人工抗原及生物素探针;通过免疫小鼠及杂交瘤细胞技术制备单克隆抗体;应用试纸筛选,成功获得IM单克隆抗体细胞株1株,其效价为1∶32000,灵敏度为6.25 ng/mL。基于该单抗及通用型半抗原免疫层析试纸建立了IM免疫层析检测试纸,检测牛奶中IM的灵敏度为7 ng/mL。该试纸及其探针制备方法可以通用于半抗原抗体筛选,为抗体筛选提供了一种更高效的方法;无需免疫层析试纸研发平台即可建立半抗原免疫层析检测方法,为免疫层析试纸的研发提供了新的技术手段。

一种检测砷(Ⅲ)的适配体试纸条

利用三明治夹心法构建基于适配体胶体金的试纸条,目的在于开发切实可行的As(Ⅲ)检测应用装置。通过As(Ⅲ)与金标适配体的特异性结合,将其截留在试纸条检测线处。纳米金作为显色材料,其颗粒直径为(13±1)nm。经过优化反应条件,选择Satorius CN 140作为硝酸纤维素膜,控制线上捕获探针链霉亲和素与生物素的最佳比例为1∶4,对应的划线浓度为10μmol/L。检测线上1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐与N-羟基琥珀酰亚胺的最优比例为1∶3,金标适配体最优浓度为0.5μmol/L。在最佳反应条件下,观察试纸条的显色结果,颜色响应信号与砷浓度形成很好的梯度关系,检测限为0.1μmol/L。本试纸条对As(Ⅲ)具有高度的特异性,并且稳定性良好。其检测成本不足1元,可满足低收入地区普通人群实时检测As(Ⅲ)的要求。

包装饮用水中痕量铜绿假单胞菌核酸试纸条快速、可视化检测分析

目的:建立基于胶体金标记的侧向层析免疫试纸快速检测新技术检测包装饮用水中铜绿假单胞菌的方法。方法:利用喷膜仪以0.5μL/cm的喷速将1 mg/mL的羊抗鼠抗体、1 mg/mL的链霉亲和素喷到硝酸纤维素膜上,再通过静电吸附的方式将异硫氰酸荧光素抗体偶联到胶体金表面,制备成偶联物滴加到金标垫上。将扩增产物滴加到组装完整的侧向层析免疫试纸条上,根据质控、检测线位置的显线情况进行判定。结果:该方法能够对包装饮用水中的铜绿假单胞菌进行特异性识别鉴定,3 min便可获得检测结果,检出限为1 CFU/250 mL,较琼脂糖凝胶电泳结果更灵敏。结论:本研究建立的对包装饮用水中铜绿假单胞菌的侧向免疫试纸方法具有灵敏度高、特异性强、简单便携等技术优势,可用于实际样本的检测。

农药残留快速检测试纸条的研制及应用

简单快速地筛查有机磷和氨基甲酸酯类农药残留对食品安全具有重要意义。采用酶抑制法,以重氮固红RC盐为指示剂、乙酸吲哚酚为乙酰胆碱酯酶(AChE)底物,设计开发了一种一步式快速检测试纸条。该试纸条底部为塑料胶板,上面依次粘贴样品垫、酶垫、阻滞垫、底物垫、吸附垫和固定有重氮固红RC盐的硝酸纤维素(NC)膜,通过检测区域颜色的变化可以实现农药残留的定性或定量分析,操作方法简单快捷。不同农药的检出限分别如下:马拉硫磷为0.6 mg·L^(-1),氧化乐果为0.4 mg·L^(-1),乙酰甲胺磷为1.3 mg·L^(-1),敌敌畏为0.1 mg·L^(-1),呋喃丹为0.1 mg·L^(-1),涕灭威为0.07 mg·L^(-1),且在实际果蔬样品检测中显示出良好的重现性和高灵敏度。

环介导等温扩增技术结合乳胶微球试纸条检测副溶血性弧菌

目的建立环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术结合乳胶微球试纸条(latex microsphere test strips,LMTS)快速检测副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus,VP)的方法。方法以副溶血性弧菌的不耐热溶血素(TLH)基因作靶标设计引物,6-羧基荧光素(6-carboxyfluorescein,6-FAM)和生物素(Biotin)标记引物,对体系各项反应参数进行优化;将新鲜菌液作10倍梯度稀释后进行LAMP、聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)和实时荧光定量LAMP(quantitative LAMP,qLAMP)反应,比较三者的敏感度;对副溶血性弧菌、大肠埃希氏菌、福氏志贺氏菌、粪链(肠)球菌、单核细胞增生李斯特菌、鼠伤寒沙门氏菌、铜绿假单胞菌进行LAMP扩增,验证其特异性;虾样品用菌液进行模拟污染,分析LAMP-LMTS的可靠性。结果LAMP-LMTS方法的灵敏度可达4.16×10^(2)copies/μL,与qLAMP、LAMP-琼脂糖凝胶电泳(agarose gel electrophoresis,AGE)方法结果一致,检出限要比利用外引物建立的PCR方法低10倍的拷贝数,灵敏度更高。结论该方法检测副溶血性弧菌具有检测时间短、灵敏度高、特异性强、操作简便等特点,可应用于基层实验室、应急检测或现场监测,具有较高的推广价值。

检测牙龈卟啉单胞菌胶体金试纸条的制备与应用

目的制备简单、快速检测唾液P.gingivalis的胶体金试纸条。方法采用识别P.gingivalis不同表位的单抗E10、G3建立双抗夹心ELISA体系,鉴定双抗夹心ELISA识别P.gingivalis的特异性及敏感性。利用单抗E10、G3制备胶体金试纸条,检测胶体金试纸条识别P.gingivalis的特异性。应用胶体金试纸条与实时定量PCR检测受试者唾液P.gingivalis并比较二者检测P.gingivalis的差异。结果单抗E10、G3建立双抗夹心ELISA体系可特异性识别P.gingivalis,识别敏感性≥5×10^(7)CFU/mL。单抗E10和G3制备的胶体金试纸条特异性识别P.gingivalis。胶体金试纸条与实时定量PCR分别检测受试者唾液P.gingivalis,试纸条与PCR检测对牙周炎的检出效果无统计学差异,检测P.gingivalis的细菌数量无统计学差异。胶体金试纸条检测唾液P.gingivalis,牙周炎组、牙周健康组阳性率分别为40%、10%。结论制备出检测P.gingivalis的胶体金试纸条,可特异性检测P.gingivalis,具有检测唾液中P.gingivalis的潜力。

鹅痛风尿酸快速检测试纸的建立

鹅痛风是雏鹅常见的代谢性疾病,常因为病原体感染,中毒,营养摄入等因素导致鹅体内尿酸(Uric acid,UA)代谢障碍,引发病鹅内脏和关节处大量尿酸盐蓄积,导致雏鹅死亡。为了能够快速诊断鹅痛风,减少养鹅业的损失,本研究通过建立高钙高蛋白的雏鹅痛风模型,制备尿酸干化学试纸条检测雏鹅尿酸水平,并进行临床应用评价。结果表明,饲喂高钙高蛋白饲料的雏鹅在7日龄时,血液尿酸含量显著升高(P<0.05),但仍处于正常水平(UA≤200μmol/L);14日龄时,饲喂高钙高蛋白饲料的雏鹅血液尿酸含量远高于正常水平(UA≥400μmol/L)。本研究制备的鹅痛风尿酸快速检测试纸可通过与血液中尿酸反应,区分血液尿酸含量,达到快速诊断的效果。

基于核酸扩增-侧流层析试纸的食源性致病菌快速检测研究进展

食源性致病菌严重危害食品安全。传统的致病菌检测方法费时耗力,难以应对现代食品安全检测快速、简便的需求。分子生物学检测方法,如聚合酶链式反应法、等温核酸扩增法以及基于规律成簇间隔短回文重复序列的核酸检测技术等,已被广泛应用于食源性致病菌检测,为保障食品安全发挥了重要作用。近年来,联用核酸扩增检测技术和免疫层析技术成为食源性致病菌快速检测的研究热点。本文总结了核酸扩增和侧流层析试纸联用快速检测食源性致病菌的研究进展,重点讨论了其优缺点,并展望其未来发展方向,以期为食源性致病菌的检测和防控提供参考。

副结核分枝杆菌重组酶介导扩增-侧向流试纸条检测方法的建立与初步应用

旨在建立一种副结核分枝杆菌(Mycobacterium avium subsp.paratuberculosis,MAP)精准快速的检测方法,结合重组酶介导扩增(recombinase-aid amplification,RAA)和侧向流试纸条(lateral flow dipstick,LFD)技术,以MAP的特异性多拷贝插入元件IS900设计引物和探针,通过优化反应时间和温度等条件,建立可用于MAP现场可视化检测的RAA-LFD方法。该检测方法在35℃条件下恒温反应30 min即可实现对MAP目的基因的有效扩增。试验结果显示:该方法可特异性地检测出MAP,不与其他常见的病原发生交叉反应;对MAP标准品的最低检测限可达到10 fg·μL^(-1);使用该方法对149份牛奶样品进行检测,与传统的PCR相比,其敏感性为100%。综上,本研究成功建立了一种针对于MAP的精准快速的试纸条检测方法,并具有广泛的应用前景。

基于金纳米棒免疫层析试纸条快速检测玉米中的黄曲霉毒素B_(1)

传统的基于球状胶体金(Au spheres,AuSPs)试纸条由于检测灵敏度偏低,无法满足食品安全高灵敏检测的需求。因此,建立高灵敏、快速分析方法尤为重要。以黄曲霉毒素B_(1)(aflatoxin B_(1),AFB_(1))为检测对象,金纳米棒(Au nanorods,AuNRs)作为信号标签,偶联抗AFB_(1)单克隆抗体作为金标探针,基于竞争法制备免疫层析试纸条对玉米中AFB_(1)进行检测,试验结果通过便携式试纸条定量分析仪定量检测。结果表明:在单抗加入量为0.6μg、T线抗原质量浓度为0.1 mg/mL、探针使用体积为2.5μL的条件下制作标准曲线,基于AuNRs的试纸条检出限为0.124 ng/mL,IC50为1.593 ng/mL,此外实际玉米样品中对AFB_(1)的回收率为89.50%~111.70%;对玉米质控样进行检测,结果与所建立的方法一致。该方法可应用于玉米中AFB_(1)的快速检测,检测结果符合国家标准,具有良好的应用前景。

β-乳球蛋白光热免疫层析试纸条的研制

目的研制β-乳球蛋白(β-lactoglobulin,β-Lg)光热免疫层析试纸条。方法合成了具有高光热转换效率(η=47.5%)的硫化钴-单宁酸(cobalt sulfide-tannic acid,CoS@TA)纳米球,并将其与多克隆抗体偶联制备光热免疫探针,同时优化了抗体标记量、抗体包被浓度以及试纸条的各项工作条件,在此基础上建立了一种基于CoS@TA的β-Lg光热免疫层析试纸条(photothermal immuno-chromatographic test strip,PITS)检测方法。结果该免疫层析法中视觉检出限为250μg/L,光热检出限为26.44μg/L,比视觉检出限高出9.5倍,同时具有良好的特异性,并通过在婴幼儿氨基酸奶粉中的添加回收实验和商用酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)试剂盒验证了该方法在实际样品检测中的有效性。结论该方法使用便携仪器即可实现对β-Lg的快速、高灵敏定量检测,可用于奶粉的快速检测。

牛传染性鼻气管炎病毒胶体金检测试纸条的研制和评价

为建立快速检测牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的病原学检测方法,本试验采用杂交瘤细胞融合技术制备IBRV单克隆抗体,以其作为检测原,优化反应条件并组装IBRV胶体金检测试纸条,验证该试纸条的特异性、灵敏性、敏感性和稳定性,并与实时荧光定量PCR(qPCR)进行比较分析。结果显示,共制备7株针对IBRV的单克隆抗体,其中以胶体金标记的单克隆抗体2B7作为捕获抗体、1B9作为检测抗体,建立的胶体金检测试纸条能够检测样品中的IBRV;该试纸条与病毒性腹泻/黏膜病毒、牛冠状病毒和大肠杆菌无交叉反应,检测限为4.04×10~4TCID50/0.1 mL,敏感性为86.7%;在室温条件下保存12个月仍能够有效检测IBRV,说明该试纸条稳定性良好。与qPCR比较结果显示,2种方法检测结果的符合率为92.85%,说明该胶体金检测试纸条能够用于IBRV的临床诊断。结果表明,本试验利用IBRV的单克隆抗体建立的胶体金检测试纸条灵敏度高且特异性好,为IBRV抗原检测和流行病学调查提供技术支持。

重组酶聚合酶扩增结合侧向流动试纸条技术快速可视化检测嗜麦芽窄食单胞菌方法的建立与应用

目的:建立一种基于重组酶聚合酶扩增(recombinant polymerase amplification,RPA)和侧向流动试纸条(lateral flow strips,LFS)的嗜麦芽窄食单胞菌快速可视化检测方法。方法:以嗜麦芽窄食单胞菌特异性序列(NC_010943.1)为模板,设计RPA引物。通过基础型RPA反应和琼脂糖凝胶电泳,根据候选引物对的扩增性能及引物二聚体的形成情况筛选最佳引物对。根据最佳引物对,设计探针和修饰引物。在引物和探针中引入碱基错配以消除假阳性信号,建立RPA-LFS反应体系。根据检测线的显色情况,优化RPA-LFS的最佳反应条件。使用临床常见的12种致病菌和12个临床来源的嗜麦芽窄食单胞菌检测该方法的特异性。以10倍梯度稀释的嗜麦芽窄食单胞菌基因组为模板,检测该方法的灵敏度。收集108例临床样本,将该方法与qPCR检测法和生化培养法对比,对RPA-LFS检测法进行kappa一致性检验及临床应用评价。结果:RPA-LFS检测法在37℃恒温条件下8 min即可完成扩增反应,1 min内可在LFS上观察到结果。该方法灵敏度高,最低检出限为1.107 CFU,并且与其他病原菌无交叉反应,特异性强。应用于临床样本检测时,该方法与qPCR相比,检测结果准确性一致。与生化培养方法的符合率为99.07%,kappa指数值为0.972,具有良好的一致性。结论:本研究建立了一种不依赖于精密仪器和专业技术人员的RPA-LFS检测方法,能够短时间内精准鉴定嗜麦芽窄食单胞菌。该方法的建立可为及时制定合理的抗菌治疗方案提供信息,具有较大的临床应用潜力。