面肩肱肌营养不良症患者外周血单个核细胞来源的诱导多能干细胞的构建及骨骼肌分化

目的建立并鉴定面肩肱肌营养不良症(FSHD)患者外周血单个核细胞(PBMC)来源的诱导多能干细胞(iPSCs),初步探讨其骨骼肌分化能力,评估该细胞模型应用于疾病机制研究的可行性。方法收集1例FSHD患者的PBMC,用含4个重编程转录因子(OCT4、SOX2、KLF4和c-MYC)的仙台病毒感染PBMC并获得FSHD患者来源的iPSCs,继续诱导其骨骼肌分化。通过基因组光学图谱技术、核型、免疫荧光染色、实时荧光定量PCR等分析iPSCs和骨骼肌细胞特性。结果成功获得FSHD患者来源的iPSCs,其可表达多能干性标记。FSHD-iPSC核型及D4Z4拷贝数结果与患者的临床背景一致,并在体外可定向诱导分化为骨骼肌细胞,该细胞同时表达DUX4致病基因以及调节基因。结论FSHD患者来源的PBMC可重编程为iPSCs,FSHD-iPSC可分化为疾病相关的肌源组细胞及肌管细胞,为FSHD发病机制的体外研究提供了良好的细胞模型,并为寻找该病的有效治疗手段提供了工具。

人诱导多能干细胞用于心血管疾病治疗的研究进展

现阶段中国心血管疾病高发,传统治疗方式包括药物缓解和介入手术治疗,仅减缓疾病进展而无法逆转已存在的组织损伤,其治疗周期长、患者医从性低。故急需对此类疾病进行更深入的研究,以提出更有效的治疗方案,因此人诱导多能干细胞作为新的突破口为疾病治疗提供了思路。人诱导多能干细胞不仅可直接替代和间接修复受损的细胞,补偿心脏收缩功能;还能通过构建特定的疾病模型来作为个体基因组学、蛋白组学的研究平台,从而深入剖析疾病的机制与进程,实现疾病个体化预测、预防和治疗,达到提高患者心脏泵血功能、延长生存期限的最终目的。现对人诱导多能干细胞用于心血管疾病治疗做一综述。

诱导多能干细胞瘤变的研究进展

诱导多能干细胞(IPSC)是体细胞重编程后得到的与胚胎干细胞相似的具有自我更新和多向分化潜能的细胞,这一发现成功避开了胚胎干细胞的伦理问题。自IPSC问世,这项技术就迅速应用于疾病建模、药物开发、再生医学和基因调控,尤其是再生医学自体移植研究领域。但是,IPSC移植后瘤变成为IPSC用于再生医学的一大阻碍,因此IPSC的瘤变成为当前IPSC研究的热点问题。本文就IPSC与肿瘤细胞的关系、IPSC移植后成瘤机制、降低IPSC移植后瘤变率以及IPSC移植后体内监测技术等几个方面进行简要综述。

毛蕊异黄酮对人诱导多能干细胞内皮分化的影响及机制

背景:内皮损伤是心血管疾病的诱因之一,人诱导多能干细胞易于获得、分化能力强、排异性较小,其内皮分化细胞可被用作心血管疾病研究的理想细胞。目的:探讨毛蕊异黄酮对人诱导多能干细胞定向内皮分化的作用及机制,为微血管再生提供技术支持。方法:将人诱导多能干细胞分为对照组与毛蕊异黄酮1.25,2.5μg/mL组,进行内皮定向诱导分化。诱导分化8 d后,采用流式细胞术检测各组细胞内皮细胞标志物CD144阳性率,免疫荧光技术检测CD144、CD31荧光表达。利用慢病毒RNAi-GFP puromycin沉默人诱导多能干细胞Piezo1 mRNA,再进行内皮定向诱导分化,诱导分化8 d后,采用流式细胞术检测分化细胞CD144阳性率,qPCR检测CD144、Piezo1、MEK的mRNA表达水平。结果与结论:①与对照组相比,毛蕊异黄酮1.25,2.5μg/mL组CD144阳性率显著升高(P<0.05);毛蕊异黄酮2.5μg/mL组CD144、Piezo1、MEK mRNA表达水平提高(P<0.05);毛蕊异黄酮2.5μg/mL组CD144(P<0.01)和CD31(P<0.001)荧光表达显著升高;②与shNT组相比,shNT+毛蕊异黄酮1.25,2.5μg/mL组CD144阳性率和CD144、Piezo1、MEK mRNA表达显著升高(P<0.05),与shPiezo1组相比,shPiezo1+毛蕊异黄酮1.25,2.5μg/mL组CD144阳性率和CD144、Piezo1、MEK mRNA表达无显著变化(P>0.05);③实验结果提示2.5μg/mL毛蕊异黄酮能够促进人诱导多能干细胞内皮分化,毛蕊异黄酮可以通过靶向调节Piezo1表达水平,促进下游MEK表达,从而促进人诱导多能干细胞内皮分化。

诱导多能干细胞在遗传性心脏疾病模型中的应用与机制

背景:遗传性心脏病具有较高的患病率及死亡率,至今其发病机制仍未阐明。尽管部分遗传性心脏病已经建立了相应的动物模型,为研究遗传性心脏病的发病机制提供了一定的基础,但是由于物种间的差异等原因显著降低了这些研究结果的价值,因此,需要全新的模型来探索其发生发展过程。目的:综述了目前诱导多能干细胞在构建多种遗传性心脏病模型中的作用和潜在的应用前景。方法:第一作者于2023年1-3月期间应用计算机在Pub Med数据库中检索近13年的相关文献,以“induced pluripotent stem cell,inherited heart disease,congenital heart disease”等为检索词,最终纳入76篇文献进行分析。结果与结论:自2007年诱导多能干细胞从人体体细胞中诱导建立以来,已有许多针对疾病特异性诱导多能干细胞的研究报道。由于疾病特异性诱导多能干细胞能够再现疾病表型,因此有望成为体外疾病建模的一种新研究工具,用于分析发病机制和研制辅助药物。在心血管遗传性疾病的研究方面,从患者特异性诱导多能干细胞分化得到的心肌细胞中含有参与心脏发育异常相关的基因突变,因此,其可作为一种全新的工具研究遗传性心脏病的潜在机制。到目前为止,诱导多能干细胞来源心肌细胞已被广泛用于多种遗传性心脏疾病的分子机制研究,如心脏电生理性疾病、心肌病以及一些综合征性遗传性心脏疾病。

人诱导多能干细胞来源功能性胰岛β细胞的体外定向分化方法的建立

1型糖尿病是由胰岛β细胞功能受损、胰岛素分泌不足所致,目前,主要通过外源性胰岛素补充来治疗,但外源性胰岛素无法精准调控血糖,严重低血糖可危及生命。胰岛移植是一种替代疗法,但面临器官供体不足和异种来源胰岛β细胞存在人畜共患病交叉感染风险的问题。因此,获得足量且安全的胰岛β细胞是1型糖尿病细胞治疗面临的难题。本研究旨在通过人诱导多能干细胞(human induced pluripotent stem cells,hiPSCs)在体外向胰岛β细胞分化,提供一种潜在的1型糖尿病治疗新策略。为实现这一目标,我们采用了结合2D和3D培养系统的分化策略,模拟胰岛β细胞的体内发育环境,并使用多种生长因子调节在胰腺发育和β细胞分化中发挥重要作用的关键信号包括Notch信号通路(Notch signaling pathway)、Wnt信号通路(Wnt signaling pathway)、TGF-β/Smad信号通路(TGF-β/Smad signaling pathway)等,在体外将hiPSC定向诱导分化至胰岛β细胞。结果显示,在2D、3D结合的培养条件下,分化过程中定型内胚层细胞,胰腺祖细胞,胰腺内分泌细胞及胰岛β细胞阶段的特异性基因的表达显著提高(P<0.05),并在胰岛素含量及葡萄糖刺激后表现出显著增强的胰岛素分泌能力(P<0.05)。总之,本研究成功建立了一种从hiPSC到功能性胰岛β细胞的分化策略,为1型糖尿病提供了一种新的细胞治疗途径。这种方法不仅为研究胰岛β细胞的发育生物学提供了新的工具,也为临床应用提供了一种潜在的胰岛β细胞来源,有望解决现有治疗方法的局限性。

基于人诱导多能干细胞的组织工程化软骨再生

目的:构建一种稳定高效的人诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)向软骨中胚层方向分化的培养方法,初步探究hiPSCs来源的软骨用于关节软骨再生的可能。方法:通过模拟体内发育过程和三维(three dimensions,3D)悬浮培养体系,逐步诱导hiPSCs向软骨中胚层和成熟的软骨组织分化;利用实时定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)、蛋白质印迹法(Western blotting)、免疫荧光及免疫组织化学技术检测整个培养过程中多能干性、中胚层及软骨相关基因和蛋白的动态变化;最后利用裸鼠皮下模型研究hiPSCs软骨球软骨表型的稳定性及成瘤性。结果:通过模拟体内发育过程,成功逐步诱导hiPSCs向软骨中胚层方向分化,最终分化为成熟的软骨组织。结论:本研究成功构建了一种稳定高效诱导hiPSCs向软骨中胚层方向分化的培养体系,为探究hiPSCs介导的软骨组织发育和再生提供了一个研究平台。

诱导多能干细胞来源的间充质干细胞的治疗潜力与应用风险

诱导多能干细胞衍生的间充质干细胞(iMSC)已被提出作为原代间充质干细胞(MSC)的替代来源,在疾病治疗相关研究中也显示出多种优势。但是iMSC更适用于何种疾病类型,以及是否具有潜在的风险均未被充分阐明。本研究利用公共数据库中的高通量测序数据,将iMSC与骨髓源的MSC(BM-MSC)、脂肪源的MSC(AD-MSC)和脐带源的MSC(UC-MSC)进行对比,通过不同生物信息学方法,包括差异表达基因分析、功能富集分析、蛋白质相互作用网络分析及CMap数据库筛选,结果表明,iMSC具有独特的基因转录特征,与3种常用的MSC在基因表达上存在显著差异,特别是在神经、肌肉发育和免疫调节相关基因表达上;差异基因的功能富集分析进一步证实,iMSC在神经相关疾病治疗中表现出潜在优势,同时具有较低的免疫原性,但也存在较高的成瘤性风险;通过CMap数据库分析,识别了可能抑制iMSC成瘤性的基因靶点和小分子抑制剂,为降低iMSC应用风险提供了可能的策略。综上所述,iMSC作为细胞治疗的潜在来源,在神经疾病治疗中具有潜在优势,但其安全性需通过更多实验和临床研究来验证。

利用人诱导多能干细胞构建心脏类器官方法的研究

目的:探索人诱导多能干细胞(human induced pluripotent stem cells,hiPSCs)分化为心脏类器官的方法。方法:首先通过免疫荧光染色验证hiPSCs多能性标志物的表达;之后将hiPSCs培养为拟胚体(embryoid bodies,EBs),利用双向调控WNT(wingless and Int-1,WNT)信号通路法诱导EBs向心脏类器官分化,记录分化过程中的形态变化。最后,通过免疫荧光染色、实时定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)和微电极阵列(multi-electrode array,MEA)技术检测心脏类器官的细胞成分、基因表达谱、电生理特性和收缩舒张功能,验证心脏类器官分化方案的有效性。结果:免疫荧光染色显示hiPSCs中OCT4和SSEA4高表达。利用双向调控WNT信号的方法成功诱导hiPSCs产生跳动的心脏类器官。免疫荧光染色表明心脏类器官中cTNT阳性心肌细胞比例为(59.3±12.8)%,非心肌细胞比例为(40.7±12.8)%。qRT-PCR结果表明其中非心肌细胞包括平滑肌细胞、成纤维细胞及内皮细胞。与分化15D相比,分化30D的类器官中心肌成熟相关基因和心脏各项功能相关基因表达水平更高。MEA检测结果显示,随分化时间增加,类器官逐渐具备类似在体心脏的电生理特征,跳动频率减小[分化15d时跳动(58±5)vs.30d(38±5)次/min],收缩幅度增加15d时收缩幅度[(8.57±3.7)vs.30d(16.4±5.9)%]。结论:通过该方法能使hiPSCs分化出成熟且有功能的心脏类器官。

Pcgf2促进鸡胚成纤维细胞重编程形成诱导多能干细胞

【目的】以提高诱导鸡多能干细胞的干性为目的,利用Pcgf2基因与传统诱导多能干细胞的重编程因子共同诱导鸡多能干细胞。【方法】以鸡早期胚胎为模板,对Oct4、Sox2、Nanog、Lin28、C-myc、Klf4这6种传统的重编程因子及Pcgf2进行基因扩增,并与慢病毒载体重组为慢病毒质粒,在包装慢病毒并测定相对应的病毒滴度后,分组感染鸡胚成纤维细胞,在诱导的过程中对干细胞标记物进行检测。【结果】利用传统的重编程因子组合与加入Pcgf2共同诱导后的细胞都较早地表达出磷酸酶活性。加入Pcgf2诱导多能干细胞可以使细胞更早地出现类干细胞形态,且内源性基因Oct4、Sox2、Nanog和Lin28的表达得到更稳定的提高。【结论】Pcgf2在加入诱导体系后可以有效提高细胞的重编程接近干细胞状态。该研究可为选择重编程因子诱导鸡细胞完全重编程及其机制研究提供理论参考。

基于诱导多能干细胞治疗急性心肌梗死的临床前研究进展

诱导多能干细胞(iPSC)是通过导入外源基因或在培养基中加入化学物质等方法使体细胞去分化而获得。与胚胎干细胞类似,iPSC可以分化形成三种胚层细胞系。iPSC能通过二维分化方法(如单层细胞培养和共培养),或拟胚体诱导法和基于支架的三维细胞培养方法分化为心肌细胞。iPSC分化成心肌细胞的过程还需通过激活或抑制特定的信号通路(如Wnt、BMP、Notch信号通路)来模拟体内心脏发育过程。近年来,通过生物反应器进行细胞悬浮培养,已能产生足够数量的iPSC衍生的心肌细胞(iPSC-CM)。iPSC-CM在移植前需要通过代谢调节和细胞分选等方法进行纯化,以消除可能导致畸胎瘤形成的未分化iPSC。目前,iPSC-CM的主要移植方法为细胞悬液注射和细胞片移植。动物实验研究表明,将iPSC-CM移植到梗死心肌中能改善心脏功能。本文综述了上述关于iPSC-CM治疗急性心肌梗死的临床前相关研究,并讨论了iPSC-CM在临床应用中的局限性和挑战,以期为iPSC-CM的临床转化研究提供参考。

人诱导多能干细胞成骨分化的研究进展

骨骼疾病如骨质疏松、骨关节炎等已成为亟待解决的人类健康问题,细胞治疗及组织工程技术被认为是理想的治疗方法之一。人诱导多能干细胞(human induced pluripotent stem cells,hiPSCs)具备体外长期自我更新和分化所有三胚层来源体细胞的独特功能,已成为目前最有前景的成骨细胞来源。因此,需要构建成分明确的hiPSCs体外成骨向诱导分化体系,获得符合临床应用要求的成骨样细胞。许多团队在促进hiPSCs向成骨分化成熟的直接路径和经间充质干细胞的间接路径方面取得了实质性的进展,本文针对这两类成骨分化路径及其应用现状进行综述,以期为骨再生技术提供参考。现有研究借助拟胚体法和单层诱导法,基于生物材料,构建可支持hiPSCs体外培养和成骨向诱导分化体系。然而,目前的研究主要存在成分不明确,分化效率低等局限,基于特定化合物严格调控的分阶段式和三维定向诱导体系是未来的主要研究方向。

人诱导多能干细胞来源的心肌细胞研究进展

心血管疾病(CVD)是全球第一大致死疾病,各种CVD的临床终末阶段为心力衰竭。心脏移植是无禁忌证晚期心力衰竭患者的首选治疗方法^([1])。然而,心脏移植面临着供者不足、免疫排斥等诸多困难。人诱导多能干细胞(hiPSC)的出现为再生医学提供了可能,且避免了胚胎干细胞(ESC)引起的伦理问题,因而受到广泛关注。

ANO5非移码插入突变型GDD家系临床分析及其诱导多能干细胞的构建

目的:建立和鉴定临床发现的一个由ANO5基因新的致病性突变引起的颌骨骨干发育不良(gnathodiaphyseal dysplasia,GDD)家系中患病者和非患病者来源的诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,i PSCs)。方法 :纳入以颌骨畸形为主要表现的1个GDD家系5例患者,评估患者临床表现、骨影像学、骨密度、骨量等相关生化指标。收集家系中1例患病者与非患病者外周血样本,将表达Oct4、Sox2和Klf4转录因子的仙台病毒转染患病者和非患病者外周血单核细胞,将其重编程为i PSCs,并通过碱性磷酸酶染色、细胞免疫荧光、qPCR、核型分析等检测其干细胞多能性。结果:GDD主要表现为双侧上下颌骨弥漫性多发肿胀,并伴有全身骨密度下降。通过检测,证明患病者及非患病者外周血来源的i PSCs具有多能性。结论:GDD患者外周血单核细胞在体外可被成功诱导为无外源性基因整合的具有多能分化特性的i PSCs,为GDD的发病机制研究提供了高效直接的细胞模型。

诱导多能干细胞来源自然杀伤细胞的生物学特性

目的:利用诱导多能干细胞(iPSCs)建立体外扩增分化体系并进一步诱导分化为自然杀伤(NK)细胞。探讨iPSCs来源分化体系诱导分化来的NK细胞的生物学特性。方法:获取iPSCs,通过流式细胞术检测细胞分化功能的水平。结果:iPSCs经扩增和筛选,最后获得了可稳定未分化增殖的iPSCs,利用iPSCs成功分化NK细胞。结论:利用iPSC源分化体系成功在体外诱导出NK细胞,可产生大于90%CD45^(+)CD56^(+)细胞,有统计学差异(P<0.05)。NK细胞分化基本完全完成。其免疫表型的比例差异提示iPSCs-NK细胞具有不同的生物学特性。

基于流体剪切作用的全自动诱导多能干细胞获取技术研究

目的诱导多能干细胞(i PSCs)在个性化医疗和疾病模型建立中扮演着至关重要的角色。然而,传统的i PSCs单克隆获取方法存在效率低下、获取细胞纯度不高等问题。为了克服这些挑战,本研究基于流体剪切作用设计并验证一款能够自动化i PSC挑取、培养基换液、细胞扩增的机器人平台。通过研究流体剪应力对细胞谱系特异选择的力学-生物学作用机理,以期通过操作流体剪切力实现了对i PSC细胞筛选的策略。方法构建了一种集成了体细胞重编程培养、培养基更换、i PSC单克隆获取等多种功能的机器人平台。该平台利用流体动力学原理,通过精细的空间原位剪切流操纵实现对i PSCs单克隆细胞的特异性挑取。结果实验结果表明,基于流体剪切方法的细胞获取技术可以实现无酶、无损、无标记的方式进行i PSC细胞获取,并且可以基于细胞的黏附力差异,实现对不同谱系类型细胞的高特异性选择。与传统手动获取方法相比,采用流体剪切的挑取方法显著提升了i PSCs的挑取速度及细胞获取纯度(3.7倍)。结论本研究成功开发的基于流体剪切的机器人平台不仅显著提高了单克隆i PSCs的纯化效率和纯度,而且所获得的i PSCs保持了多能性特征。该平台可以作为从i PSCs中自动分离和纯化特定谱系细胞的有效工具,推动个性化医疗发展的进程。

体外培养时间对诱导多能干细胞源性心肌细胞成熟度的影响

背景:研究已证实诱导多能干细胞能够定向分化为心肌细胞,但目前很少有分化心肌细胞成熟度的研究报道。目的:探讨延长诱导分化时间对诱导多能干细胞源性心肌细胞的形态、肌节长度、双核细胞含量、心脏基因表达、心脏蛋白表达和线粒体功能的影响。方法:使用骨形态发生蛋白4、CHIR 99021和IWR1诱导多能干细胞向心肌细胞分化,分别在第20天和第40天收集分化心肌细胞;采用RT-PCR和免疫荧光检测分化心肌细胞中心脏基因和蛋白的表达水平;LAS X图像分析软件分析分化心肌细胞形态和肌节长度;MitoTracker Green FM线粒体染色检测线粒体总量,JC-1线粒体染色检测线粒体膜电位。结果与结论:与第20天的分化心肌细胞相比,第40天的分化心肌细胞的细胞周长和肌节长度更长、细胞面积更大(P<0.05);多核细胞比例从第20天的16%左右大幅上升至第40天的29%左右(P<0.05);第40天的分化心肌细胞具有与原代心肌细胞更相近的基因表达水平,SERCA2A、Cx-43和α-MHC基因表达水平明显高于第20天的分化心肌细胞(P<0.05);与第20天的分化心肌细胞相比,第40天的分化心肌细胞中TNNT2和α-MHC蛋白表达水平较高,线粒体分布密度更大,且功能性线粒体数量增加(P<0.05)。结果表明:延长诱导分化时间,可以通过增加肌节长度和功能性线粒体数量以及升高心脏基因和蛋白表达水平而提高分化心肌细胞的成熟度。

Rho激酶抑制剂Y27632促进人诱导多能干细胞来源原始神经上皮细胞向多巴胺能神经前体细胞的转化

目的提高人诱导多能干细胞来源原始神经上皮细胞(hiPSCs-NECs)定向诱导中脑多巴胺能神经前体细胞(DAPs)的效率。方法将人iPSCs在含有小分子组合[DMH1(10μmol/L)、SB431542(10μmol/L)、音猬因子(SHH 200 ng/mL)、成纤维细胞生长因8(FGF8100 ng/mL)、嘌吗啡胺(2μmol/L)、CHIR99021(3μmol/L)、N2(1%)]的mTeSRTM培养基中诱导至12 d,细胞分化为原始神经上皮细胞(NECs)。特异性诱导DAPs,将诱导的hiPSCs-NECs用胶原酶IV消化后,在神经分化培养基[添加1%N2、2%B27-A、BDNF(10 ng/mL)、GDNF(10 ng/mL)、AA、TGF-β、cAMP、1%GlutaMax]中加入不同浓度的Rho激酶抑制剂Y27632重新接种,并于次日更换培养基去除Y27632,持续诱导至第28天获得DAPs。结果人iPSCs可在基质胶上稳定传代,表达多潜能性标记物OCT4、SOX2、Nanog和SSEA1,且碱性磷酸酶染色呈阳性。诱导分化至第13天获得hiPSCs-NECs,形成玫瑰花结样结构,能够表达特征性标记物(SOX2、Nestin和PAX6)。将hiPSCs-NECs消化后,添加5μmol/LY27632的hiPSCs-NECs相比较未加Y27632的对照组,细胞解离后贴壁存活率明显增加,处于S期的细胞(P<0.01)与细胞活力显著提高(P<0.01),且凋亡率显著降低(P<0.05),持续诱导至第28天,细胞高表达DAPs特异性的标记物(TH、FOXA2、NURR1和Tuj1)。结论添加Y27632(5μmol/L)24 h可显著提高人iPSCs-NECs细胞向iPSCs-DA神经前体转化时的细胞存活率,并且Y27632去除后,不会影响后续向DA神经前体细胞分化,间接的提高了细胞的分化效率.

建立并鉴定一种基于人诱导多能干细胞的肝脏细胞定向分化实验方案

背景:人诱导多能干细胞是一种与胚胎干细胞特性高度类似的多能干细胞类型,具备三胚层分化潜能和持续自我更新能力。将人诱导多能干细胞定向分化成具备功能的肝脏细胞对临床肝脏替代治疗意义重大。目的:建立一种高效的基于人诱导多能干细胞的肝脏细胞定向分化实验方案。方法:利用明场显微镜、免疫荧光对人诱导多能干细胞特性进行鉴定。通过转录因子重组蛋白手段时序性调控不同信号通路,即在第0,5,10,15天顺序加入激活素A、成纤维细胞生长因子4/骨形态发生蛋白4、肝细胞生长因子、肿瘤抑制因子M,使多能干细胞经历终末内皮层、肝内胚层、肝母细胞(肝脏前体细胞)最终分化成为有功能的肝脏细胞。利用明场显微镜、实时定量PCR(qPCR)、ELISA动态观察不同阶段形态特征和分子标记物。结果与结论:①所使用的人诱导多能干细胞具备经典的诱导多能干细胞形态特征并且高表达诱导多能干细胞特异标记蛋白(SSEA4、SOX2、OCT4);②人诱导多能干细胞发生了终末内胚层、幼稚肝细胞、肝脏细胞不同阶段形态转变;③qPCR结果显示,随着肝细胞分化进展,诱导多能干细胞特异标记物(OCT4)显著下调,终末内胚层(GCS、CXCR4)和肝脏内胚层标记物(HNF4α、HNF1β)则呈现先升高再下调趋势,而肝脏细胞标记物(CYP34A、ALB)则呈现出逐渐递增趋势;④ELISA结果进一步显示,诱导15 d以后的肝脏细胞开始具备肝特异蛋白(白蛋白、尿素)分泌功能,并且随着时间延长其分泌功能进一步增加;⑤上述结果提示,成功建立人诱导多能干细胞向肝脏细胞定向分化的实验方案,为未来临床肝脏细胞替代治疗提供实验基础。

神经营养素-3过表达诱导多能干细胞治疗糖尿病性勃起功能障碍大鼠的实验研究

目的 探讨神经营养素-3过表达诱导多能干细胞(iPSC-NT-3)对糖尿病性勃起功能障碍(DIED)大鼠的治疗作用。方法 腹腔注射链脲佐菌素建立糖尿病模型大鼠,皮下注射阿扑吗啡对DIED模型进行验证。选择24只造模成功的DIED大鼠,随机分为模型对照组、诱导多能干细胞(iPSC)治疗组和iPSC-NT-3治疗组;腹腔注射柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液的8只SD大鼠作为正常对照组。各组大鼠腹腔注射戊巴比妥钠进行麻醉,iPSC治疗组和iPSC-NT-3治疗组分别将iPSC和iPSC-NT-3用微量注射针注射入大鼠阴茎海绵体内,正常对照组和模型对照组同法注射同体积的磷酸缓冲液。治疗后第4周,观察各组大鼠的一般情况,评估性功能和阴茎勃起功能。采用定量聚合酶链反应(q-PCR)和Western blot实验检测神经营养素-3(NT-3)、CD31、血管内皮生长因子(VEGF)、内皮型一氧化氮合酶(eNOS)、结蛋白(Desmin)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的mRNA和蛋白的表达。结果 治疗前和治疗后4周,模型对照组、iPSC治疗组和iPSC-NT-3治疗组大鼠体质量和血糖水平的组内、组间差异均无统计学意义(P>0.05)。在大鼠首次爬背时间比较中,模型对照组较正常对照组延长,iPSC治疗组、iPSC-NT-3治疗组较模型对照组缩短,iPSC-NT-3治疗组较iPSC治疗组缩短,差异均有统计学意义(P<0.05);在舔嗅次数、骑跨次数和插入次数的比较中,模型对照组均较正常对照组减少,iPSC治疗组、iPSC-NT-3治疗组较模型对照组增加,iPSC-NT-3治疗组较iPSC治疗组增加,差异均有统计学意义(P<0.05)。在ICP和ICP/MAP的比较中,模型对照组较正常对照组降低,iPSC治疗组、iPSC-NT-3治疗组较模型对照组升高,iPSC-NT-3治疗组较iPSC治疗组升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。在大鼠阴茎海绵体NT-3、CD31、VEGF、eNOS、Desmin和α-SMA的mRNA表达水平比较中,模型对照组较正常对照组降低,iPSC治疗组、iPSC-NT-3治疗组较模型对照组升高,iPSC-NT-3治疗组较iPSC治疗组升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。在大鼠阴茎海绵体NT-3、CD31、VEGF、eNOS、Desmin、α-SMA蛋白水平比较中,模型对照组较正常对照组降低,iPSC治疗组、iPSC-NT-3治疗组较模型对照组升高,iPSC-NT-3治疗组较iPSC治疗组升高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 iPSC-NT-3可通过促进海绵体组织eNOS、血管内皮及平滑肌的生成而改善DIED大鼠的性功能和勃起功能,是一种潜在的治疗DIED的方法。