G156A MGMT体外定点诱导突变及逆转录病毒载体的构建

目的获得含突变位点G1 5 6A(第 1 5 6位点的甘氨酸突变为丙氨酸 )的六氧甲基鸟嘌呤 DNA 甲基转移酶 (O6 methylguanine DNA methyltransferase ,MGMT) ,并构建含G1 5 6AMGMT(△MGMT)的逆转录病毒载体。方法通过体外定点诱导突变技术产生G1 5 6A突变的MGMT ,将其克隆入pGEM T载体 ,进一步亚克隆至G1Na逆转录病毒载体。结果通过DNA测序分析证实预期位点GGC(甘氨酸 )突变为GCC(丙氨酸 ) ,经PCR及酶切分析证实成功构建了逆转录病毒载体G1Na △MGMT。结论通过体外定点诱导突变技术成功获得了G1 5 6AMGMT ,并运用基因重组技术构建了逆转录病毒表达载体G1Na △MGMT ,为进一步将G1 5

反义阻断REV3基因表达对细胞自发突变和MNNG诱导突变的影响

目的 :通过反义核酸技术研究REV3基因对次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶基因HPRT的自发突变频率及烷化剂甲基硝基亚硝基胍 (methy1-nitro -nitrosoguanidine ,MNNG)的诱发突变频率的影响。方法 :用REV3基因反义核酸表达质粒pMAM -REV3-转染人羊膜上皮细胞 (FL) ,建立了由地塞米松诱导下的REV3基因表达可被反义阻断的细胞系 (FL-REV3-) ,并应用经典的筛选HPRT基因位点的突变子的实验进行REV3基因对HPRT基因位点的自发与诱发突变影响的检测研究。结果 :在自发突变率的检测中 ,FL细胞系的自发突变率比它的诱发突变率低 3 0 1倍 (P <0 0 5 ) ,而在FL -REV3-细胞系中始终未能筛选到自发突变子 ;用 0 .4 μmol/LMNNG分别处理FL -REV3-和FL细胞系 ,前者诱发突变率比后者低 6 0 2倍 (P <0 0 5 )。结论 :REV3基因不仅参与细胞自发突变 ,而且参与细胞的诱发突变 。

两种寡核苷酸基因定位诱导突变方法的比较

作者对两种寡核苷酸基因定位诱导突变方法进行了比较.在192个单核苷酸缺失突变中,含U单链基因突变系统和经典噬菌体M13单链突变系统均准确完成缺失突变,两种方法的突变年率分别为6％和1％左右.比较可以发现,含U单链突变系统具有突变率高,易于筛选,突变位点准确等优点,但操作复杂,成本高,需特殊试剂和菌种;噬菌体M13单链突变系统则方法简便,成本低,周期可缩短至1 2d,易于一般实验室使用,缺点是突变率较低,筛选困难.

基于诱导突变牡蛎共生真菌的代谢产物

目的探讨人工诱变对海洋牡蛎共生真菌代谢产物的影响。方法采用硫酸二乙酯(DES)、紫外、微波等方法对真菌Alternaria alternata(YS-4)进行诱导突变,采用Ellman法、DPPH自由基清除法和滤纸片法研究突变菌株代谢产物抑制AChE、抗氧化和抗菌活性。结果通过人工诱变得到6株稳定遗传的菌株,分别为聚多曲霉(Aspergillus sydowii)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、皮落青霉(Penicillium crustosum)、指状拟青霉(Paecilomyces dactylethromorphus)、糙刺篮状菌(Talaromyces sp.)和青霉菌(Penicillium sp.)。与野生菌株相比,突变菌株YB-1和YB-17的代谢产物更为丰富,且其粗提物具有较强的抑制AchE活性和清除DPPH自由基作用,抑制率分别为55.86%、60.31%和41.72%、36.85%;YB-17、YB-23和YB-24对金黄色葡萄球菌具有一定的抑制作用。结论本研究通过诱导突变得到了具有稳定遗传且代谢产物生物活性较好的菌株,为进一步充分挖掘结构丰富、活性良好的次级代谢产物奠定基础。

环境胁迫诱导的细胞适应性突变

细胞具有普遍的突变和进化能力,如病原菌的抗药性、工业菌株的适应性和人体细胞的癌变等,但是细胞的适应性突变是如何产生的呢?通过非致死性突变分析模型的建立与应用,产生了新的适应性进化观点,即环境胁迫诱导细胞适应性突变。这种环境诱导的细胞突变过程涉及多方面的生理调控,包括细胞内毒性物质(如氧活性物质)积累并造成DNA损伤、DNA错配修复的活性受到抑制、胞内RpoS反应和SOS反应被激活等。这些反应使胞内高保真的DNA复制状态转变为低保真的DNA修复状态,提高胞内突变率和重组活性。此外,基因转录影响基因组的不稳定,容易产生DNA损伤,并造成局部的高突变率,即形成了转录偶联的DNA修复与突变为基础的适应性突变观点。文章围绕环境胁迫诱导细胞突变率增加和转录偶联的DNA修复与突变这两种适应性突变分子机制,阐述其相关的研究进展,以期更好地理解环境条件诱导细胞发生适应性突变的过程。

应用复合诱导突变分离PCR法检测mtDNA的单核苷酸多态性

目的 应用复合诱导突变分离PCR（multiplexed mutagenically separated PCR，MS-PCR）技术、银染分型，建立线粒体DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）编码区单核苷酸多态（single nucleotide polymorphism，SNP）分型系统，探讨其应用价值。并调查了成都汉族群体mtDNA编码区4个SNP基因座等位基因频率和单倍型分布情况。方法 根据SNP基因座（C12705T、A8701G、G8584A、C10400T）设计两条片段相差4个碱基的等位基因特异性引物和一条公共引物，4个SNP基因座复合扩增，PCR产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳、银染显带后确定样本的基因型。结果不同SNP基因座为长度不同的单一谱带，其分型结果与直接测序一致。在成都汉族160名无关个体中，4个SNP基因座C12705T、A8701G、G8584A、C10400T等位基因频率分别为0．3813／0．6187、0．4813／0．5187、0．8250／0．1750、0．4938／0．5062；共检出6种单倍型，单倍型的基因多样性为0．7137。结论 建立的MMS-PCR银染分型系统是一种简单、快速、准确、有效的SNP分型方法，对建立mtDNA编码区SNP数据库，研究群体遗传学、进化学和进行法医学个人识别和亲子鉴定有重要意义。

香烟浸出液诱导微生物基因突变的探究活动

香烟中含有对人体有害的成分。本实验通过观察香烟浸出液的稀释梯度对粘质沙雷氏菌培养有显著的诱导突变作用,进一步证明了香烟会在基因水平上对生物产生诱变影响,以此警示青少年远离香烟。

干扰素诱导HBV基因突变后再次抗病毒疗效

目的:探讨慢性乙型肝炎(CHB)患者应用普通干扰素(IFN)诱导HBV基因突变后的再次抗病毒疗效。方法:选择44例持续接受IFN治疗无效者检测出HBV-C区[C基因启动子(CP)/前C/C基因]突变的CHB患者,根据其再次抗病毒治疗药物的选择,分为聚乙二醇干扰素(PEG-IFN)组(A组)和拉米夫定组(B组),分析治疗6个月后HBV-DNA及ALT的变化。结果:抗病毒治疗6个月后,A组的ALT复常率及HBV-DNA阴转率分别为31.25%和37.50%,B组分别为75.00%和82.14%,两组差异有统计学意义(P<0.05)。结论:IFN诱导HBV-C区基因突变后,拉米夫定较PEG-IFN抗病毒疗效好。

慢性乙型肝炎病毒感染者阿德福韦酯诱导耐药突变与预存耐药突变的比较分析

目的:对比分析慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染者阿德福韦酯(ADV)诱导耐药突变与预存耐药突变的临床及分子生物学特点。方法:ADV耐药突变的慢性HBV感染者88例,采用基因测序的方法对患者的血清标本进行P区耐药基因测序,同时检测HBV基因型、HBV血清学标志物及HBV-DNA。结果:88例中,发现ADV预存耐药突变9例(10.23%),其中部分患者(4/9,44.44%)曾接受过不规范的抗病毒治疗;诱导耐药组中以rtA181T突变及单个位点突变为主(41/79,51.9%;61/79,77.22%)、完全突变株40例、突变株与野生株共存39例,而预存耐药组以rtN238T突变、多位点突变以及突变株与野生株共存为主;诱导耐药组的HBV-DNA为(5.15±1.23)log10拷贝/mL,预存耐药组为(6.45±0.97)log10拷贝/mL(t=-3.05,P=0.003);诱导耐药组中终末期肝病患者占40.51%(32/79),而预存耐药组均为终末期肝病患者(P=0.001);两组在性别、年龄、E抗原状态及HBV基因型构成方面比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论:在未经ADV抗病毒治疗的慢性HBV感染者中可能存在ADV预存耐药突变;诱导耐药的准种变异经过筛选后变得较单一,而预存耐药的准种变异较复杂;终末期肝病患者中可能存在各种抗病毒药物的预存耐药突变;发生ADV诱导突变后的HBV-DNA复制水平常较低;患者应该接受和执行规范的抗病毒治疗和优化治疗,以实现预防耐药,避免挽救治疗。

定向诱导基因组局部突变技术研究及应用进展

定向诱导基因组局部突变(TILLING)技术是反向遗传学中研究功能基因的一种全新的方法。TILLING技术借助高通量检测手段,快速有效地从突变群体中鉴定出点突变。系统介绍了TILLING技术的基本原理和技术路线,同时总结了TILLING技术本身有待解决的一些问题。

血管内皮生长因子联合突变型低氧诱导因子1α的促血管生成作用

背景:研究表明,血管内皮生长因子的转录翻译过程在许多缺血、缺氧的条件下都会增加,有效改善机体血管形成与侧支微循环。突变低氧诱导因子1α的表达也需要严格的缺氧条件,很大程度上限制了其实际应用。目的:观察腺病毒介导的血管内皮生长因子联合突变型低氧诱导因子1α(Ad-VEGF-IRES-HIF-1αm u)转染内皮祖细胞在激素性股骨头缺血性坏死修复中促血管生成的作用。方法:①转染Ad-VEGF-IRES-HIF-1αm u到内皮祖细胞,观察细胞活性、形态及细胞病变效应;②将转染Ad-VEGF-IRES-HIF-1αm u成功的内皮祖细胞植入激素性股骨头缺血性坏死动物模型的股骨坏死部位(实验组:转染Ad-VEGF-IRES-HIF-1αm u,对照组:内皮祖细胞细胞悬液,空白组:细胞培养液);③移植10周后,检测血管内皮生长因子、低氧诱导因子1α蛋白表达及CD34表达和微血管密度计数;④墨汁灌注透明切片血管形态学观察。结果与结论:①实验组血管内皮生长因子和低氧诱导因子1α蛋白表达高于对照组与空白组(P<0.05);②实验组的CD34表达阳性的微血管数量较多,且相互之间有连接。③实验组动物股骨头血管墨汁染色显示有新的血管生成,部分血管管径良好,有再通现象,血管间有清晰的连通脉络,有效的血管脉络均匀分布在缺损区域;实验组新生血管面积显著高于对照组和空白组(P <0.05);④结果提示,血管内皮生长因子联合突变型低氧诱导因子1α在激素性股骨头缺血性坏死修复中可以增强血管生成作用。

重组腺病毒低氧诱导因子1α三突变体基因对兔缺血后肢血流灌注及血管渗透性的影响

目的研究重组腺病毒低氧诱导因子1α三突变体基因(Ad-HIF-1α-trip)对兔缺血后肢血管渗透性的影响。方法 18只新西兰大白兔建立左侧后肢急性缺血模型,随机分成3组,分别为生理盐水组、腺病毒空载体组(Ad-Null组)、Ad-HIF-1α-trip组,每组6只,分别在术后即刻肌注生理盐水、Ad-Null及Ad-HIF-1α-trip。在术后即刻及基因转染后7、14和28 d进行血管超声检查。术后7 d、14 d和28 d通过血管超声计算缺血侧髂内动脉血流量标化值,评价兔缺血后肢血流灌注改善情况。基因转染后28 d采用伊文思蓝(EB)染色法测定各组缺血肌肉组织中EB含量,评价Ad-HIF-1α-trip对缺血组织新生血管渗透性的影响。结果 Ad-HIF-1α-trip组缺血侧髂内动脉血流量标化值增加大于其他2组,差异有统计学意义(P<0.05);Ad-HIF-1α-trip组缺血肌肉组织的EB含量略高于Ad-Null组及生理盐水组,但组间差异无统计学意义(P>0.05)。结论 Ad-HIF-1α-trip能有效改善缺血肌肉组织的血流灌注,同时并未明显增加新生血管的渗透性。

骨形态发生蛋白2联合突变型低氧诱导因子1α修复激素性股骨头缺血性坏死

背景:骨形态发生蛋白2是目前发现的唯一的一种可单独诱导骨形成的生长因子,但是研究发现骨形态发生蛋白2单一基因的促血管生成作用较弱,无法在新生骨组织处产生足量的毛细血管,所以在诱导骨形成过程中还需要与其他诱导因子协同作用。低氧诱导因子1α在促进新生血管的形成方面有重要作用。目的:观察腺病毒介导的人骨形态发生蛋白2联合突变型低氧诱导因子1α(Ad-BMP-2-IRES-HIF-1α^(mu))转染骨髓间充质干细胞对激素性股骨头缺血性坏死的修复作用。方法:(1)转染Ad-BMP-2-IRES-HIF-1α^(mu)到骨髓间充质干细胞,检测碱性磷酸酶活性、钙结节茜素红染色检测其成骨能力;(2)建立激素性股骨头缺血性坏死兔模型,随机分为3组:实验组股骨坏死部位移植转染Ad-BMP-2-IRES-HIF-1α^(mu)的骨髓间充质干细胞;对照组移植未转染的骨髓间充质干细胞;空白组移植细胞培养液。移植8周后,Westen blot法检测骨形态发生蛋白2和低氧诱导因子1α蛋白表达;苏木精-伊红染色组织学观察股骨头缺血性坏死修复情况;墨汁灌注透明切片血管形态学观察股骨头缺损区域血管生成情况。结果与结论:(1)转染Ad-BMP-2-IRES-HIF-1α^(mu)的骨髓间充质干细胞的碱性磷酸酶活性和钙结节数量均高于未转染的细胞,说明转染Ad-BMP-2-IRES-HIF-1α^(mu)能促进骨髓间充质干细胞的成骨分化;(2)实验组骨形态发生蛋白2和低氧诱导因子1α蛋白表达高于对照组与空白组(P<0.05);移植8周后,实验组缺损区周边观察到明显的成骨反应,与对照组及空白组相比,实验组空骨陷窝率低(P<0.05),骨小梁面积百分比高(P<0.05);墨汁灌注实验显示:实验组出现血管化现象,并出现骨陷窝结构,血管间有清晰的连通脉络相互间构成网络,股骨头下血管分布及血管网的形成基本正常,实验组墨汁灌注血管面积为114.22±3.78,高于对照组(63.78±2.61)和空白组(21.39±3.52),差异有显著性意义(P<0.05);(3)提示:骨形态发生蛋白2联合突变型低氧诱导因子1α可以促进激素性股骨头缺血性坏死的修复。

真菌中DNA重复序列诱导点突变的研究进展

1987年,由Selker等在粗糙脉孢菌中首次发现重复序列诱导点突变(repeat-induced point mutation,RIP).在重复序列诱导点突变过程中,搜寻前减数分裂组织单倍体核中DNA的重复序列,然后发生众多的碱基C到T的突变,产生富碱基T+A片段,从而使重复序列中的G-C碱基对发生转换突变成为A-T碱基对.此外,发生RIP的序列多集中在着丝粒区域,主要是转座子甲基化后的遗迹.移动转座子是真核生物基因组进化的主要驱动力.对于真菌,重复序列诱导点突变(RIP)在减数分裂过程中通过突变多拷贝DNA,能最大限度地减少转座子的影响,因此对RIP的研究在一定程度上能有助于了解基因组进化的真谛.综述了重复序列诱导点突变的产生机制,以及真菌中重复序列诱导点突变的研究进展.

家蚕体形突变第2数珠蚕(mf-2)的遗传学研究

经X射线诱导发现的家蚕体形突变第2数珠蚕(mf-2)在形态上与数珠蚕(mf:12-39.8)相似。通过二者间的杂交实验表明,mf-2与mf为独立遗传;与各染色体的标记基因进行连锁分析,发现mf-2与第15染色体的眼纹全黑(bl:15-0.0)连锁,说明mf-2基因属于第15连锁群;初步测定mf-2与bl间的遗传距离为27.7 cM。