乳酸乳球菌食品级诱导表达系统的构建及异源蛋白的表达

以α-aga基因为食品级选择标记构建了乳酸乳球菌食品级高效诱导细胞内和细胞壁锚定表达系统,并用这一表达系统表达了铜绿假单胞菌融合外膜蛋白基因OprF/H。首先以pRAF800和pNZ8048构建了含有α-aga、PnisA-MCS-TpepN和θ复制子的乳酸乳球菌食品级细胞内诱导表达载体pRNA48,再以pRNA48和pVE5524为出发载体构建了含有α-aga、PnisA-SPUsp45-nucA-CWAM6-t1t2和θ复制子的乳酸乳球菌细胞壁锚定诱导表达载体pRNV48。然后以食品级载体pRNA48和pRNV48为基础,构建了不含抗生素抗性选择标记的铜绿假单胞菌融合外膜蛋白基因的表达质粒pRNA48-OprF/H和pRNV48-OprF/H。利用nisin进行重组乳酸乳球菌菌株的诱导表达,通过SDS-PAGE和Western blot分析,检测到表达蛋白分别占细胞内可溶蛋白的9.6%和细胞壁锚定蛋白的9.8%,表达产物具有免疫原性,可与含OprF/H的乳球菌以及铜绿假单胞菌发生特异性的凝集反应。

植物的化学诱导表达系统

利用植物内源性化学诱导启动子或其它生物的化学诱导响应元件都可以在植物中构建化学诱导表达系统。化学诱导表达系统可以分为去抑制、失活、激活三种 ,三种方式的原理相似 ,需要两个转录单位组成 ,第一个转录单位由一个组成型启动子 (如CaMV 35S)转录一个对化学诱导剂敏感的转录因子 ,第二个转录单位含有多个能结合转录因子的位点与一个基本植物启动子 (如截短的CaMV 35S)组成的嵌合型启动子调控目的基因的表达。构建双元调控系统可以克服单元系统的不足。文章叙述了一些已构建的化学诱导系统的特征和局限性 ,阐明了理想化学诱导表达系统的要求和理想化学诱导剂的条件。指出化学诱导系统的应用是很有前途的。

小鼠H1foo基因四环素诱导表达系统的构建与表达

卵母细胞特异性连接组蛋白H1foo(Linker histone H1foo)是连接组蛋白H1(Histone 1)在卵母细胞中特异性表达的1个亚型,H1foo在卵母细胞减数分裂和成熟发育过程中起着不可替代的作用,而且H1foo也参与了重编程过程。为了在体细胞中进一步研究H1foo的功能,本试验通过采用四环素诱导表达载体系统,用PCR的方法扩增了小鼠的H1foo基因和四环素诱导表达系统(Tet-on)的启动子区。用双酶切和连接等方法将上述元件连接到真核表达载体pVenus上,构建了重组质粒pVenus-tet-CMV-H1foo。双酶切和测序结果显示,片段连接正确,且全长测序正确。本试验所构建的四环素诱导的小鼠H1foo真核表达系统有助于人们在体细胞中更好地探讨H1foo在特定时间的作用和功能。

兽疫链球菌ATCC39920可控诱导表达系统的构建及其应用

旨在构建一种在兽疫链球菌(Streptococcus equi subsp.zooepidemicus)中可用的基因诱导表达系统,并探究其在两步发酵中的应用。分别构建蔗糖、乳糖、木糖和乳酸链球菌素(nisin)诱导表达载体,以编码透明质酸合成酶的has A基因作为报告基因,以has A基因功能缺失导致荚膜缺陷的?has A作为宿主菌,观察诱导后荚膜生成情况验证系统的可行性。结果显示,木糖和nisin系统不能诱导has A表达,乳糖系统诱导表达效率低,蔗糖系统可严谨且高效诱导基因表达。以?has A/p LH201菌株实施两步发酵,葡萄糖为唯一糖源时仅用于菌体生长,添加蔗糖诱导产生透明质酸,终产量达到3.4 g/L。成功构建了一种以蔗糖为诱导物的可控-诱导基因表达系统,可用于兽疫链球菌两步发酵。

大豆发状根乙醇诱导表达系统的建立及验证

为在大豆中建立目的基因表达可控的化学诱导表达系统,本研究构建了基于乙醇诱导表达系统(ALCA switch)的GUS和GmFT2a表达载体,利用发状根农杆菌介导的根系转化体系,分别获得转ALCA-mini35S-GUS和ALCA-mini35S-GmFT2a的发状根,通过检测GUS的表达情况和GUS酶活性高低评定该系统在大豆发状根中的诱导效率,并通过检测GmFT2a表达水平加以验证。结果表明,在非诱导条件下,ALCA-mini35S-GUS发状根中未见GUS表达,而在培养基中添加乙醇后组织化学染色效果明显,说明GUS基因表达。乙醇诱导表达的效率与乙醇浓度有关,当乙醇浓度为0.05%、处理60 h时GUS相对表达量达到最高值,处理72 h时GUS酶活性最高;0.05%乙醇处理72 h时,ALCA-mini35S-GmFT2a发状根中GmFT2a相对表达量平均值约为诱导前的150倍,个别样本可达初始值的400倍。综上所述,乙醇诱导表达系统可以在大豆发状根中发挥作用,该系统不仅可用于大豆基因功能研究,而且可为培育外源基因表达可控的转基因大豆品种提供新的技术手段。

可用于转基因动物的基因诱导表达系统

带有ＩｏｘＰ的β－ＤＮＡ多聚酶基因的转基因小鼠，在经ＩＦＮ或ｐｏｌｙｌ－ｐｌｙＣ的诱导处理后，ｐｏｌβ基因缺失的分析，就可以了解Ｃｒｅ－ＩｏｘＰ系统的作用效率。在Ｃｒｅ－ＩｏｘＰ转基因小鼠中，注射ｐｏｌｙｌ－ｐｌｙＣ或ＩＦＮ后的两天内，在肝细胞中的ｐ...

利用tet-off诱导表达系统研究Akt的功能

用BA/F3(细胞建立了含tet-off诱导表达系统的细胞株BBT, 并用对tet-off应答的荧光素酶报告基因检测证实该系统中基因诱导表达的效果极其显著. 随后在BBT细胞中转入了对tet-off应答的Akt表达质粒, 并筛选了稳定株. Northern杂交结果显示, Akt可以极显著地被tet-off诱导表达. 选择了诱导效果最好的单克隆BBA进行了Akt的功能研究. 用MTT法检测发现Akt可以极显著地抑制锌离子对细胞的损害, 流式细胞仪分析证实Akt可以显著抑制锌离子诱导的细胞凋亡.

一种基于三顺反子表达载体的生物素诱导表达系统的建立

目的:建立一种以无毒的生物素为诱导剂的哺乳动物细胞诱导表达系统。方法:通过基因组PCR或重叠延伸PCR获得该系统的三个基本构件:大肠杆菌生物素连接酶(BirA)、链亲和素-四环素依赖的抑制因子融合蛋白(SA-TetR)和生物素化信号-VP16转录激活结构域融合蛋白(Avitag-VP16)。将上述基因连入三顺反子表达载体,与响应载体一起共转染293f细胞,以EGFP为报告基因,检测EGFP荧光强度随培养体系中生物素浓度变化的情况。结果:随着生物素浓度的增加,目的基因表达出现OFF-ON-OFF的变化,诱导状态下的EGFP荧光强度约为抑制状态下的3倍。结论:可通过调节生物素浓度对目的基因的表达进行可逆的调节,该系统是一种有应用前景的诱导表达系统。

用四环素诱导调控表达系统构建弓形虫脂肪酸合成酶FABZ缺陷株

目的构建基于四环素诱导调控表达系统的刚地弓形虫β-酮脂酰ACP合成酶(FABZ)缺陷株。方法从弓形虫基因组中扩增fabz基因并构建四环素调控诱导表达载体pTetO7-Sag1-FABZ-Ty-DHFR,电穿孔法导入弓形虫TATi株,通过乙胺嘧啶抗性和极限稀释法筛选FABZ缺陷株,蛋白质印迹(Western blotting)检测虫体内附加表位标签Ty的表达。在5×105个FABZ缺陷株弓形虫速殖子培养液中加入脱水四环素(终浓度为1μg/ml),Western blotting检测带有Ty标签的FABZ表达情况。结果筛选获得的缺陷株可表达带有Ty标签的转运肽型FABZ和成熟型FABZ。FABZ缺陷株弓形虫速殖子培养液中加入脱水四环素24 h和48 h后,转运肽型FABZ表达量均较对照组显著降低(P<0.05)。结论构建了由脱水四环素调控表达的弓形虫FABZ缺陷株。

Retro-Tet:一种基于逆转录病毒的诱导性基因表达系统

Retro Tet基因表达系统是一种新型的高效、稳定、无毒、具有严密开 关功能的可诱导性真核细胞基因表达系统 .该系统兼备了逆转录病毒基因表达系统和Tet off Tet on基因表达系统的优点 ,在稳定表达细胞系的筛选、基因的表达与调控及基因功能研究等方面得到了成功的应用 。

Tet-on系统诱导猿猴病毒40T在CHO细胞中的表达

四环素诱导表达系统(T et-off/T et-on系统)是比较成熟的真核生物基因诱导表达系统之一,具有高效、无毒、严密开/关功能的特点。猿猴病毒40T(SV 40T)是一种病毒癌蛋白,其与肿瘤抑制蛋白p53和R b结合,并使之失活,从而消除它们抑制细胞生长的功能,使细胞分裂加速,形成肿瘤。利用T et-on系统首先稳定筛选获得了表达T et-on系统调节元件rtTA的阳性细胞CHO-pT et-on,再通过稳定筛选又成功得到导入其反应元件的双阳性细胞CHO-pT et-on-pTRE 2-SV 40T-Hyg,经强力霉素诱导表达了目的基因SV 40T,建立了T et-on基因诱导表达系统的细胞诱导表达研究平台。

诱导型eIF3g人工microRNA表达载体的构建及应用

目的:构建可用四环素调控的针对人eIF3g的人工microRNA表达载体,用于抑制肿瘤细胞中eIF3g的表达。方法:利用网络资源设计针对人eIF3g的人工microRNA,以PCR方法克隆,经DNA测序验证后亚克隆至四环素调控表达系统的pRevTRE2载体上,得到pRevTRE2-eIF3g-microRNA。将四环素调控表达系统的Tet-off质粒转染K562细胞获得稳定转染克隆后,再利用带有报告基因GFP的pRevTRE2-GFP转染选择调控能力较好的K562/Tet-off细胞株,将pRevTRE2-eIF3g-microRNA转染K562/Tet-off细胞,Westernblot检测eIF3g的表达,以研究eIF3g人工microRNA的作用效果。结果:DNA测序结果显示,针对人eIF3g的人工microRNA的克隆正确。pRevTRE2-GFP转染结果表明所选择的K562/Tet-off细胞株有较好的诱导功能。Westernblot结果显示,转染pRevTRE2-eIF3g-microRNA的K562/Tet-off细胞可用四环素调控eIF3g人工microRNA的表达从而抑制K562细胞中eIF3g的表达。结论:成功构建了可用四环素调控的eIF3g人工mi-croRNA表达载体,能有效调控K562细胞中eIF3g的表达。

β-神经生长因子的诱导表达及其对角膜缘干细胞的作用

目的运用Tet-on 3G四环素诱导表达系统探讨β-神经生长因子(β-NGF)在人胚肾(HEK293FT)细胞中的过表达情况及其对角膜缘干细胞(LSCs)的作用。方法将p LVX-TRE3G-IRES-β-NGF和p LVX-Tet3G慢病毒在空白的HEK293FT细胞进行扩增,收获慢病毒,再共转染HEK293FT细胞,同时用不同剂量强力霉素(Dox)诱导β-NGF表达(分为未转染组、1000、100和1000μg/L Dox诱导表达组)。48 h后收集细胞,免疫印迹法(Western blotting)检测各组细胞内β-NGF表达情况。体外分离培养LSCs,慢病毒共转染LSCs,分为对照组(未转染组)和诱导表达组[实验组A(慢病毒载体Dox 1000μg/L)、实验组B(慢病毒载体Dox 100μg/L)、实验组C(慢病毒空载体Dox 1000μg/L)],诱导表达48 h后细胞免疫荧光染色检测NGF及相关蛋白(p63、p38、Trk A)的表达情况。结果NGF在转染细胞内被诱导表达,随着Dox剂量增加,表达量增强,差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组及实验组C相比,实验组A的p63表达降低,Trk A表达降低,p38表达增加,差异有统计学意义(P<0.05);与对照组及实验组C相比,实验组B的p63表达增加,Trk A表达增加,p38表达降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论运用Tet-on 3G四环素诱导表达系统,可成功诱导表达不同剂量β-NGF蛋白,低剂量Dox诱导下NGF产生的微环境可促进LSCs的体外扩增,并能维持LSCs的干细胞特性。

可诱导心肌特异性表达IL-22转基因小鼠模型的建立

目的建立心肌特异性、高效表达白介素22的转基因小鼠模型。方法将TRE-Tight-IL-22转基因载体显微注射入C57BL/6小鼠受精卵细胞中,得到含有其中1段转基因载体的转基因小鼠,再将这种转基因小鼠与含有能够控制TRE-Tight下游基因在心肌特异性表达的α-MHC-rtA-hGH的转基因小鼠进行交配,获得同时含有TRE-Tight-IL-22和α-MHC-rtTA-hGH这2段基因的双阳性子代转基因小鼠。使用强力霉素(Dox)持续诱导6周龄双阳性小鼠6周,再用ELISA方法检测转基因小鼠心肌细胞中IL-22表达量。结果与野生型C57BL/6小鼠比较,经过强力霉素诱导的双阳转基因小鼠心肌细胞有高表达量的IL-22(P<0.05)。结论得到了可诱导、高效表达IL-22的转基因小鼠系,为IL-22与心力衰竭关系的深入研究和治疗提供新的研究思路。

基于PiggyBac转座系统的低溢漏诱导型Tet-On过表达体系的建立及应用

为避免诱导基因稳定表达的Tet-On诱导表达系统溢漏表达,实现简便且高效的外源基因稳定诱导表达,本研究拟在Tet-On调控的转录水平基础上,将基于稳定配体Shield-1的不稳定结构域FK506结合蛋白引入目的基因的N端,从蛋白水平控制其本底表达水平.为验证该系统的效果,本研究以荧光蛋白TdTomato为报告基因,经流式分析结果证明优化后的体系较原体系的溢漏表达在蛋白水平上降低7倍左右.将该系统应用于基于小鼠胚胎干细胞的体外牙向分化模型,在诱导因子Dox和稳定配体Shield-1的协同作用下,诱导表达牙齿发育相关转录因子Hand2提高了牙向分化诱导的完成度.

四环素诱导的猪黑素皮质激素受体-4基因真核表达载体的构建

猪黑素皮质激素受体-4(melanocortin-4receptor,MC4R)基因是影响猪生长肥育的主效基因之一,为了进一步研究MC4R基因的生物学功能,制备高成活率转基因猪,通过采用条件性诱导表达载体系统,PCR方法扩增了猪MC4R基因完整编码区,四环素诱导表达系统(Tet-on)的启动子调控区与转录调节元件。采用双酶切和连接等方法将上述元件连接到pcD-NA3.1(+)上,构建了重组质粒pcDNA3.1(+)-rtTA-PTight-MC4R。经双酶切和测序鉴定,结果显示片段正向连接且片段全长测序正确。试验成功构建了四环素诱导的pcDNA3.1(+)-rtTA-PTight-MC4R真核表达载体,并能在时间特异性方面调控MC4R基因的表达。

四环素调控表达系统调节EGFP和HBV前核心蛋白在哺乳动物细胞中表达

构建新型四环素调控的增强绿色荧光蛋白(EGFP)基因和乙肝病毒(HBV)前核心蛋白基因的表达载体,利用脂质体转染哺乳动物细胞,流式细胞术检测结果说明:应用此系统四环素可使EGFP在CHO细胞中的表达提高18倍,在SSMC-7721细胞与HEK293细胞中的表达分别提高5倍和接近2倍,并且,四环素可有效地诱导HBV的前核心蛋白基因在肝癌细胞系中的表达。

可诱导心肌特异性表达TRX蛋白转基因小鼠模型的建立

目的建立心肌特异性、高效表达鼠源硫氧还蛋白-1(Thioredoxin 1,Trx-1)的转基因小鼠模型。方法将TRE-Tight-Trx-1与能够控制TRE-Tight下游基因在心肌特异性表达的α-MHC-rtTA-hGH转基因载体分别显微注射入C57BL/6小鼠受精卵细胞中得到的分别含有一段转基因载体的转基因小鼠,再将这两种转基因小鼠进行交配,获得同时含有TRE-Tight-Trx-1和α-MHC-rtTA-hGH这两段基因的双阳性子代转基因小鼠。使用强力霉素(Dox)持续诱导6周龄双阳性小鼠6周,再用Western blot方法检测转基因小鼠心肌细胞中Trx-1表达量。结果与野生型C57BL/6小鼠比较,经过强力霉素诱导的双阳转基因小鼠心肌细胞中Trx-1有高表达量(P<0.05)。结论我们得到了可诱导、高效表达Trx-1的转基因小鼠系,为心肌肥大疾病的研究和治疗提供新的研究思路。

Tet-on慢病毒系统表达弓形虫ROP18的研究

目的用Tet-on慢病毒载体系统构建稳定表达弓形虫棒状体蛋白18(ROP18)的293T细胞株。方法PCR扩增ROP18基因序列插入慢病毒载体p LVCT-t TR-KRAB中,构建带有ROP18活性片段的慢病毒载体p LVCT-t TRKRAB-ROP18。经鉴定后将该重组载体(6μg)与辅助质粒ps PAX2(4μg)和p MD2.G(2μg)共同转染293T细胞,荧光显微镜下观察细胞荧光。于转染后48和72 h收集含有慢病毒颗粒上清液,感染293T细胞。以1μg/ml强力霉素(DOX)诱导293T细胞表达ROP18,荧光显微镜下观察细胞荧光,RT-PCR法检测293T细胞中的ROP18表达情况。结果 PCR扩增rop18片段为960 bp,与预期大小一致。经PCR和酶切鉴定重组慢病素载体构建成功。转染48 h后,293T细胞于荧光显微镜下可见绿色荧光。经DOX诱导24 h即可观察到293T细胞中明亮绿色荧光。RT-PCR检测结果显示,293T细胞ROP18可产生960 bp特异条带,与预期结果一致。结论采用Tet-on慢病毒载体系统构建了稳定表达弓形虫ROP18的293T细胞株。

四环素诱导的YAP1敲减系统的建立及其对胃癌细胞功能的影响

目的建立一种四环素(tetracycline,DOX)诱导的基因敲减系统,并利用此系统研究YAP1对胃癌细胞功能的影响。方法构建pLKO.1-tetON-YAP1敲减的慢病毒载体,酶切和测序方法检测载体构建成功与否;慢病毒感染胃癌细胞系SGC-7901和MKN-28,建立DOX诱导的YAP1敲减的胃癌细胞系;RT-PCR检测YAP1 mRNA相对表达量,Western blotting检测YAP1蛋白水平变化;平板克隆实验检测细胞增殖情况;划痕实验和Transwell实验检测细胞迁移的情况。结果构建四环素诱导的YAP1敲减的病毒质粒,酶切鉴定结果显示,在6000 bp和3000 bp处各有一条带,测序结果与设计的shRNA序列一致。包装慢病毒并感染胃癌细胞系SGC-7901和MKN-28,DOX诱导组中,感染pLKO.1-tetON-YAP1的病毒的细胞中YAP1 mRNA的相对表达量和蛋白水平明显下调;而未诱导组则无明显变化。平板克隆形成实验结果显示,DOX诱导后shYAP1组克隆形成数明显降低;未诱导组无明显变化。划痕实验和Transwell迁移实验结果显示,DOX诱导后shYAP1组表达后细胞迁移能力受到抑制,未诱导组无明显变化。结论成功建立了四环素诱导的慢病毒系统,利用此系统敲减胃癌细胞YAP1基因,胃癌细胞增殖和迁移能力受到抑制。