大口黑鲈源豚鼠气单胞菌的分离鉴定及全基因组分析

【目的】探究患病大口黑鲈的致病菌及其主要生物学特性,为临床疾病防控提供技术支撑。【方法】首先对发病大口黑鲈进行病理组织学观察,进而利用平板划线法分离细菌,通过革兰染色、生化试验和16S rDNA序列测定对分离菌进行鉴定,通过致病性试验观察分离菌对小鼠主要脏器造成的病理损伤;而后分别利用PCR方法和Kirby-Bauer(K-B)纸片法对分离菌的常见毒力基因和耐药特征进行检测分析;最后利用二代测序技术绘制其全基因组草图,并通过生物信息学方法对其分子特征进行解析。【结果】自然感染大口黑鲈肝细胞肿大,空泡变性,肠黏膜下层出血,肠壁坏死;于患病黑鲈体内分离到1株优势菌,在血平板上呈乳白色,半透明,直径约1 mm的小菌落,呈β溶血,革兰染色为阴性短杆菌,两端钝圆,经生化试验和16S rDNA测序证实分离菌为豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae),将其命名为SCMS。试验小鼠接种后24 h内死亡率为100%,病理特征与自然感染大口黑鲈相似;SCMS株中共检测到9种毒力基因,分别为Aha、Ahp、Aer、Alt、gcaT、Act、Exu、Ela和eprCAI;药敏试验结果显示,分离菌对大多数四环素类、大环内酯类药物表现耐药或中度敏感;全基因组测序显示,分离菌全长4329602 bp,GC含量为61.5%,基因组信息在GenBank中的登录号为JARFUQ000000000,相似性分析显示分离菌与人源、食品源豚鼠气单胞菌具有高度相似性;病原毒力因子数据库(VFDB)比对显示,分离菌携带多种与黏附、侵入及分泌系统相关的毒力基因;耐药基因数据库(CGE)分析显示,菌株中携带7种耐药基因,部分基因与耐药表型存在不一致的现象。【结论】本试验通过全基因组测序技术解析了1株大口黑鲈源豚鼠气单胞菌的毒力基因和耐药基因,其结果可为大口黑鲈临床疾病防控提供技术支撑。

大口黑鲈源豚鼠气单胞菌的分离鉴定及病理性分析

【目的】分析深汕特别合作区某鲈鱼养殖基地大口黑鲈(Micropterus salmoides)突发性死亡原因,探究其病原菌生物学特性,为大口黑鲈养殖中的疾病防控与诊治提供理论参考。【方法】从患病大口黑鲈肝脏、脾、肠等病灶组织中分离得到一株优势菌,命名为SZNH-S20230817;开展形态学特征观察,生理生化特性鉴定,人工感染试验,药物敏感性测试,最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)测定,16S rRNA序列、耐药基因及毒力基因的鉴定,分析其耐药性和病理。【结果】菌株SZNH-S20230817的序列与豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)AP019195具有99.38%同源性;同时携带aer、act、lip和fl a 4个毒力基因;生化鉴定结果显示,该菌的吲哚、氧化酶、苯丙氨酸、甘露醇、木糖、精氨酸双水解酶和葡萄糖产酸等结果为阳性,确定菌株SZNH-S20230817为豚鼠气单胞菌。回归感染试验发现菌株SZNH-S20230817具有较强致病性,对大口黑鲈的半致死浓度(LC_(50))为1.39×10^(7)CFU/mL。药敏试验结果显示,该菌对头孢唑林、卡那霉素、四环素、万古霉素、氨苄西林和克林霉素等12种抗生素耐药,同时携带qnrS、catI、emrB、Sul1、rmtB等13种耐药基因。组织病理学分析表明,菌株SZNH-S20230817感染可引起鱼体脾脏细胞肿胀、游离、肠黏膜断裂破损、绒毛脱落、肾脏细胞坏死、炎症细胞浸润、肝脏细胞呈空泡化等。体外抑菌试验结果显示大黄和五倍子对该菌的MIC和MBC较低,其余7种中草药对该菌的抑菌能力较弱。【结论】豚鼠气单胞菌是引起本次大口黑鲈突发性死亡的病原菌,其同时携带aer、act、lip和fl a 4个毒力基因,对大口黑鲈的LC_(50)为1.39×10^(7)CFU/mL,对头孢唑林、卡那霉素、四环素等抗生素耐药。低剂量的大黄和五倍子能够有效抑制该菌生长,具备良好的预防和抑制效果。

豚鼠气单胞菌研究进展

豚鼠气单胞菌属于气单胞菌属,在自然界中通过食物和水广泛传播,是人、动物和水生生物共患的条件性病原菌,严重危害人类身体健康,同时是造成多种淡水鱼疾病的主要原因,给水产养殖业造成了巨大的威胁。目前,对豚鼠气单胞菌发展的研究,学界很少从系统去概述,论文从豚鼠气单胞菌的病原学、临床特征、流行现状、致病机理及防治等几个方面的最新研究进展进行概述,旨在为其防治及研究提供参考。

鲟源致病性豚鼠气单胞菌的分离及其生长特性

从患细菌性败血综合征的杂交鲟(Husohuso♀×Acipense rruthenus♂)肝和达氏鳇(H.dauricus)腹水中共分离出4株优势菌,经人工回归感染实验测定了其致病性,并通过ATB细菌鉴定仪对致病菌株进行了鉴定,此外,研究了致病菌株的生长特性。实验结果表明,菌株XL2-T对杂交鲟和达氏鳇具有致病性。经鉴定,菌株XL2-T为豚鼠气单胞菌(Aeromonas punctata caviae);其在无菌营养肉汤中摇床振荡培养时的生长曲线:0～1.5h为生长延迟期,1.5～28h为对数生长期,28～32h为稳定期,32h以后为衰亡期;其最适生长温度为25～30℃,最适生长pH为7,在NaCl含量范围0～10%、沙拉沙星浓度范围0～40μg/ml下均能够生长,但NaCl、沙拉沙星对其生长具有较大的抑制作用。

鱼类致病性豚鼠气单胞菌单克隆抗体-胶体金检测方法的建立

以福尔马林灭活的豚鼠气单胞菌按2.5×107个/只和5.0×107个/只分成两个剂量组免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤技术制备针对豚鼠气单胞菌的单克隆抗体(McAb),用间接ELISA法对所需的杂交瘤细胞株进行特异性筛选,获得了2株可分泌特异性McAb的杂交瘤细胞,并分别命名为3F3和2C9C3。经过鉴定,这两株McAb能够特异性的针对豚鼠气单胞菌,其抗体亚类分别为IgG1型和IgM型;腹水效价分别为10-6和10-5;相对亲和力较高;3F3针对豚鼠气单胞菌脂多糖表位,而2C9C3针对非脂多糖抗原位点。利用实验制备的McAb建立了以McAb为基础的双抗夹心法膜式超灵敏胶体金快速检测方法,所研制的豚鼠气单胞菌胶体金快速检测卡灵敏度好,特异性高,重复性好,检测时间快,操作简便,为水产上豚鼠气单胞菌的快速鉴定和诊断以及该菌流行的监测提供有力的工具。

克氏原螯虾源致病性豚鼠气单胞菌的分离及其生物学特性

从患病的克氏原螯虾体内分离到一株致病菌L2M-A,经生理生化鉴定和16S rDNA序列分析,证实菌株L2M-A为豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)(GenBank登录号:KF446251),其16S rDNA序列与基因库中气单胞菌属菌株的16S rDNA序列有99%—100%的同源性,而且与豚鼠气单胞菌JXZ-3株(GenBank登录号:JF496552)的亲缘关系最近。此外,菌株L2M-A在pH5—9内均能够生长良好,最适生长温度为30℃,最适生长转速为200 r/min,但浓度≥6.25μg/mL的双氟沙星对其生长具有显著的抑制作用,可作为防治用药的依据。

豚鼠气单胞菌胶体金免疫层析试纸条的研制

采用淋巴细胞杂交瘤技术制备抗豚鼠气单胞菌单克隆抗体分泌细胞株,获取抗豚鼠气单胞菌单克隆抗体,柠檬酸三钠还原氯金酸制备胶体金颗粒,选择直径20 nm的胶体金颗粒,标记抗豚鼠气单胞菌单克隆抗体并制备胶体金垫。将胶体金垫与喷涂有抗豚鼠气单胞菌兔多克隆抗体和羊抗鼠抗体的硝酸纤维素膜及样品吸收垫等组装成免疫层析试纸条,建立豚鼠气单胞菌的快速检测方法。用灭活细菌与血清混合的模拟样本测定试纸条的特异性、灵敏度,结果显示,试纸条对嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、鳗弧菌、溶藻弧菌、荧光假单胞菌、副溶血弧菌等13种常见病原菌没有交叉反应,与豚鼠气单胞菌显示特异性反应,检测灵敏度为1×106CFU/mL,结果显示时间小于5 min。研制的豚鼠气单胞菌胶体金免疫层析检测试纸条具有快速、简便、特异性高、适用于基层临床生产推广应用等优点。

南方鲇(Silurus meridionalis)豚鼠气单胞菌溶血素的分离、纯化与致病性研究

采用硫酸铵盐析、DEAE-Sephadex A50凝胶层析法对豚鼠气单胞菌的溶血素进行分离、纯化,获得分子量为32.2kDa的单一多肽溶血素,测定溶血价为25。将该溶血素倍比稀释后梯度接种南方鲇,研究其对南方鲇的致病性和组织病理损伤情况。结果表明:豚鼠气单胞菌溶血素具有较强的毒力,对南方鲇的半数致死剂量(LD50)为0.29mg蛋白/kg体重;病鱼表现为体表褪色,腹部膨大,肝、脾、肾肿大,肝、脾淤血、出血明显;胃肠道内充有大量粘液,黏膜充血、出血;组织病理学表现为骨骼肌水肿、变性,肝细胞变性、坏死,血窦扩张淤血,肾小管上皮细胞变性、坏死,脾脏淋巴细胞减少,胃肠道黏膜上皮变性、坏死,脱落。

鲢鳙打印病豚鼠气单胞菌主要特性及系统发育学分析

对从鲢(Hypophthalmichthysmolitrix)鳙(Aristichthysnobilis)打印病病死鱼中分离到的豚鼠气单胞菌(Aeromonascaviae),进行了形态与理化特性等方面较系统的表观分类学指征鉴定。同时择代表菌株(HC960704-1)进行了16SrRNA基因的分子鉴定,测定了16SrRNA基因序列、分析了相关细菌相应序列的同源性,构建了系统发生树;HC960704-1的16SrRNA基因序列长度为1416bp(GenBank登录号:AY966888),与GenBank数据库中的气单胞菌16SrRNA基因序列的相似性在98%和100%。

观赏金鱼豚鼠气单胞菌的分离鉴定及防治

从陕西省某观赏鱼养殖场发生出血病的金鱼中分离到一株细菌,通过培养特性、菌体形态、菌落特征、染色特性、生化试验等一系列的系统鉴定,确定为豚鼠气单胞菌。动物致病性试验表明,该菌对小白鼠和金鱼有较强的致病性,可引起其死亡。药敏试验证明该菌对四环素、庆大霉素、氯霉素等高度敏感,对氟哌酸、链霉素等中度敏感,对红霉素、青霉素等不敏感。通过药敏试验选用有效抗生素,有效地控制了该病的流行。

中华绒螯蟹豚鼠气单胞菌的分离和鉴定

对杭州转塘患“抖抖病”的中华绒螯蟹进行了病原的分离和鉴定 ,从病蟹体内分离到两株病原菌 ,均属革兰氏阴性杆菌 ,单极生鞭毛 ,运动 ,兼性厌氧 ,发酵葡萄糖产酸不产气 ,氧化酶、七叶苷、过氧化氢酶阳性 ,能还原硝酸盐等 ,其形态特征及生理生化反应与豚鼠气单胞菌基本相同 ,故鉴定为豚鼠气单胞菌 .人工注射感染健康蟹后 ,均在 3d内死亡 ,死亡率为 10 0 %,证实豚鼠气单胞菌为中华绒螯蟹的致病菌 .药敏试验结果表明 ,此病原菌对链霉素、卡那霉素、新霉素、环丙沙星、氟哌酸、氯霉素、庆大霉素、妥布霉素、氟嗪酸、壮观霉素、复达欣、头孢呋肟、菌必治、萘啶酸、呋喃妥因等药物高度敏感 .

中草药体外抑杀大鲵致病性豚鼠气单胞菌的药效研究

筛选对大鲵致病性豚鼠气单胞菌有抑菌作用的中草药。采用琼脂打孔法,测定中草药在不同pH值时对大鲵致病性豚鼠气单胞菌的体外抑菌圈效果。使用二倍稀释法,测定中草药在不同pH值时对大鲵致病性豚鼠气单胞菌的最小抑菌质量浓度和最小杀菌质量浓度。试验结果表明,200种中草药对大鲵致病性豚鼠气单胞菌的抑菌效果各不相同,其中135种中草药具有一定抑菌作用,其余65种无抑菌作用,而不同pH值时抑菌效果亦有所不同。药液为酸性时,乌梅、五味子、五倍子及诃子的抑菌效果极强,抑菌圈明显。135种中草药对豚鼠气单胞菌的最小抑菌质量浓度和最小杀菌质量浓度亦有所差异,其中,诃子、五倍子、石榴皮、大黄及槐角的最小抑菌质量浓度小于1mg/mL,抑菌作用最强。本试验筛选出具有很强抑菌作用的中草药。

南方鲇源豚鼠气单胞菌胞外产物活性与致病性研究

采用琼脂扩散法测定了南方鲇源豚鼠气单胞菌胞外产物酶活性和溶血活性,同时对胞外产物的细胞毒性和其致病性进行了研究。结果显示:南方鲇源豚鼠气单胞菌胞外产物具有蛋白酶、脂酶、明胶酶和脲酶活性,但不具有淀粉酶和卵磷脂酶活性,具有很强的溶血活性和细胞毒性。肌肉注射感染发现,其对南方鲇有强致病性,其LD50为每千克鱼体重0.802 mg;注射后的南方鲇肌肉、心、肝、肾、脾、肠和胃等组织发生了严重组织病理变化,骨骼肌和心肌坏死断裂,炎症细胞浸润;肝脏严重空泡变性;肾小管上皮细胞变性、坏死、间质内大量炎症细胞浸润;脾充血、出血,淋巴细胞减少,胃肠黏膜上皮细胞变性、坏死、脱落。

豚鼠气单胞菌抗独特型单克隆抗体的制备和初步鉴定

目的:制备豚鼠气单胞菌(Aeromonascaviae)抗独特型单克隆抗体(AIdmAb)并进行鉴定。方法:以具有中和作用的抗豚鼠气单胞菌mAb1F1免疫BALB/c小鼠,采用常规杂交瘤技术制备豚鼠气单胞菌AIdmAb。用ELISA法对mAb的效价及其模拟豚鼠气单胞菌的特性进行鉴定。结果:获得4株能稳定分泌豚鼠气单胞菌AIdmAb的杂交瘤细胞株,分别命名为1E12、4F6、6G6、7C1。经测定杂交瘤细胞腹水mAb效价为10-3～10-4。竞争抑制实验结果表明4株AIdmAb均能不同程度地抑制豚鼠气单胞菌与兔抗豚鼠气单胞菌多克隆抗体的结合。制备杂交瘤细胞腹水的BALB/c小鼠血清均能与豚鼠气单胞菌反应,其效价为1∶50～1∶800。结论:成功地制备了豚鼠气单胞菌抗独特型mAb的杂交瘤细胞株,为该菌的抗独特型疫苗制备研究奠定了基础。

十六种中草药及其复方对大鲵致病性豚鼠气单胞菌的体外抑制作用

应用二倍稀释法测定了诃子、五倍子、石榴皮等16种中草药及其复方对大鲵(Andrias davidianus)致病性豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度,应用棋盘法设计16种中草药组合的120种双联复方和10种中草药组合的120种三联复方,评估了复方的体外抑菌作用。结果表明:16种中草药对大鲵致病性豚鼠气单胞菌均有一定程度的抑菌作用,抑菌作用强弱依次为诃子、五倍子、石榴皮、大黄、槐角、覆盆子、黄芩、金樱子、肉苁蓉、丁香、川牛膝、赤芍、知母、防风、天葵子及罗汉果;在120个中草药双联复方中,5.8%为显著协同作用,82.6%为协同作用,11.6%为相加作用;在120个中草药三联复方中,29.2%为显著协同作用,87.5%为协同作用。因此,合理的中草药配伍能提高对大鲵致病性豚鼠气单胞菌的体外抑菌作用。

甲鱼病原性豚鼠气单胞菌的分离鉴定

自杭州市郊某甲鱼场送检的病死甲鱼中分离到２２株细菌，在与嗜水气单胞菌抗血清不产生凝集的多株细菌中挑选３株作进一步鉴定，生理生化特性显示它们均属豚鼠气单胞菌。小鼠试验显示有毒力，用其中１株回归本动物发病死亡，并出现与自然病例类似症状。用１株分离菌制备的抗血清与其他２１株分离菌株进行玻板凝集试验，其中１１株有毒力菌株都出现凝集反应，显示豚鼠气单胞菌为本病的主要病原。

中国豹源豚鼠气单胞菌的分子鉴定与毒力基因分析

从表现为急性出血性败血症的中国豹分离到一株细菌,为了鉴定这株细菌,并对其主要毒力基因进行检测分析,实验中进行了细菌的分离培养、生化鉴定及动物毒力试验;PCR扩增gyrB基因并结合系统发育树的构建和分析进行了菌种的分子鉴定;对分离菌进行了气溶素(aerolysin,aer)、热敏感细胞肠毒素(heat-Labile cytotonic enterotoxin,alt)、细胞毒性肠毒素(cytotoxic enterotoxin,act)、热敏蛋白酶(temperature-sensitive protease,eprCAI)、丝氨酸蛋白酶(serine protease,ahp)5种毒力基因的PCR扩增和测序。结果显示:根据培养特性、生化试验、小白鼠毒力试验鉴定分离菌为豚鼠气单胞菌;中国豹源细菌gyrB基因与豚鼠气单胞菌(JQ815381)的同源性为98.9%,应为豚鼠气单胞菌;具有act、alt、eprACI 3种毒力基因。该研究可为快捷、准确检测气单胞菌引起的疾病提供参考。

鲈鱼豚鼠气单胞菌的鉴定及其药敏试验

为了确定成都市某养殖场引起鲈鱼发病的原因,从发病鲈鱼肝脏中分离病原菌,对其进行形态学观察、生理生化鉴定、16SrDNA基因的扩增并经序列分析构建系统发育树,同时测定该菌株对药物的敏感性。结果表明,分离菌株SCLL2为革兰阴性菌,具有运动力,能分解半乳糖、甘露醇等,吲哚、枸橼酸盐阳性,尿素、H2S、葡萄糖(产气)阴性。扩增的16SrDNA基因片段长度为1 433bp,GenBank登录号为KJ157321,与数据库中豚鼠气单胞菌的相似性高达99%,系统进化树显示该菌株与豚鼠气单胞菌聚为一支。综合该菌株的理化性质和序列分析结果,判定菌株SCLL2为豚鼠气单胞菌。药敏试验结果显示,该菌株对强力霉素、美满霉素、诺氟沙星等高度敏感,对先锋霉素V、红霉素等中度敏感,但对氨苄西林、甲氧卞胺嘧啶等耐药。试验结果为鱼类豚鼠气单胞菌的分子鉴定及鱼类疾病诊治提供了资料。

抗豚鼠气单胞菌单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立及其特性鉴定

目的： 制备抗豚鼠气单胞菌（Aeromonas caviae）单克隆抗体（mAb）并进行鉴定.方法： 用灭活的豚鼠气单胞菌全菌免疫BALB/c小鼠, 采用杂交瘤技术制备mAb.用间接ELISA法对mAb的效价及其与其他细菌的交叉反应性进行鉴定;用免疫组化染色法对mAb的免疫反应性进行鉴定.结果： 获得7株能稳定分泌抗豚鼠气单胞菌mAb的杂交瘤细胞株, 分别命名为0E10、 1A2、 1C4、 1F1、 1F10、 1H8和2A1.经测定杂交瘤细胞培养上清及腹水mAb的效价, 分别为10-1～10-2和10-3～10-5.mAb的Ig亚类鉴定表明, 1F1为IgG1, 1C4、 1F10和1H8为IgG2a, 2A1为IgG2b, 0E10和1A2为IgG3.交叉反应试验显示, 各株mAb均具有较好的特异性.免疫组化染色结果表明, mAb能和豚鼠气单胞菌特异性结合.结论： 成功地制备分泌抗豚鼠气单胞菌mAb的杂交瘤细胞株, 为该菌的快速检测及免疫学研究奠定了基础.