BALB/c小鼠金属硫蛋白-1 cDNA基因在乳酸菌质粒表达载体pNZ2103上的克隆

目的用乳酸菌质粒表达载体pNZ2103克隆BALB/c小鼠金属硫蛋白(MT)-1 cDNA基因。方法设计一对含有限制酶Pst1和H indⅢ位点的引物。以质粒pET21 a-MT为模板,采用PCR法扩增BALB/c小鼠MT-1cDNA。用限制性内切酶Pst1和H indⅢ将MT-1 cDNA克隆于质粒pNZ2103形成重组质粒pNZ2103-MT。将pN2103-MT转化进入大肠埃希菌DH5α。采用PCR法和Pst1、H indⅢ双酶切方法鉴定含有pNZ2103-MT的转化子。12%SDS-PAGE鉴定pNZ2103-MT在大肠埃希菌DH5α的表达水平。结果获得含有pNZ2103-MT的DH5α转化子。结论以乳酸菌质粒表达载体pNZ2103构建的pNZ2103-MT在大肠埃希菌中表达水平较低,采用SDS-PAGE难以检测到表达水平的金属硫蛋白。

靶向hVEGF165基因shRNA质粒表达载体的构建及筛选

目的构建编码hVEGF165mRNA的shRNA质粒表达载体,并筛选出基因沉默效果最明显的shRNA质粒表达载体。方法以hVEGF165mRNA编码区中第5和第7外显子序列作为RNA干扰靶点,分别构建3个shRNA质粒表达载体和1个阴性对照质粒表达载体并通过PCR进行鉴定。经鉴定后分别转染稳定表达hVEGF165基因的BHK细胞,实时荧光定量PCR和Western blotting分别从mRNA和蛋白质水平检测抑制效果。结果构建的质粒表达载体PCR鉴定均可扩增出预期条带,构建成功。靶向hVEGF165基因的shRNA对所转染稳定表达hVEGF165基因的BHK细胞中hVEGF165基因mRNA和蛋白质表达均有抑制作用,其中shRNA2最为明显。结论成功构建了靶向hVEGF165基因的shRNA质粒表达载体,其中抑制效果最为明显的shRNA质粒表达载体为pDC316-EGFP-U6-shRNA2质粒。

凋亡相关基因PNAS-2 siRNA质粒表达载体的构建、鉴定及转染后筛选方法的选择

硫化砷作用后急性早幼粒细胞白血病细胞系NB4细胞凋亡相关基因PNAS-2（apoptosis—related protein）表达显著降低。Busch等认为PANS-2基因与细胞增殖有关。我们前期的研究发现硫化砷作用后的急性早幼粒细胞白血病（APL）患者白血病细胞及NB4细胞PNAS-2基因表达特异性下调，且呈时间依赖性而K562和U937细胞则无此较应。为了进一步研究封闭该基因后对细胞凋亡的影响，我们扩增其5’端未知序列，构建了PNAS-2 siRNA质粒表达载体并转染U937细胞，筛选、纯化转染细胞后检测U937细胞凋亡的变化以初步了解PNAS-2的作用。

杜氏盐藻荧光素酶基因表达载体的构建

目的 :构建盐藻荧光素酶基因表达载体。方法 :分别用合适的限制性内切酶消化载体pGL3-Enhancervector、pD -B、pMD -CA和pMD -rbcS ,胶回收适当的片段 ,T4DNA连接酶过夜连接 ,转化宿主菌大肠杆菌JM1 0 9。挑取阳性克隆 ,提取质粒DNA ,酶切鉴定。结果 :得到含盐藻自身启动子碳酸酐酶 (CA)基因启动子、双倍重复碳酸酐酶 (DCA)基因启动子和来自衣藻的 1 ,5二磷酸核酮糖羧化酶 /加氧酶小亚基 (rbcS)基因启动子 ,以及荧光素酶(Luc)基因为外源基因的 3个盐藻表达载体。结论 :构建了 3个杜氏盐藻荧光素酶表达载体。

靶向胆囊癌血管内皮生长因子基因短发夹样RNA表达质粒的构建与筛选

背景:已有研究通过RNA干扰技术,抑制结肠癌、前列腺癌和视网膜母细胞瘤细胞的血管内皮细胞生长因子基因的表达。尚未见关于RNA干扰血管内皮生长因子抑制胆囊癌肿瘤的相关研究。目的:创新性构建编码胆囊癌血管内皮生长因子基因的短发夹样RNA质粒表达载体,筛选出沉默血管内皮生长因子基因效果最明显的短发夹样RNA表达质粒。设计、时间及地点:基因工程观察实验,于2008/2009在中南大学湘雅医院卫生部肝胆肠外科研究中心实验室完成。材料:人胆囊癌细胞株GBC-SD购于同济大学肿瘤研究所。方法:设计4对针对血管内皮生长因子基因不同位点的短发夹样RNA片段,构建携带此短发夹样RNA片段的表达质粒(短发夹样RNA1～4)并行酶切鉴定分析。然后通过脂质体将重组质粒转染到胆囊癌细胞株GBC-SD中,48h后测定转染率。主要观察指标:重组质粒酶切鉴定结果。转染效率。采用及荧光PCR检测血管内皮生长因子mRNA表达。结果:成功构建了靶向血管内皮生长因子基因的短发夹样RNA质粒表达载体,其中抑制效果最为明显的短发夹样RNA质粒表达载体为pDC316-EGFP-U6-shRNA2质粒。重组质粒经酶切鉴定证实构建成功。质粒在GBC-SD细胞中的转染率约为58.6%。短发夹样RNA抑制血管内皮生长因子基因的mRNA表达,短发夹样RNA2抑制率最高,可达86%。结论:成功构建并筛选出的靶向血管内皮生长因子的短发夹样RNA表达质粒,其对胆囊癌GBC-SD细胞内的血管内皮生长因子表达具有明显抑制作用。短发夹样RNA2表达质粒抑制作用最明显。

pcDNA3.1(+)/t-PA真核表达质粒的构建及其在血管内皮细胞中的表达

目的 利用基因工程技术克隆人组织纤溶酶原激活物 (t- PA)基因并构建一种能在血管内皮细胞 (VEC)中高效、安全表达 t- PA的 pc DNA3.1(+) / t- PA真核表达重组质粒。方法 采用高效 Trizol试剂快速从胎儿肺组织中提取总 RNA,RT- PCR获得 t- PA c DNA,并将真核表达质粒 pc DNA3.1(+)和 t- PA基因片段分别双酶切 ,将回收的 pc DNA3.1(+)大片段 (5 .0 kb)与 t- PA基因片段 (1.9kb)重组。对 pc DNA 3.1(+) / t- PA质粒进行酶切鉴定和测序。脂质体介导 pc DNA3.1(+) / t- PA转染血管内皮细胞 ,并用 RT- PCR法和 EL ISA法分别从 m RNA水平和蛋白质水平检测 t- PA的表达情况。结果 成功地从胎儿肺组织中克隆了 t- PA基因 ,并构建了以 pc DNA 3.1(+)为载体的真核表达质粒载体。pc DNA3.1(+) / t- PA转染血管内皮细胞后 ,t- PA表达增加 ,(n=6 ,P<0 .0 1)。结论 含t-

t-PA基因克隆及pcDNA3.1t-PA真核表达质粒的构建

目的 利用基因工程技术克隆组织纤溶酶原激活物 (t PA)基因并构建一种无细胞毒性、不激活原癌基因的真核表达的pcDNA3.1t PA质粒载体。 方法 采用高效Trizol试剂快速从人肺组织中提取RNA ,RT PCR获得t PAcDNA ,扩增、纯化、回收t PA基因片段并将质粒 pcDNA3.1和t PA基因片段分别双酶切 ,前者纯化回收大片段 ,后者纯化回收 1 .9kb片段 ,再将回收的pcDNA3.1大片段与t PA基因片段 (1 .9kb)重组。对重组pcDNA3.1t PA质粒进行单酶切和双酶切鉴定 ,并测序。结果 成功地从胎儿肺组织中克隆了t PA基因 ,并构建了以pcDNA3.1为载体的真核表达质粒载体。结论 含t

H7亚型禽流感病毒血凝素基因的真核表达载体的构建及鉴定

参考已发表的H7亚型禽流感病毒(AIV)血凝素(HA)基因序列设计引物,以pUCH7为模板,经PCR扩增出一条1.7kb的HA全基因片段,将该片段定向克隆到真核表达质粒载体pcDNA3.1(一)中,转化大肠埃希氏菌DH5α,小量制备重组质粒pcDNA-HA,酶切鉴定正确后,转染COS-1细胞,经免疫荧光鉴定其体外表达情况。结果表明H7亚型AIV HA在COS-1细胞中获得了成功表达。用该重组质粒pcDNA-HA免疫BALB／C小鼠,制备免疫血清,经免疫印迹实验证实该H7亚型AIV HA在小鼠体内也得到了良好的表达。

Mfn2基因克隆及pEGFPmfn2真核表达质粒的构建

目的利用基因工程技术克隆线粒体融合蛋白2(mitofusin-2,mfn2)基因并构建一种无细胞毒性、不激活原癌基因的真核表达的pEGFPmfn2质粒载体。方法采用高效Trizol试剂快速提取大鼠血管平滑肌细胞株A7r5总RNA,经RT-PCR获得mfn2cDNA,扩增、纯化、回收mfn2基因片段并将质粒pEGFP-N1和mfn2基因片段分别双酶切,前者纯化回收大片段,后者纯化回收2.2 kb片段,再将回收的pEGFP-N1大片段与mfn2基因片段(2.2 kb)重组。对重组pEGFPmfn2质粒进行PCR和双酶切鉴定并测序。结果成功地从A7r5中克隆了mfn2基因,并构建了以pEGFP-N1为载体的真核表达质粒。结论含mfn2基因新型表达质粒构建的成功将为研究mfn2功能、进一步研究该基因异常表达与心血管疾病发生的关系奠定基础。

人热休克蛋白90β-cDNA基因克隆及其真核表达载体的构建

本研究旨在克隆人热休克蛋白90β(HSP90β)基因,构建其真核表达载体pcDNA3.1(+)-hHSP90β,为研究hHSP90β的基因治疗奠定实验基础。按Invitrogen公司操作说明用TRIzolReagent提取鼻咽癌总RNA,并经RT-PCR获得hHSP90βcDNA。用纯化的hHSP90βcDNA与PGEMEasyTVector连接,挑选白色菌落进行鉴定,结果为重组质粒,命名为PGEM-hHSP90β。将PGEM-hHSP90β及pcDNA3.1(+)质粒经AflII和Xbal双酶切、胶回收纯化酶切片段后,体外连接酶切片段,使其定向重组,再将重组DNA转化XL1-blue,经复苏后,在含Ampr的LB固体培养基上筛选出阳性克隆。挑取的LB固体培养基上的单菌落经酶切及测序鉴定,证实为阳性克隆,即hHSP90β与pcDNA3.1(+)体外重组成功,命名为pcDNA3.1(+)-hHSP90β。采用体外重组技术,成功地将人HSP90β插入了真核表达载体pcDNA3.1(+)中。

pEGFP-N3-t-PA真核表达质粒的构建及其在成纤维细胞中的表达

目的利用基因工程技术克隆人组织纤溶酶原激活物(t-PA)基因并构建一种能高效、安全表达t-PA的pEGFP-N3-t-PA真核表达重组质粒,为进一步研制转基因动物奠定基础.方法采用高效Trizol试剂快速从黑色素瘤细胞中提取总RNA,RT-PCR获得t-PAcDNA,并将真核表达质粒pEGFP-N3和t-PA基因片段分别双酶切,将回收的pEGFP-N3大片段(4.7kb)与t-PA基因片段(1.1kb)重组.对pEGFP-N3-t-PA质粒进行酶切鉴定和基因测序鉴定.脂质体介导pEGFP-N3-t-PA转染成纤维细胞(NIH3T3),并用RT-PCR法从mRNA水平检测t-PA的表达情况,用倒置荧光显微镜检测、分析其在NIH3T3细胞中的表达.结果成功地从黑色素瘤细胞中克隆了t-PA基因,并构建了以pEGFP-N3为载体的真核表达质粒载体,并能在真核细胞中表达、分泌t-PA.结论含t-PA基因真核表达质粒构建成功.

堆型艾美耳球虫cSZ1基因在减毒沙门氏菌的表达及免疫保护效果研究

用PCR方法扩增堆型艾美耳球虫广东株子孢子表面抗原基因cSZ1的阅读框架 (ORF) ,与质粒表达载体pYA3342连接后转化大肠杆菌E-coliX6 2 12 ,获得阳性重组质粒后将其电转化至减毒鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)X4 5 5 0。经IPTG诱导获得了cSZ1基因在减毒S typhimurium的高效表达 ,表达产物占菌体总蛋白的 9 2 % ,重组蛋白分子量约为 19kDa。将重组减毒S typhimurium分别以 10 8或 10 9CFU 鸡经口免疫 4日龄岭南黄肉鸡 ,免疫后两周血清中可检测到抗cSZ1的特异性IgG ,3周时抗体水平达到峰值 ;2 5日龄时可在肠道检测到特异性IgA的分泌。免疫后 3周 ,试验鸡分别经口攻击感染 5 0 0个E acervulina孢子化卵囊 ,结果显示免疫组与非免疫组有相似的排卵囊曲线 ;计数攻虫感染后第 3 5～ 9 5天卵囊总产量 ,2个免疫组分别能降低 2 5 . 1%和 4 6 . 4 %的卵囊产生。

成釉细胞瘤中MMP-2的表达及RNA干扰的抑制作用

目的:研究MMP-2在成釉细胞瘤中的表达和RNA干扰对成釉细胞瘤细胞中MMP-2基因的沉默效应。方法:培养成釉细胞瘤细胞,应用免疫组织化学方法检测成釉细胞瘤中MMP-2的表达;体外构建MMP-2靶向siRNA质粒表达载体,将siRNA质粒表达载体转染原代培养的成釉细胞瘤细胞,激光共聚焦显微镜检测siRNA质粒表达载体的转染效率,RT-PCR检测成釉细胞瘤细胞中MMP-2mRNA的改变,明胶酶谱法检测MMP-2的变化,应用SPSS11.0统计软件中的t检验对结果进行统计学分析。结果:成釉细胞瘤中MMP-2呈阳性表达,siRNA质粒表达载体对原代培养的成釉细胞瘤细胞的转染率为41.8%;转染后,成釉细胞瘤细胞的MMP-2mRNA表达水平显著降低,酶原性MMP-2和活性MMP-2显著减少,P<0.05。结论:体外构建的MMP-2靶向siRNA质粒表达载体可以转染体外培养的成釉细胞瘤细胞,并导致MMP-2基因沉默。

利用双顺反子系统在大肠杆菌中高表达bFGF(英文)

目的 :由于人碱性成纤维细胞生长因子编码基因结构存在不利于原核表达的因素 ,构建了双顺反子的大肠杆菌表达系统 ,以期提高其表达量。方法 :其中质粒表达载体pET - 3c携带的T7噬菌体Φ10基因N端氨基酸的编码序列为第一个顺反子 ,bFGF编码基因为第二个顺反子 ,二者同处于T7启动子的下游。结果 :将重组子转导表达菌BL2 1(DE3) ,并经IPTG诱导表达 ,表达量达到菌体总蛋白的 2 0 % ,并具有良好的活性。结论

PMG-36e-CD::upp重组质粒的构建及鉴定

目的：探讨利用分子生物学基因重组技术构建PMG-36 e-CD：：upp自杀基因重组质粒的方法。方法：用小量制备质粒DNA的方法分别提取表达型质粒载体PMG-36 e和自杀基因pORF-CD：：upp,以质粒pORF-CD：：upp为模板PCR扩增CD：：upp基因,表达型质粒载体PMG-36 e与自杀基因CD：：upp分别用限制性内切酶SacⅠ与SalⅠ进行双酶切,T4DNA连接酶16℃恒温水浴过夜连接,转化入感受态JM109,筛选单克隆提取重组质粒PMG-36 e-CD：：UPP进行1%琼脂糖凝胶电泳鉴定,双酶切鉴定,PCR鉴定,及测序鉴定。结果：重组质粒PMG-36 e-CD：：upp经1%琼脂糖凝胶鉴定,分子量为5.5Kb,与其标准分子量大小一致;重组质粒PMG-36 e-CD：：upp经双酶切鉴定及PCR初步鉴定构建成功;送上海生物工程技术服务有限公司测序认证,同源性达100%。结论：重组质粒PMG-36 e-CD：：upp可成功构建,可用于后续实验的表达研究。

猪带绦虫六钩蚴cDNA文库的构建及免疫原基因的筛选与克隆

研究避开庞大的猪带绦虫基因组DNA,以构建六钩蚴发育阶段的cDNA表达文库为策略,利用pSPORT1质粒表达载体首次成功构建了表达文库。经库容量、重组率和代表性测定,库容量达5.0×106,重组率100%,用特异性引物能扩增出六钩蚴发育阶段10ku基因、18ku基因和45W基因家族的A型、B型、C型转录本,说明文库质量高,代表性强。应用快速筛选质粒表达文库和克隆免疫原基因的技术,成功地筛选和克隆到TsO1基因,其完整阅读框架(ORF)为393bp。将其登录到GenBank(AY327451),经BLAST分析,证实是猪带绦虫六钩蚴发育阶段的1个新免疫原基因。