赖型钩端螺旋体外膜蛋白基因结构比较性研究

用 PCR方法扩增不同毒力赖型钩体 Omp L1基因片段 ,进行序列测定 ,用相关软件比较分析核苷酸序列、蛋白质二级结构以及限制性内切酶谱 .不同毒力赖型钩体均能扩增出960 bp的片段 ,非致病 Patoc株未能扩出相应片段 ,中国赖型参考株 Omp L1序列 ( Gene BankNo.AF2 50 31 8)与流感伤寒型相应序列比较有 98个核苷酸差异 ,同源性为 89.8% ,二级结构预测和氨基酸疏水图显示变异主要发生在跨膜蛋白的膜外区 ,其膜上成分并未明显变化 ;赖型强弱毒力株之间 Omp L1序列仅 8个核苷酸差异 ,6个氨基酸变异 ,且集中在 C末端 2 92 -30 5位氨基酸之间 ;限制性内切酶谱分析显示赖型 Omp L1基因位点发生特异变化 .结果提示 ,外膜蛋白 Omp L1基因是钩体保守性较强的致病标记 ;赖型钩体减毒致弱可能与 Omp

中国强毒赖型钩端螺旋体新基因OmpL17的表达及其免疫原性

将Omp L17基因克隆于p GEX- 1λT载体,在大肠杆菌JM10 9中表达分子量约为5 4 KDa的GST-Omp L17融合蛋白,凝血酶切割后得到了大小约2 8KDa的Omp L17蛋白。用纯化的Omp L17蛋白免疫大白兔,制备了高滴度的特异性抗体(1∶4 896 )。本研究获得了纯化的Omp L17及其特异性抗体,为该外膜蛋白致病作用及免疫保护力研究奠定基础。

问号赖型钩端螺旋体内鞭毛蛋白与外膜蛋白基因融合DNA疫苗载体的构建

目的 为增强问号赖型钩端螺旋体 (钩体 0 17株 ) DNA疫苗内鞭毛蛋白基因 (fla B2 )与外膜抗原基因 (omp L1 )的免疫保护作用 ,构建一种能表达 fla B2 与 om p L1 蛋白融合蛋白的 DNA疫苗载体。方法 通过聚合酶链反应分别扩增 0 17钩体 fla B2 与 omp L1 片段并进行融合 ,获得的嵌合基因 om p L1 - fla B2 中含有 10个氨其酸的中间接头序列 ,以维持其空间构象。结果 经酶切鉴定 ,证实有一 1.8kb片段插入载体 ,其 fla B2 及 om p L1 DNA测序结果与文献报道的一致。结论 表达 0 17株钩体 fla B2 与 om p L1 抗原融合蛋白的

赖型钩端螺旋体OmpA外膜基因Loa22重组卡介苗的构建及其免疫蛋白表达

目的以赖型钩端螺旋体外膜蛋白A(OmpA)膜蛋白基因Loa22去信号肽基因片段构建重组卡介苗并对其免疫蛋白进行表达分析。方法以赖型钩端螺旋体56601株全基因组DNA为模板,PCR扩增出Loa22成熟肽基因片段,与大肠杆菌-结核分枝杆菌穿梭整合质粒pMV361一起分别经过双酶切,连接,转化。筛选鉴定出阳性重组质粒rpMV361-loa22,电转化入BCG,经筛选鉴定后,热诱导表达,通过SDS-PAGE及Western Blotting鉴定其表达产物。分别用BCG、rBCG-pMV361、rBCG-loa22、Loa22蛋白、灭活全钩体免疫小鼠两次后,脱臼处死小鼠分离脾淋巴细胞,XTT比色法检测体外脾淋巴细胞增殖活性。结果PCR扩增获得516 bp的片段,成功构建重组穿梭质粒rpMV361-loa22,经电转化构建重组卡介苗成功,热诱导表达出相对分子质量约19×103特异条带。体外脾淋巴细胞增殖实验证实rBCG-loa22可引起细胞反应,其增殖活性与BCG组和rBCG-pMV361组相比差异具有统计学意义(P<0.05)。结论成功构建了赖型钩端螺旋体重组卡介苗rBCG-loa22并高效表达具有免疫学活性的外膜蛋白Loa22,为新一代钩端螺旋体疫苗研究打下了基础。

问号赖型钩端螺旋体23kDa蛋白的免疫原性研究

目的 探讨 p DL12 1的 1.0 kb0 17株问号赖型钩端螺旋体 DNA片段可否作为钩体重组疫苗广谱保护性抗原的候选。方法 采用 SDS- PAGE制备 2 3k Da蛋白 ,免疫日本大耳兔制备抗 2 3k Da抗血清 ,Western blot鉴定其免疫原性。结果 2 3k Da重组抗原兔抗血清可识别 p DL12 1体外表达 2 3k Da抗原产物和问号赖型钩端螺旋体 0 17株超声抗原成份 ;用 Westemblot鉴定抗血清效价 ,其抗体滴度为 1/ 12 80 0 ;用 p DL12 1重组质粒主动免疫豚鼠 ,可使豚鼠抵抗强毒力株钩端螺旋体攻击 ,表现出免疫保护作用。结论 该重组 2 3k Da抗原有良好的免疫原性 ,可能是赖型钩体 0 17株的保护性抗原。

四川省钩端螺旋体病肺弥漫性出血抢救及其主要病原体赖型钩端螺旋体的独特性

钩端螺旋体病(以下简称钩体病)是四川省常见病之一,发病时间集中在秋收季节,农民因下田劳动受染,1980～1989年呈现暴发流行达94县次。肺弥漫性出血(以下简称PDH)是导致四川省钩体病患者死亡的主要原因,占该病死因的98％。经过多年现场观察发现PDH的发生发展有严格规律性,独特的临床征象和病理变化,是一种国内外文献未系统报道过的一种临床病理实体(Special clinico-pathological entity)。通过乐山市几个县长期现场研究,及实验室研究,发现PDH是由数量多、毒力强、致病力大的钩体引起的,在四川、贵州、湖南。

赖型钩端螺旋体017株外膜蛋白新基因ompL17基因靶向敲除及其突变株的构建

目的将外膜蛋白新基因ompL17靶向敲除并构建该基因的突变株。方法提取钩端螺旋体017株基因组DNA,扩增出外膜蛋白新基因ompL17,与打靶载体p2NIL重组,并插入氨苄抗生素抗性基因Ampr+使外膜蛋白新基因ompL17失活,构建重组的基因打靶质粒p2NIL17A。电穿孔转化入钩体017株中构建突变株,通过豚鼠模型观察该突变株的毒力变化。结果PCR、Dotblot和酶切分析,证实构建了以氨苄青霉素抗性基因DNA为标记探针的基因打靶载体,并构建外膜蛋白新基因ompL17敲除的钩体017株突变株。结论成功将钩体外膜蛋白的新基因ompL17进行靶向敲除,并构建钩体017株突变株,为进一步进行该基因的功能研究和阐明赖型钩体致病的分子机制奠定了基础。

赖型钩端螺旋体OmpA外膜蛋白Loa22通过Ca^(2+)信号通路介导A549细胞凋亡

目的研究赖型钩端螺旋体(简称钩体)外膜蛋白Loa22通过Ca2+信号通路对细胞凋亡的影响,探讨该基因在钩体黏附侵袭细胞并诱导其凋亡过程中可能的信号传导机制。方法以人肺腺上皮细胞(A549)为模型,用100μg/mL纯化Loa22成熟肽作用于细胞24 h,检测细胞凋亡及细胞内游离钙浓度([Ca2+]i),观察F-actin细胞骨架变化,检测钙调素(CaM)mRNA表达水平。同时设磷脂酶C(PLC)特异阻断剂U73122预处理+Loa22成熟肽组,观察上述指标变化。结果 Loa22成熟肽作用A549后,细胞凋亡率升高,并诱导[Ca2+]i增加,CaMmRNA表达水平及乳酸脱氢酶(LDH)活性上升,F-actin细胞骨架重排。而预先用U73122预处理后,细胞凋亡率、[Ca2+]i、CaMmRNA和LDH活性均降低(P<0.01),F-actin细胞骨架重排程度减轻。结论 Loa22成熟肽通过PLC信号通路触发细胞[Ca2+]i升高,导致F-actin细胞骨架重排,从而引发细胞凋亡,提示该基因参与钩体侵袭细胞引发细胞凋亡病理过程,可能是致病性钩体的一个重要毒力相关基因。

赖型钩端螺旋体OmpA外膜蛋白Loa22对血管内皮细胞的毒性及对通透性的影响

目的探讨赖型钩端螺旋体Loa22蛋白对血管内皮的毒性作用和功能影响。方法用赖型钩端螺旋体Loa22成熟肽原核重组质粒进行诱导表达带有GST标签的Loa22融合蛋白,经亲和层析柱进行纯化并获取目标蛋白,用SDS-PAGE和Western blot对目标蛋白进行检测和证实。用获得的GST-Loa22融合蛋白刺激处理培养的人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)来说明钩端螺旋体外膜蛋白Loa22对血管内皮细胞的毒性作用以及对其通透性的影响。结果成功表达Loa22成熟肽原核重组质粒,通过鉴定并纯化得到Loa22融合蛋白,该蛋白随着浓度的升高能使培养的血管内皮细胞CCK-8吸光度值降低,细胞凋亡率增加,HUVEC单层通过率升高。结论Loa22融合蛋白对血管内皮细胞有明显的毒性作用,还使得HUVEC通透性增加。

问号赖型钩端螺旋体的进化分析

对问号赖型钩端螺旋体的复制基因进行了分析,引入以S为分歧时间的概念,通过对每个同义位点和非同义位点的核苷酸替代数目的比较,并利用最小二乘法进行了函数拟合,得出在早期复制基因受到相对松的净化选择,之后选择约束力不断增强并慢慢趋于稳定.

螺旋体传染病

莱姆病关节炎的循证治疗；西部大开发中环境改变对莱姆病传播的影响；肺钩端螺旋体病的X线分析；赖型钩端螺旋体OmpA膜蛋白Loa22基因的克隆分析及蛋白表达；一新型钩端螺旋体的毒力研究；