神经营养因子赖氨酸激酶受体1型基因突变致先天性无痛无汗症1例并文献复习

目的 报告先天性无痛无汗症(CIPA)1例并文献复习,增加其病因及临床特点的了解,减少误诊误治。方法 采集2021年12月安徽省儿童医院收治的病儿及其父母外周血进行医学全外显子组基因检测,并对候选基因变异进行Sanger测序验证。结果 基因分子遗传学分析结果提示病儿在神经营养因子赖氨酸激酶受体1型(NTRK1)中存在2个分别来自父母双方的杂合突变(c.575-19G>A和c.444C>A),结合病儿临床表现符合CIPA。结论 CIPA为单基因遗传病,临床罕见,基因分子遗传学分析有助于诊断。

S期激酶相关蛋白2和赖氨酸特异性去甲基酶1双靶抑制剂的虚拟筛选

目的筛选S期激酶相关蛋白2(skp2)和赖氨酸特异性去甲基酶1(LSD1)双靶点抑制剂。方法采用计算机辅助药物设计,经过分子对接、虚拟筛选以及定量构效关系(QSAR)模型预测,从小分子数据库中筛选对两个靶点活性较好的化合物。结果与结论得到了6个对接打分较好的化合物。QSAR模型显示其对skp2和LSD1均有较理想的抑制效果,为后续skp2/LSD1双靶点抑制剂的开发提供了思路。

转录因子TEAD4调控WNK1表达介导Wnt/β-catenin信号通路促进结肠癌增殖和迁移

目的探究转录因子TEA结构域转录因子(TEAD)4通过调控赖氨酸缺乏激酶(WNK)1表达介导Wnt/β-连环蛋白(catenin)信号通路促进结肠癌的增殖和迁移。方法通过实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测TEAD4在正常人结肠上皮细胞NCM-460和人结肠癌细胞系SW620、SW480、LOVO、HCT 116中的表达情况。构建低表达TEAD4和WNK1的SW620和LOVO细胞,并通过平板克隆实验和细胞划痕实验评估TEAD4和WNK1对宫颈癌细胞增殖和迁移的影响。通过生物分析找到TEAD4与WNK1启动子之间的结合位点序列,运用染色质免疫沉淀技术(ChIP)-qPCR验证TEAD4与WNK1启动子的结合情况。在沉默TEAD4的细胞中进一步过表达WNK1检测细胞增殖、迁移和Wnt/β-catenin信号通路的变化。结果TEAD4在结肠癌细胞中显著高表达(P<0.05)。敲低TEAD4显著抑制结肠癌细胞的增殖和迁移(P<0.01)。沉默TEAD4能显著抑制WNK1的表达(P<0.01)。通过抑制Wnt/β-catenin信号通路显著减弱结肠癌细胞的增殖和迁移(P<0.01)。在沉默TEAD4的细胞中进一步过表达WNK1,部分回调细胞的增殖、迁移能力,显著激活Wnt/β-catenin信号通路(P<0.05)。结论转录因子TEAD4促进WNK1表达,激活Wnt/β-catenin信号通路促进结肠癌的增殖和迁移。

Wnk1基因多态性与汉族人缺血性卒中的关联分析

目的：探索赖氨酸缺乏蛋白激酶1（Wnk1）基因单核苷酸多态性（SNP）与中国汉族人群缺血性卒中的关系.方法：收集2008年1月～2009年12月新疆5所医院294例汉族缺血性卒中患者（病例组）和同期外科系统住院治疗的其他无脑梗死疾病的汉族患者314例（对照组）进行病例对照研究.用标签SNP（tSNP）策略选择Wnk1基因10个SNP位点（rs3858703、rs11611246、rs7305065、rs1990021、rs34408667、rs12309274、rs1012729、rs956868、rs12828016、rs953361）.SNP基因分型检测采用多重SNaPshot平台.用t检验、卡方检验和logistic回归分析对数据进行统计分析,用Haploview软件进行连锁不平衡分析和单倍型分析.结果：病例组饮酒（37.1%）、高血压病（62.9%）、糖尿病（18.0%）、高脂血症（36 4%）患者比例均高于对照组（均P〈0.01）,而吸烟者比例在两组间差异无统计学意义（P〉0 05）.所有位点基因分型缺失率均在1%以下.除rs34408667位点外,其余tSNP均通过Hardy-Weinberg平衡检验.Wnk1基因第四内含子rs11611246位点与汉族缺血性卒中相关.T等位基因在病例组中的分布频率低于对照组（30 3%与35 7%,P=0.046）.进行性别分层后发现,rs11611246 T等位基因是汉族男性缺血性卒中发病的保护因子.GT基因型及TT基因型在病例组男性中的分布频率分别为43.3%及7.2%,而在对照组男性中的分布频率分别为43.1%及15.2% （P=0.038）.加性遗传模型显示T等位基因携带者发生缺血性卒中的风险是对照组的0.702倍（95%CI：0.517~0.953,P=0.023）.调整年龄后差异仍然存在（P=0.022）,进一步调整年龄、体质量指数、吸烟、饮酒、高血压、糖尿病、高脂血症等混杂因素后,差异仍然存在（P=0.008）.未发现Wnk1基因其余9个SNP位点与汉族人脑梗死相关.结论：Wnk1基因第四内含子rs11611246多态性影响中国人缺血性卒中的发生.rs11611246位点T等位基因可能是汉族男性发生缺血性卒中的保护因素.

WNK1基因不同转录本在小鼠肾脏中的表达及意义

目的 研究WNK1基因长短两个转录本在小鼠肾脏组织中的表达分布特征 ,为进一步研究它们的生物学功能提供实验数据。方法 RT PCR扩增两个转录本的特异性片段 ,Northern印迹杂交证实片段特异性后 ,将片段克隆入pGEM T载体中 ,体外转录同位素标记的正义和反义RNA探针 ,在小鼠肾脏组织石蜡切片上进行原位杂交检测。结果 WNK1基因长转录本微弱广泛地表达在小鼠肾脏组织上 ,短转录本特异地表达在小鼠肾脏皮质部的远曲小管上。结论 在肾脏 ,WNK1基因的短转录本是功能性转录本 ,其编码的蛋白质在生物学功能上可能与其它激酶不同。

伴赖氨酸缺乏蛋白激酶1基因错义突变的高血压1例的临床特征及家系分析

目的本文对1例早发高血压Gordon综合征患者进行家系调查和基因检测,以明确患者的临床诊断和致病基因是否为家族遗传性,并探讨该突变类型与表现型的关系。方法收集先证者及其家系的临床资料,提取外周血基因组DNA,对赖氨酸缺乏蛋白激酶1(WNK1)基因突变进行检测。采用聚合酶链反应(PCR)对WNK1进行分子分析。对确诊患者给予限盐和口服氢氯噻嗪治疗并对其进行随访。结果本研究纳入包括先证者在内的8名家系成员。先证者及两名家系成员携带有WNK1基因C.3154G>A错义突变,该突变为首次报道。该突变先证者出现早发高血压和早发脑卒中事件,对先证者给予限盐和口服氢氯噻嗪治疗,治疗1个月和3个月后随访发现疗效显著且稳定。结论本研究通过对早发高血压病例进行家系研究和突变基因检测,发现了WNK1基因一个新的致病突变。

赖氨酸羟化酶2在食管鳞状细胞癌组织中的表达及其对食管鳞状细胞癌细胞迁移和侵袭的影响

目的通过观察赖氨酸羟化酶2(PLOD2)在食管鳞状细胞癌(简称鳞癌)组织中的表达水平并分析其与临床病理参数间的相关性,探讨PLOD2调控食管鳞癌细胞侵袭转移的作用机制。方法应用免疫组织化学法检测60例食管鳞癌患者(收集于2016年1月至2017年12月新乡医学院第一附属医院)肿瘤组织和配对癌旁组织中PLOD2的表达水平并分析其与临床病理参数的关系;应用天狼猩红染色检测胶原纤维蛋白沉积;LV-vector、LV-over/PLOD2慢病毒载体转染食管鳞癌细胞系EC-109细胞,应用即时荧光定量PCR法检测PLOD2表达情况;细胞迁移和侵袭实验检测肿瘤细胞迁移和侵袭能力;Western blot法检测PLOD2/AKT上皮-间质转化信号通路相关蛋白的表达。结果在食管鳞癌患者肿瘤组织中PLOD2的表达水平(81.7%,49/60)显著高于配对癌旁组织(8.3%,5/60;P<0.01);且与肿瘤浸润深度和淋巴结转移显著相关(P<0.01);天狼猩红染色显示,PLOD2高表达的食管鳞癌组织中胶原纤维沉积显著高于PLOD2低表达的组织(P<0.01);细胞迁移和侵袭实验结果显示,过表达PLOD2可提高EC-109细胞的迁移和侵袭能力,与LV载体组相比,差异有统计学意义(P<0.01);Western blot结果显示,过表达PLOD2可上调黏着斑激酶(FAK)/AKT信号通路相关蛋白p-FAK、p-AKT、波形蛋白等的表达。结论PLOD2在食管鳞癌组织中高表达,并与肿瘤迁移和侵袭密切相关;PLOD2促进食管鳞癌迁移和侵袭的机制可能与激活FAK/AKT信号通路、促进上皮-间质转化进程有关。

微小核糖核酸-24-3p抑制肝细胞癌增殖、迁移及侵袭机制

目的探讨微小核糖核酸-24-3p(miR-24-3p)对肝癌细胞增殖、迁移及侵袭的影响及其机制。方法收集2019年6月至2021年8月长江大学附属荆州医院诊治的肝癌患者肝癌组织及癌旁组织。分别将miR-NC组、miR-24-3p inhibitor组、pcDNA3.1组、pcDNA3.1-WNK2组、miR-24-3p inhibitor+pcDNA3.1-NC组、miR-24-3p inhibitor+pcDNA3.1-WNK2组、miR-24-3p inhibitor+shRNA-NC组、miR-24-3p inhibitor+sh-WNK2组转染至HepG2细胞。实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测miR-24-3p表达;蛋白质印迹法(Western blot)检测WNK赖氨酸缺陷型蛋白激酶2(WNK2)、细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、金属基质蛋白2(MMP-2)蛋白表达;噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖;Transwell法检测细胞侵袭、迁移情况;荧光素酶报告基因实验验证miR-24-3p与WNK2的靶向关系;体内成瘤实验检测肿瘤体积及重量。两组间均数比较采用t检验;多组间均数比较采用单因素方差分析(组间比较采用SNK检验)。结果肝癌组织miR-24-3p表达显著高于癌旁组织(1.13±0.04比2.16±0.28),WNK2蛋白表达显著低于癌旁组织(1.56±0.23比0.54±0.11),差异有统计学意义(t=14.104、15.495,P<0.05)。HepG2、Hep3B、MHCC97H及Huh7细胞中miR-24-3p表达显著高于L02细胞(分别1.68±0.20、1.26±0.13、1.31±0.21、1.43±0.24比1.01±0.10),差异有统计学意义(F=8.892,P<0.05)。miR-24-3p inhibitor组miR-24-3p表达、细胞存活率、Cyclin D1及MMP-2、迁移及侵袭数显著低于对照组及miR-NC组[0.51±0.04比1.01±0.08、(53.61±6.30)%比(97.08±9.26)%、0.49±0.14比1.26±0.22、0.71±0.10比1.35±0.35、92.47±12.18比154.01±25.30、70.10±8.08比130.10±22.30],而WNK2表达显著高于对照组及miR-NC组(1.61±0.29比0.98±0.12),差异有统计学意义(t=12.500、8.769、6.603、3.931、4.901、5.656、4.489,P<0.05)。pcDNA3.1-WNK2组WNK2表达显著高于对照组及pcDNA3.1-NC组(1.58±0.36比0.99±0.10),细胞存活率、Cyclin D1及MMP-2表达、迁移及侵袭数显著低于对照组及pcDNA3.1-NC组[(58.22±21.13)%比(101.07±13.20)%、0.62±0.20比1.29±0.23、0.71±0.26比1.37±0.25、79.40±8.45比155.31±22.35、64.89±9.02比131.62±27.23],差异有统计学意义(t=3.531、3.846、4.915、4.092、7.104、5.186,P<0.05)。pmirGLO-WNK2-wt+miR-24-3p mimics组荧光素酶活性显著低于pmirGLO-WNK2-wt+miR-NC组(0.57±0.09比0.94±0.12),差异有统计学意义(t=5.516,P<0.05)。miR-24-3p inhibitor+sh-WNK2组细胞存活率、Cyclin D1及MMP-2表达、迁移及侵袭数显著高于miR-24-3p inhibitor+shRNA-NC组与miR-24-3p inhibitor组,WNK2表达显著低于miR-24-3p inhibitor+shRNA-NC组与miR-24-3p inhibitor组,差异有统计学意义(F=17.215、28.073、4.839、19.136、53.869、6.565,P<0.05)。结论miR-24-3p可抑制肝癌增殖、迁移及侵袭,其机制可能与调控WNK2表达有关。

有柄石韦中坝巴酸的通淋作用研究

目的研究黔产有柄石韦Pyrrosia petiolosa中坝巴酸的通淋作用。方法犬肾小管上皮细胞(MDCK)给予100μmol/L坝巴酸孵育24 h,MTT法检测坝巴酸对MDCK细胞活力以及脂多糖诱导的MDCK炎症模型细胞活力的影响。雄性昆明种小鼠随机分为正常组、模型组及坝巴酸低、高剂量(10、20 mg/kg)组和肾石通(4.5 g/kg)组,除正常组外,其余各组每日ig 1%乙二醇和1%NH_(4)Cl连续造模30 d,造模同时ig药物,末次给药后取小鼠尿液和肾脏,采用苏木素-伊红(HE)染色法检测肾组织病理变化;采用钙离子检测试剂盒检测尿钙、肾钙含量。利用Auto Dock软件对坝巴酸和过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator activated receptorγ,PPARG)、WNK赖氨酸缺乏蛋白激酶1(WNK lysine deficient protein kinase 1,WNK1)、钙感应受体(calcium sensing receptor,CASR)、细胞色素P450家族24亚家族A成员1(cytochrome P450 family 24 subfamily A member 1,CYP24A1)蛋白进行分子对接并分析对接结果。结果体外实验结果显示,与正常组相比,100μmol/L坝巴酸对MDCK细胞活力无明显影响;在30 mg/mL脂多糖诱导的炎症细胞模型中,坝巴酸可以显著提高MDCK细胞活力(P<0.05)。体内实验结果显示,各给药组小鼠肾组织炎性细胞浸润得到改善,肾组织损伤评分显著降低(P<0.05);坝巴酸低剂量组和肾石通组小鼠肾钙含量较模型组显著降低(P<0.05),尿钙含量显著升高(P<0.05)。分子对接结果显示,PPARG、WNK1、CASR、CYP24A1蛋白与坝巴酸的分子对接能均小于-21 kJ/mol,对接效果均较好。结论黔产有柄石韦中坝巴酸具有较好的抗炎、抑制肾钙蓄积的作用,其通淋活性机制与PPARG、WNK1、CASR、CYP24A1蛋白的结合活性有关。