5种因子对赤红球菌HDRR2Y去除氨氮和亚硝酸盐效应的影响

赤红球菌(Rhodococcus ruber)是常见的污水、废水处理微生物,为探究环境因子对赤红球菌HDRR2Y去除氨氮(NH_(4)^(+)-N)和亚硝酸盐(NO_(2)^(-)-N)效应的影响,将HDRR2Y菌株发酵液添加至含有高浓度NH_(4)^(+)-N或NO_(2)^(-)-N的养殖水体中,通过国标法检测氨氮和亚硝酸盐浓度的变化,检验菌株培养液去除氨氮及亚硝酸盐的效果。按照温度、转速、盐度、接种菌量、底物浓度(氨氮和亚硝酸盐)5个因素进行Plackett-Burman实验设计,探讨这些因子对赤红球菌去除氨氮和亚硝酸盐效应的影响。结果显示,发酵过程中,菌株HDRR2Y浓度在36 h内从初始的5×10^(4)CFU·mL^(-1)增至4.08×10^(9)CFU·mL^(-1)。添加菌株培养液后,养殖水体氨氮质量浓度从初始的15 mg·L^(-1)降至5.56 mg·L^(-1),去除率为62.96%;亚硝酸盐质量浓度从15 mg·L^(-1)降至6.95 mg·L^(-1),去除率为59.37%。5种因子中,温度和氨氮浓度对菌株HDRR2Y去除氨氮影响最显著(P<0.05),影响权重程度依次为:温度>氨氮浓度>转速>菌量>盐度;温度和转速是影响去除亚硝酸盐最显著的两个因子(P<0.05),权重程度依次为:温度>转速>盐度>亚硝酸盐浓度>菌量。可见,菌株HDRR2Y培养液具有良好的去除氨氮、亚硝酸盐的作用,且温度是影响HDRR2Y去除氨氮、亚硝酸盐效率的最显著因子。

赤红球菌提取物的制备及其化学成分分析

为建立赤红球菌提取物制备新工艺,以赤红球菌Rhodococcus ruber FIM 12为试验材料,通过单因素试验优化赤红球菌提取物制备条件,并进一步分析其类脂化合物、总糖、氨基酸等主要成分。结果表明:赤红球菌提取物制备收率为100 g湿细胞可制备3.97 g赤红球菌提取物,其类脂化合物含量为17.48%,多糖含量44.1%,含有1种氨糖(细胞壁特征氨基酸)和18种氨基酸(其中包含8种人体必需氨基酸),种类较为丰富。研究结果可为深入开发利用赤红球菌提取物可供参考。

可降解三乙胺的赤红球菌S6-2的筛选与鉴定及降解特性

为治理制药废水中残留的难降解有机污染物TEA(triethylamine,三乙胺),以石家庄某污水处理厂的活性污泥为材料,采用富集培养和选择培养,分离筛选到1株能以TEA为唯一碳源和氮源生长代谢的降解菌——S6-2.通过测定形态特征、生理生化特性、G+C(碱基对)摩尔百分比及16S rRNA基因序列系统发育分析,该菌株被鉴定为赤红球菌(Rhodococcus ruber).采用单一影响因素试验分析菌株S6-2对TEA的降解特性,结果表明:菌株S6-2具有较强的TEA降解能力及降解稳定性;其最适降解温度为32℃,最适降解pH为8.0.菌株S6-2可耐受较高浓度TEA,在ρ(TEA)为900 mg/L的培养基中仍能生长;在最适条件下,菌株S6-2对TEA的降解率为70.7%±1.8%.该株菌在含TEA的无机盐平板上传代培养15代后,对TEA的降解率为69.3%±2.5%,说明菌株S6-2对TEA的降解具有稳定性.研究显示,菌株S6-2可作为TEA污染水体生物修复的潜在资源.

赤红球菌CGMCC3090生物转化肉桂腈合成肉桂酰胺的工艺

针对目前肉桂酰胺工业生产采用的肉桂酸和二氯亚砜、浓氨水两步化学反应工艺存在安全性较低、产物分离纯化困难等问题,建立并优化了赤红球菌CGMCC3090催化肉桂腈生成肉桂酰胺的转化工艺.研究表明:底物肉桂腈浓度为1.5,mol/L,赤红球菌菌体质量浓度为2.6,g/L,在30,℃、pH 7.5条件下,转化5,h后转化率可达100%,具有产物纯度高、无副产物肉桂酸生成的优势,为赤红球菌CGMCC3090生物转化合成肉桂酰胺的工艺放大和生产性应用奠定了良好基础.

高效赤红球菌协同CpG ODN增强鸡禽流感疫苗的免疫效力

禽类疫苗存在免疫效率低、免疫持续时间短和细胞免疫刺激不足等问题,新型禽类疫苗佐剂亟待开发。作者的前期研究证实,CpG ODN具有高度的安全性以及良好的细胞和体液免疫刺激功能,然而,CpG ODN的生产和使用成本十分高昂,尚未用于禽类疫苗佐剂。为了降低成本并提升功效,基于TLR2和TLR21潜在的协同关系,本研究以禽流感疫苗为模式疫苗,探究了赤红球菌和CpG ODN协同刺激免疫的关系。通过HI试验、细胞增殖试验和相关细胞因子表达量的检测,证实了该复合佐剂具有更强大的体液免疫和细胞免疫提升功效,能提升Th 1型免疫反应,免疫保护持续时间长,同时还能增强系统和局部免疫。通过检测受体的表达量,确证了CpG ODN与赤红球菌之间存在着协同关系。此外,在CpG ODN剂量减半的复合佐剂刺激试验中,发现由于协同关系的存在,CpG ODN半剂量的复合佐剂仍具有良好的免疫刺激效果。本研究为进一步降低CpG制剂的生产和使用成本做了先行探究,为CpG制剂高效且成本可控地应用于禽类动物养殖,乃至畜牧养殖奠定了基础。

赤红球菌JDM312株环己酮单加氧酶基因的克隆和序列分析

应用PCR从赤红球菌JDM312株基因组DNA中扩增出chnB基因序列,构建pUC18-chnB重组质粒,转化大肠杆菌DH5α,并对插入片段进行测序,用Clustal X和Mega 3.1软件对测定DNA序列进行相似性和系统发育分析.结果显示:扩增得到的chnB基因大小为1 623 bp,编码由542个氨基酸残基构成的多肽,与已报道不同细菌属菌种chnB基因核苷酸序列的相似性为85%～98%,其中与红球菌Phi2株的亲缘关系最近.

响应面法优化赤红球菌HDRR2Y发酵培养参数

通过响应面法对硝化菌——赤红球菌(Rhodococcus ruber)HDRR2Y的发酵培养参数进行优化,以提高其活菌数。首先通过单因素实验筛选出赤红球菌HDRR2Y的最优碳、氮源,并采用Plackett-Burman实验得到影响活菌数的显著因素,然后进行响应面实验,经最陡爬坡及回归分析得出最佳培养参数,最后以摇瓶实验检验其合理性。结果显示,赤红球菌HDRR2Y的最优碳、氮源分别为乙酸钠和酵母膏+蛋白胨+氯化铵(1:1:1,质量比),显著影响活菌数的因素有碳、氮源及温度,经回归分析得到的最优培养参数为乙酸钠5.48 g/L、酵母膏+蛋白胨+氯化铵4.96 g/L、温度29.24℃、pH 7.0、转速200 r/min、MgSO_(4)0.2 g/L、KH_(2)PO_(4)0.5 g/L、NaCl 9 g/L、CaCl_(2)0.5 g/L、MnSO_(4)0.025 g/L、FeSO_(4)0.05 g/L、C_(5)H_(9)NO_(4)0.002 g/L、接种活菌数1×10^(4)cfu/mL、装液量40%(体积分数)、培养时间36 h。优化后的实际活菌数为1.54×10^(9)cfu/mL,远高于优化前的活菌数(1.8×10^(8)cfu/mL)(P<0.01)。因此,采用响应面法优化赤红球菌HDRR2Y的发酵培养参数能大幅提高其发酵活菌数,为硝化菌剂的工业化生产提供数据参考。

赤红球菌JDM312环己酮单加氧酶的原核表达及检测

通过酶切法从重组质粒pUC18-chnB中得到编码环己酮单加氧酶的chnB基因序列,将其定向插入原核表达载体pQE30中,构建重组质粒pQE30-chnB,转化到大肠杆菌BL21中并诱导表达目的蛋白,用SDS-PAGE电泳检测表达产物.测序结果表明chnB基因大小为1 623bp,编码由540个氨基酸残基构成的多肽.SDS-PAGE结果显示,表达分子量约为60kDa的带有6×His标签的环己酮单加氧酶,与预期分子量相符,表明成功构建出原核表达质粒并实现了目的蛋白表达,为进一步开展环己酮单加氧酶活性研究奠定了基础.

紫外线等离子体复合诱变赤红球菌提高红色素产量

为提高赤红球菌产红色素的能力,以实验室保藏的赤红球菌(Rhodococcus ruber YM-2)为出发菌株,采用等离子体单独诱变、等离子体连续诱变、紫外线单独诱变、紫外线等离子体复合诱变等方法,最终在等离子体连续诱变处理分别45、30 s时,经筛选得到一株遗传稳定的突变株A_2,红色素粗品产量达到1.12 g/L,相比于出发菌株提高了30.32%。同时发现等离子连续诱变比等离子体、紫外线单独诱变,或紫外线和等离子复合诱变的正突变率高,达到39.40%,等离子体连续诱变可作为一种高效的诱变手段。

金属离子对赤红球菌(Rhodococcus ruber L9)降解芘的影响及其作用机制

实验室从石油污染土壤中筛选得到一株高效芘降解菌,命名为赤红球菌(Rhodococcus ruber L9),分析了不同浓度Fe^3+、Ca^2+、Cu^2+、Mn^2+对该菌降解芘效果的影响.结果发现,0.45 mmol·L^-1 Fe^3+对芘的降解率有明显促进作用,6 d时芘降解率最高,可达77%,相较于不加金属离子时提升了约30%.进一步研究发现,当Fe^3+存在时,芘降解过程中蛋白总量变化、邻苯二酚1,2-双加氧酶(C120)和邻苯二酚2,3-双加氧酶(C230)酶活性的变化与Fe^3+和Fe^2+在胞内、胞外浓度的变化密切相关,主要原因是Fe^3+的存在,能诱导赤红球菌合成更多与芘降解有关的蛋白,且可以作为酶的活性中心提高酶的活性,从而大幅提高芘的降解效率.

赤红球菌组氨酸激酶的融合表达和功能分析

对赤红球菌的组氨酸激酶基因进行密码子优化,将优化后的组氨酸激酶基因(rhks)构建重组表达质粒pGEX-4T-2-rhks。将此质粒导入到大肠杆菌BL21(DE3)中进行异源表达。在25℃和1 mmol/L异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷诱导条件下,组氨酸激酶融合蛋白(GST-RHK)获得成功表达,并具有催化活性。经谷胱甘肽琼脂糖亲和层析纯化,获得电泳纯的GST-RHK,其中纯化倍数为3.1,得率为19.5%。该蛋白大小约为72.75 kDa,K_(m)、V_(max)和K_(cat)值分别为20.92μmol/L、0.17μmol/(L·min)和1.4 min^(-1)。野生型赤红球菌、组氨酸激酶基因增强株sdrhkE和组氨酸激酶基因敲减株sdrhkD在分别含有苯酚、甲苯、氯苯、异辛烷4种有机溶剂的培养基中培养,菌株sdrhkD的生长情况都优于野生型赤红球菌,菌株sdrhkE的生长情况都低于野生型赤红球菌。本研究为进一步揭示赤红球菌SD3中组氨酸激酶涉及的信号转导途径与赤红球菌有机溶剂耐受性的关联机制提供一定参考依据。

赤红球菌甲苯胁迫响应蛋白基因的克隆、生物信息学分析和表达变化研究

从赤红球菌SD3中克隆了一个甲苯胁迫响应蛋白基因tsrp1,该基因长度为417 bp,在GenBank的登录号为MK371001.该基因编码的蛋白质Tsrp1由138个氨基酸残基组成,理论分子量为14.2 kDa,理论等电点为4.82,不稳定系数为18.68,总平均疏水指数为-0.154,属于酸性稳定的亲水蛋白.Tsrp1无信号肽和二硫键、无跨膜区、无保守结构域,存在于细胞质中.在R.ruber SD3中Tsrp1蛋白与R.rhodochrous、R.zopfii、R.pyridinivorans、R.hoagii、M.brevis和C.manganitolerans中的序列相似蛋白的相似性分别为94.93%、71.29%、67.96%、44.58%、42.05%和35.00%.通过分子对接发现Tsrp1与c-di-GMP存在相互作用.在甲苯和苯酚胁迫下,在赤红球菌SD3中tsrp1基因的表达分别为原来的40.19倍和14.73倍.

产红色素赤红球菌的筛选鉴定和产色素条件的优化

将一株土壤中分离筛选出的产红色素菌株采用生理生化及分子生物学鉴定,根据菌株的16Sr DNA序列分析结果及生理生化特性,该菌株归属为赤红球菌(Rhodococcus ruber)。以此菌株为出发菌株,通过单因素筛选及正交试验对赤红球菌发酵色素培养基以及培养条件进行优化研究。确定最优培养基配方为:果糖10 g/L、蛋白胨5 g/L、酵母粉15 g/L、氯化钠10 g/L、玉米浆15 g/L;最佳培养条件为:培养温度28℃、摇瓶装液量50 mL/250 mL、转速190 r/min、接种量4%、p H6.5,发酵液产菌体干重达到6.6 g/L,红色素粗品产量达到0.93 g/L。

一株石油降解赤红球菌(Rhodococcus rubber)特性及处理含油废水研究

从石油污染土壤筛选出一株高效石油降解菌JC-106,经细菌形态学、生理生化及16S r DNA序列分析鉴定为赤红球菌(Rhodococcus rubber).在温度15~40℃、初始p H 6~8、盐度0~4%条件下培养生长良好.该菌能利用十二烷、二十四烷、正辛烷、邻苯二酚、蒽、萘为唯一碳源生长.在较低温度下能有效降解原油,在15和35℃培养15 d对原油降解率分别为41.61%和58.18%,GC-MS分析发现原油组分中正构烷烃(C14~C44)降解率达到96.13%.在含1000 mg·L^(-1)原油的人工废水中加入2%(V/V)赤红球菌JC-106菌悬液,采用SBR间歇式活性污泥法处理含油废水,15 d后出水COD、NH_4+-N、TP平均去除率分别为96.49%、96.88%、99.15%,原油去除率为92.43%,对照组原油去除率仅为53.80%.JC-106在含油废水中稳定生长,数量维持在4.8×1010~1.0×1011cfu·mL^(-1)左右.

赤红球菌二鸟苷酸环化酶基因的克隆、信息学分析和转录变化研究

本研究通过克隆赤红球菌SD3的二鸟苷酸环化酶(DGC)基因,并对该酶进行生物信息学分析,研究其在甲苯和苯酚胁迫下的转录水平变化,为进一步研究该酶和赤红球菌SD3有机溶剂耐受性之间的关系奠定基础。综合使用煮沸法和冻融法提取赤红球菌SD3的总DNA,利用PCR扩增和T载体克隆获得DGC基因序列;利用生物信息学手段对DGC的理化性质和结构特征进行分析;利用邻位相连法构建进化树;采用Discovery studio 3.5将DGC与底物GTP进行分子对接;采用qPCR方法分析DGC基因在甲苯和苯酚胁迫下的转录变化情况。克隆获得了赤红球菌SD3的DGC基因序列,在GenBank中的序列登录号为MH482549。该基因的开放阅读框长为1 332 bp,编码443个氨基酸,预测蛋白分子量为46.95 kD,是疏水性蛋白。无信号肽和二硫键,含有6段跨膜区,第181~316位氨基酸之间存在一个GGDEF保守结构域和c-di-GMP结合抑制位点(Ⅰ位点)。亚细胞定位分析表明,DGC属于质膜蛋白。DGC中超过50%的氨基酸参与形成α螺旋结构。进化树分析表明Rhodococcus ruber SD3和Rhodococcus aetherivorans的DGC聚为一簇,推测赤红球菌SD3的DGC也属于ClassⅢnucleotidyl cyclases家族,具有类似的分子功能。分子对接表明DGC和GTP分子通过疏水作用和氢键产生相互作用。qPCR结果表明在甲苯和苯酚胁迫下,赤红球菌SD3中DGC基因的转录分别上调了1.57倍和8.71倍。研究表明,赤红球菌SD3中的DGC催化GTP产生c-di-GMP,并且DGC基因的转录在有机溶剂胁迫下发生显著上调,这暗示c-di-GMP与赤红球菌SD3的有机溶剂耐受性可能相关。

赤红球菌位点-2蛋白酶类似蛋白底物的筛选及其基因克隆和表达变化分析

位点-2蛋白酶(S2P)作为一种在大多数细菌中存在的金属蛋白酶,在受控膜内蛋白水解(RIP)中发挥重要作用。赤红球菌中关于S2P类似蛋白作用何种底物未见报道。本研究利用分子对接的方法在赤红球菌SD3中筛选S2P类似蛋白的底物,克隆底物蛋白基因,并进行生物学信息分析。通过筛选发现S2P类似蛋白的底物为一个组氨酸激酶。该基因在GenBank中的序列登录号为MN688330。它的开放阅读框长为1410bp,编码469个氨基酸,其蛋白分子量为49.62kD,信号肽存在几率为0.6765,信号肽锚定几率为0.2113,信号肽的切割位点位于35~36位氨基酸之间。该蛋白属于不稳定疏水性蛋白,同时有3个明显的疏水峰,没有二硫键,含有1段跨膜区,二级结构主要以α螺旋为主,亚细胞定位表明组氨酸激酶在细胞膜上发挥生物学作用。组氨酸激酶的第164~455位氨基酸之间包含多种保守结构域,属于多种超家族。进化树分析表明Rhodococcus ruber SD3和Rhodococcus pyridinivorans SB3094的组氨酸激酶聚为一簇。荧光定量PCR分析表明在甲苯和苯酚的胁迫下,组氨酸激酶的表达分别下调到对照样品的0.76倍和0.78倍。本研究为进一步揭示赤红球菌SD3中蛋白酶解所涉及的信号转导途径奠定基础。

赤红球菌SD3全基因组测序及其热休克蛋白DnaK的表达分析

红球菌属微生物因其自身较强的有机物耐受性和较宽的降解谱,能够适应多种生境而被广泛应用于生物脱硫、石油污染修复、有毒有机化合物降解、污水处理等领域。本研究利用单分子PacBio测序技术,对一株耐有机溶剂的赤红球菌SD3(Rhodococcus ruber SD3)全基因组进行测序并进行生物信息学分析。该菌株的全基因组长度大约为5.37 Mb,GC含量为70.63%,GenBank序列登录号为CP029146。使用Barrnap0.4.2和tRNAscan-SEv1.3.1软件对基因组中包含的rRNA基因和tRNA基因进行预测,发现有12个rRNA基因和53个tRNA基因。利用Glimmer3.02软件对该基因组进行基因预测,共得到5120个编码蛋白的基因。将预测的蛋白序列同时与KEGG、STRING和GO三类数据库进行Blastp比对,共计2836个蛋白基因获得COG功能注释,并且注释得到3130条GO功能条目和2190条KEGG通路条目。此外,基于荧光定量PCR的分析表明在甲苯和苯酚胁迫下,赤红球菌SD3中热休克蛋白DnaK的表达分别上调了29.87倍和3.93倍。这些研究结果为赤红球菌的遗传改造和揭示赤红球菌的有机溶剂耐受性机制提供了理论依据。

高效降解环己酮红球菌JDM-3-12的分离及其系统发育分析

从岳阳巴陵石化公司环己酮生产车间总出水口的污泥中筛选到一株环己酮降解菌株,菌号为JDM-3-12;该菌能以环己酮为唯一碳源且能忍受5000 mg/L的环己酮,当环己酮的质量浓度为2000 mg/L时,在温度为30℃,转速为150 r/m in,pH=7的条件下,72小时内该菌株对环己酮的降解率达到97.91%。通过形态观察、生理生化特征检测和基于16S rRNA基因序列的系统发育分析,初步鉴定其为赤红球菌(Rhodococcus ruber)中的一个菌株,该菌最适生长温度为35℃,最适生长pH 7。

海洋红球菌分离鉴定及其产油脂和色素的研究

该研究从海洋环境中分离到一株橙黄色细菌,编号TH-22,经形态观察、生理生化特征和16S rRNA基因序列分析鉴定,该菌归属于赤红球菌(Rhodococcus ruber)。通过单因素实验确定菌株TH-22的培养条件,并初步研究其利用多种糖类物质产油脂和色素的潜力。结果表明,在10 g/L葡萄糖作为碳源、培养温度35℃、摇床转速150 r/min、初始pH为7.5和NaCl含量为1%的条件下发酵5 d,油脂和色素的产量最高,分别为(2.87±0.15)g/L和(3.89±0.28)mg/L。菌株TH-22能够利用多种糖类物质产油脂和色素,为进一步开发研究红球菌利用木质纤维素等生物质资源提供科学依据。

一株耐高氨氮好氧反硝化细菌的鉴定及脱氮性能研究

氨氮(NH_(4)^(+)-N)、硝态氮(NO_(3)^(−)-N)、亚硝态氮(NO_(2)^(−)-N)等含氮(N)化合物是工厂化养殖系统中的主要污染物,水中N浓度较高易造成养殖水体污染并危害水生动物的安全,而好氧反硝化细菌被广泛用于养殖尾水的N降解。为获得一株能安全高效处理高NH_(4)^(+)-N废水的菌株,对从养殖池塘筛得的耐高NH_(4)^(+)-N好氧反硝化细菌WM28进行了研究。运用形态学观察、生理生化及16S rRNA基因测序对该菌株进行种属鉴定;采用抗生素实验、斑马鱼(Danio rerio)攻毒实验对菌株进行了环境及生物安全性评估;在3种单一氮源模拟废水下测定其生长与脱氮性能,并在高浓度N H 4+-N模拟废水中对其进行脱氮能力测试。经鉴定,WM28为红球菌属赤红球菌(Rhodococcus ruber);有较高的抗生素敏感性及较好的生物安全性。在单一NH_(4)^(+)-N、NO_(3)^(−)-N、NO_(2)^(−)-N模拟废水中,培养48 h后N去除率分别为100%、76.3%、66.99%;高浓度NH_(4)^(+)-N模拟废水结果显示:100~500 mg·L^(−1)高浓度NH_(4)^(+)-N模拟废水在48 h后的NH_(4)^(+)-N去除率为100%;700 mg·L^(−1)NH_(4)^(+)-N在116 h后的去除率在88%以上;在第120小时,NH_(4)^(+)-N初始质量浓度为1000 mg·L^(-1)时仍有脱氮能力,去除率为74.38%,说明菌株WM28具有较好的高NH_(4)^(+)-N耐受性。综上所述,菌株WM28是一株耐NH_(4)^(+)-N、安全且高效的好氧反硝化菌,在处理养殖尾水、工业废水上有较好的应用前景。