融合超抗原可提高T细胞衔接器治疗实体瘤的疗效

2024年2月7日,浙江大学药学院陈枢青教授、周展副教授团队在《分子治疗》(Molecular Therapy)上发表了最新研究成果论文“Superantigen-fused T cell engagers for tumor antigen-mediated robust T cell activation and tumor cell killing”(DOI:10.1016/j.ymthe.2023.12.011),提出了强效免疫激活剂(超抗原)和T细胞衔接器(TCE)协同增效的新思路。研究人员利用超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)高效刺激T细胞激活和增殖的特点,设计了SEA融合的TCE,其与抗原阳性肿瘤细胞及外周血单个核细胞共孵育后,杀伤肿瘤活性显著增强,且其活性依赖于肿瘤抗原的表达。

超抗原SEA对小鼠脾淋巴细胞活化和增殖的影响

目的观察超抗原SEA体外对小鼠脾淋巴细胞活化和增殖的影响。方法SEA体外诱导小鼠脾淋巴细胞,测定淋巴细胞、T细胞、B细胞的增殖能力,用流式细胞术检测淋巴细胞膜表型的变化,并测定脾淋巴细胞培养上清中IL-2、IL-4、IL-10、INF-γ的水平。结果不同浓度SEA诱导脾淋巴细胞的增殖能力不同,在1～4d内的增殖变化也不完全一样,SEA浓度为103ng/mL时,脾淋巴细胞的活化和增殖能力最强。SEA对T细胞(无APC)和B细胞的增殖无明显影响。细胞培养上清中IL-2和INF-γ的水平显著升高,IL-4和IL-10含量低。结论在APC递呈作用下,SEA能显著诱导初始CD4+T细胞和CD8+T细胞的活化和增殖,促使TH0细胞向TH1细胞分化,分泌IL-2、IFN-γ等细胞因子。

超抗原SEB或SEC对T细胞分泌IL-2和杀伤HcaF细胞的影响

目的探讨超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)和金黄色葡萄球菌肠毒素C(SEC)在体外刺激T细胞分泌IL-2和杀伤肿瘤细胞的作用。方法不同浓度SEB或SEC在体外刺激T细胞,采用流式细胞术检测T细胞受刺激后不同时间分泌IL-2的水平,用MTT法检测活化的T细胞及其上清对肝细胞癌HcaF细胞的杀伤效应。结果SEB或SEC能刺激T细胞大量分泌IL-2,刺激剂量以100μg/L时活化T细胞的能力最强,最佳刺激时间为3～4d。SEB或SEC活化的T细胞对肝细胞癌HcaF细胞具有很强的杀伤效应,两者对T细胞分泌IL-2和杀伤HcaF细胞的作用无明显差异。结论SEB或SEC具有很强的刺激T细胞分泌和增强T细胞杀伤肿瘤细胞的能力,为其应用于肿瘤免疫治疗奠定了一定基础。

慢性荨麻疹患者血清金黄色葡萄球菌超抗原特异性IgE检测及其意义

目的检测慢性荨麻疹(CU)患者血清金黄色葡萄球菌(简称金葡菌)超抗原肠毒素A(SEA)、肠毒素B(SEB)和中毒性休克综合征毒素(TssT-1)的特异性IgE(sIgE),分析该超抗原sIgE与慢性荨麻疹相关性,探讨其发病机制。方法采用酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测63例慢性荨麻疹患者和60例正常对照组血清金葡菌超抗原SEA、SEB和TssT-1的sIgE水平,分别进行金葡菌超抗原(SEA、SEB、TssT-1和SEA/SEB/TssT-1)sIgE比较,并将其浓度与病情程度评分(UAS)进行相关性分析。结果 CU患者血清中金葡菌超抗原(SEB、TssT-1和SEA/SEB/TssT-1)sIgE水平均高于正常对照组,差异有统计学意义(P<0.05);金葡菌超抗原(SEA、SEB和SEA/SEB/TssT-1)sIgE水平分别与CU病情轻中重度和荨麻疹活动评分(Urticaria activity score,UAS)呈正相关(P<0.05)。结论慢性荨麻疹患者血清中金葡菌肠毒素A、肠毒素B和TssT-1 sIgE水平升高,可能与其慢性病程及严重程度有关。

应用SCID小鼠观察外源性超抗原SEC治疗人胶质瘤

目的 评估外源性超抗原SEC对胶质瘤的体内杀伤效果。方法 建立人脑胶质瘤的动物模型和人外周血淋巴细胞 SCID小鼠免疫嵌合模型 ,观察SEC对胶质瘤的抑制作用及分离并计数肿瘤浸润淋巴细胞。结果 SEC对胶质瘤的生长有较强的抑制率 ,并能激活淋巴细胞产生大量的肿瘤浸润淋巴细胞。结论 作为一种免疫增强剂 。

超抗原与超抗原疫苗

超抗原多为某些细菌和逆转录病毒的抗原性代谢产物，对机体的免疫系统有着重要的影响，与人类许多疾病有着极其密切的关系。据超抗原的作用机制，国外最近提出超抗原疫苗的思路，用于防治超抗原引起和介导的疾病，并呈现出较好的苗头。

超抗原研究进展

超抗原为一类特殊的抗原分子 ,对机体的免疫系统可产生重要的影响 ,与许多疾病有着极其密切的关系。按其作用的细胞种类 ,可分为 T细胞超抗原 ( T- SAg)及 B细胞超抗原 ( B- SAg)。T- SAg具极高的 T细胞激活频率 ,反复刺激还可诱导免疫耐受。 B- SAg能刺激 B细胞产生大量免疫球蛋白 ,激活体液免疫反应和补体级联反应并可特异性诱导B细胞凋亡。据超抗原的作用机制研制超抗原疫苗 。

超抗原及其应用前景

超抗原为一类特殊的抗原分子,对机体的免疫系统可产生重要的影响,与许多疾病有着极其密切的关系。根据超抗原的作用机制研制超抗原疫苗,将对由于超抗原引起的疾病的防制提供一种新的思路。

金黄色葡萄球菌超抗原与特应性皮炎及湿疹关系的初步探讨

目的:探讨皮损部位金黄色葡萄球菌(金葡菌)超抗原(SAg)与特应性皮炎(AD)及湿疹(EC)的关系。方法:反向被动乳胶凝集法测定来自91例AD和174例EC患者皮损共123株金葡菌SAg的产生情况,结合患者的严重度指数(EASI)评分、6种不同皮疹的评分以及血清学指标进行分析。结果:AD组皮损处SAg总阳性率(55.4%)及中毒休克综合征毒素(TSST)-1阳性率(21.4%)均高于EC组(37.3%、4.5%)。AD组内金葡菌肠毒素B(SEB)阳性组EASI评分高于SEB阴性组和金葡菌阴性组。EC组SAg产生与EASI评分无关,但SAg阳性组其皲裂评分较高。AD患者血清白介素(IL)-4、γ干扰素(IFN-γ)及总IgE水平与SAg无关,EC患者SAg阳性组血清总IgE水平高于金葡菌阴性组,IL-4和IFN-γ水平与SAg无关。结论:与EC相比,AD与金葡菌SAg的关系更为密切,某些型别SAg分型与AD临床严重度可能有一定联系。

超抗原SEA的基因克隆、原核表达与鉴定

目的 构建pRSET SEA重组表达载体 ,转化大肠杆菌BL2 1 (DE3)pLysS ,诱导表达超抗原葡萄球菌肠毒素A(staphylococcalenterotoxinA ,SEA) ,进行分离、纯化及westernblot鉴定。方法 采用PCR技术 ,从产SEA的葡萄球菌标准菌株FRI1 0 0基因组DNA中获得SEA全长序列 ,克隆入pUC1 9中 ,进行测序 ,构建pRSET SEA表达质粒 ,转化大肠杆菌BL2 1 (DE3)pLysS ,通过异丙基硫代 β D 半乳糖苷 (isopropyl beta D thiogalactopyranoside,IPTG)诱导表达 ,分离、纯化及westernblot鉴定。结果 PCR获得超抗原SEA基因片段 ,DNA测序结果与文献报道一致 ;构建了pRSET SEA表达质粒 ,并成功地诱导表达出32 0 0 0u的蛋白 ;Westernblot鉴定所得蛋白能够与SEA单克隆抗体特异性结合。结论 本研究成功地克隆了SEA全长 ,并进行了原核表达和分离、纯化 ,获得了SEA蛋白。

超抗原SEB活化耐受性NKT细胞亚群的研究

目的:探讨超抗原SEB活化的效应细胞参与免疫耐受的NKT细胞亚群及分化特征。方法:采用C57BL/J小鼠脾细胞经SEB诱导,收集体外扩增10d的淋巴细胞为效应细胞,与刀豆蛋白(ConA)、脂多糖(LPS)和白介素-2(IL-2)共同培养3d,测定效应细胞对刺激剂的应答反应能力。在正常小鼠淋巴细胞与上述刺激剂反应的同时添加效应细胞,3d后测定效应细胞抑制正常淋巴细胞对刺激原的应答反应能力。用MTT染色方法记录细胞增殖的A值。以ConA活化的淋巴细胞做参照,用流式细胞术(FCM)解析了耐受性效应细胞中NKT细胞亚群并显示分化来源与功能的相关性。结果:与正常淋巴细胞对抗原应答反应能力相比,SEB活化的效应细胞对ConA、LPS和IL-2的应答反应能力明显降低,细胞生长的A值从正常组的0.80±0.04、0.60±0.03和0.55±0.07下降到0.60±0.05、0.30±0.05及0.27±0.04(P<0.01,n=3)。效应细胞抑制正常淋巴细胞对上述抗原的应答反应,尤其抑制ConA活化的T淋巴细胞的应答反应;A值分别由正常值降低到0.26±0.002、0.48±0.04及0.34±0.02(P<0.01,n=3)。效应细胞中CD4+NK1.1+、CD8+NK1.1+、TcRVβ8+/NK1.1+NKT细胞亚群显著增加(P<0.05和P<0.01,n=4)。ConA活化的淋巴细胞是T淋巴细胞并包括CD4-CD8-/CD3+NK1.1+NKT细胞。结论:超抗原SEB活化的耐受功能与CD4+NK1.1+、CD8+NK1.1+、TcRVβ8+NK1.1+NKT细胞亚群有关,它们由T细胞分化而来。CD4-CD8-/CD3+NK1.1+NKT细胞没有参与耐受性调节。

重组葡萄球菌B型肠毒素超抗原的制备及抗肿瘤活性分析

目的 采用基因工程技术制备葡萄球菌B型肠毒素 (SEB) ,并对其体内外抗肿瘤活性进行分析。方法 对SEB在大肠杆菌中进行高效表达和分离纯化 ,并对其超抗原活性和免疫学活性与天然SEB进行比较研究。观察重组SEB对人肝癌细胞的体外抑制作用 ,以及对小鼠肝癌和肉瘤的体内抑瘤效果。结果 SEB获得高效表达 ,并一步将其纯化至均质。与天然毒素相比较 ,重组SEB的免疫学活性与超抗原活性基本相似。首次证明 ,即使SEB的浓度为 10ng/L ,仍然对人肝癌细胞有显著地抑制作用 ,其对小鼠体内的肝癌和肉瘤有一定的抑制作用。结论 重组SEB在体内外均有一定肿瘤抑制作用 。

超抗原SEA联合PML-RARα对外周血T细胞TCR Vβ亚家族基因表达的影响

目的探讨超抗原SEA联合PML-RARα多肽对外周血T细胞TCR Vβ亚家族基因表达的影响。方法分别将SEA、PML-RARα多肽以及SEA联合PML-RARα多肽与正常人外周血单个核细胞共同培养,20d后收集增殖细胞,利用RT-PCR及基因扫描技术分析诱导后增殖T细胞TCRVβ亚家族的利用和克隆性增殖的特点。结果单纯SEA诱导后,T细胞表达了11个TCR Vβ亚家族,且仍为多克隆增殖。单纯PML-RARα多肽诱导后,T细胞限制性表达8个Vβ亚家族,其中Vβ13、Vβ14表现出寡克隆或寡克隆趋势。PML-RARα多肽联合SEA共同诱导,其T细胞表达TCR Vβ亚家族依然呈明显的限制性,且Vβ13、Vβ14亚家族呈寡克隆、双克隆及寡克隆趋势。结论SEA能协同PML-RARα多肽诱导的T细胞克隆性活化与增殖。

肝癌靶向性超抗原基因疫苗的设计和预测

目的 :探讨AFP顺式作用元件调控的肝癌特异性减毒超抗原疫苗 (SEA(D2 2 7A) Linker CD80tm)设计的合理性。方法 :应用核酸和蛋白质分析软件GeneConstructionKit2 .0、ANTHERPRO5 .0、JAMBW1 1和www .expasy .com网站提供的方案 ,分析重组体的开放读框以及融合蛋白的可及性、柔性、抗原性和疏水性 ,并作了跨膜区和二级结构模拟。结果 :重组体的转录受AFP顺式作用元件调控 ,Linker所在部位柔性高 ,可及性弱 ,不改变两侧蛋白分子的抗原性和疏水性。融合蛋白表达后 ,被CD80tm锚定于肝癌细胞表面 ,超抗原部分 (SEA)表达在细胞膜外 ,二级结构预测Linker不改变蛋白结构 ,完全符合作者设计疫苗的初衷。结论 :重组疫苗设计合理 ,特异性高 ,融合蛋白有很大可能保留了SEA和CD80tm的理化特性 ,为进一步的实践操作提供了可靠的理论基础。

超抗原SEB和D-氨基半乳糖对小鼠肝细胞的作用观察

用超抗原葡萄球菌Ｂ型肠毒素（ＳＥＢ）、Ｄ－氨基半乳糖（Ｄ－ＧａｌＮ）及两者合用腹腔注射ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，于２、６、１２、２４ｈ取肝脏和血标本，从形态学和生化指标来研究肝细胞的死亡模式；同时还检测了小鼠２４ｈ死亡率。结果发现单用ＳＥＢ可诱导肝细胞凋亡，其机制可能与ＴＮＦ、ＩＦＮ－γ等细胞因子的产生和作用有关。单用Ｄ－ＧａｌＮ可同时引起肝细胞凋亡和变性，ＳＥＢ和Ｄ－ＧａｌＮ合用２、６ｈ见肝细胞凋亡，１２ｈ后以肝细胞坏死为主，小鼠２４ｈ死亡率达５０％。因而，推测凋亡与坏死间存在一定的联系。

超抗原SEA增强PML-RARα多肽体外诱导特异性CTL杀伤活性的机制

目的探讨超抗原SEA体外增强PML-RARα多肽诱导特异性CTL杀伤活性的机制。方法分别将SEA、PML-RARα多肽以及SEA联合PML-RARα多肽与正常人外周血单个核细胞共同培养,利用CCK-8比色法检测诱导后T细胞对NB4和K562细胞株杀伤活性,同时利用流式细胞术测定诱导T细胞表面CD4与CD8表达情况。结果诱导后第20天,SEA能明显增强PML-RARα多肽特异性杀伤NB4细胞株的作用。诱导后第5、10、20天动态检测表明,多肽及SEA联合多肽组CD4+/CD8+比值逐渐降低,其中SEA联合PML-RARα多肽诱导组降低最显著。结论超抗原SEA能明显增强PML-RARα多肽体外诱导特异性CD8+T细胞的增殖与特异性的杀伤作用。

超抗原SEA(D227A)的构建及其免疫活性鉴定

目的 构建SEA(D2 2 7A)基因的原核表达载体 ,并进行表达、分离纯化与免疫活性鉴定。方法 采用PCR技术从产SEA的葡萄球菌标准株中克隆SEA基因 ,通过下游引物上的点突变 ,使SEA基因第 6 80位碱基由A突变为C ,致使SEA成熟蛋白的第 2 2 7位氨基酸残基由天冬氨酸 (GAT)突变为丙氨酸 (GCT) ,构建pGEX SEA(D2 2 7A)重组表达质粒 ,在大肠杆菌DH5α中原核表达 ,再通过淋巴细胞增殖实验对其免疫活性进行测定。结果 构建的SEA(D2 2 7A)基因经测序证实与设计的序列一致 ;成功地构建pGEX SEA(D2 2 7A)重组表达质粒 ,转化感受态大肠杆菌DH5α ,通过IPTG诱导、GSTrapFF柱分离纯化及凝血酶切除GST后 ,得到Mr 为 2 70 0 0的目的蛋白。淋巴细胞增殖实验显示 ,10 0ng mL重组SEA(D2 2 7A)可明显刺激淋巴细胞增殖。结论 成功地构建了SEA(D2 2 7A)基因原核表达载体 ,并在大肠杆菌中得到高效表达 ,所得重组SEA(D2 2 7A)能够刺激淋巴细胞增殖 ,但作用与野生型SEA相比较温和。该结果为寻找有效、毒副作用低的超抗原提供了线索。

超抗原SEA对外周血T细胞的活化作用

目的研究超抗原 SEA对外周血 T淋巴细胞的活化作用。方法用 SEA刺激人外周血 T淋巴细胞 ,观察细胞的 DNA合成、形态、IL - 2的产生、细胞表型以及凋亡情况。结果 SEA对 T淋巴细胞的促增殖作用在浓度为 10 0 ng/m L最强 ,在第 2、3d达高峰 ;首次或多次刺激不改变 T淋巴细胞的 CD4+ CD8+ 表型 ;首次刺激 2 4h内未见明显凋亡 ;但再次刺激 2 4h内即有明显凋亡 ;加入 rh IL - 2 2 d凋亡现象消失。结论超抗原 SEA对 T淋巴细胞的促增殖作用与其浓度、作用时间有关 ,并且SEA首次或多次刺激对 CD4+ T淋巴细胞和 CD8+

超抗原SEA诱导T细胞无能的作用机制探讨

目的 探讨超抗原诱导T细胞无能的分子机制。方法 采用ELISA和FACS ,分别检测超抗原对诱导T细胞无能的过程中 ,IL 2、IL 10的产生和IL 2Rα链 (CD2 5 )的表达 ,并以3 H TdR掺入法 ,测定无能T细胞对rhIL 2、PMA及iono mycin的应答能力。 结果 在诱导T细胞无能的过程中 ,IL 2的产生显著降低 ,而IL 10的产生则逐渐升高 ;CD2 5的表达与活化组相比较无显著差异。rhIL 2的加入可恢复T细胞增殖 ;PMA单独作用能诱导无能T细胞的部分增殖能力 ,但PMA +ionomycin则能更大程度地恢复T细胞的增殖。结论 超抗原SEA对T细胞无能的诱导 ,可能与降低IL 2的水平和升高IL 10的水平有关。超抗原SEA的反复刺激对T细胞无能的诱导 ,可能是干扰了TCR信号途径的近端事件 ,导致Ras/MAPK途径和Ca/calcineurin途径受阻 ,而使IL

超抗原对NK细胞亚群凋亡诱导配体表达与功能的调节

目的研究凋亡诱导配体分子在超抗原活化NK细胞CD56bright亚群和CD56dim亚群上的表达规律和功能。方法以超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素A/B(SEA/B)活化PBMC为模型,应用双重免疫荧光染色和流式细胞术分析,观察不同活化模型中凋亡诱导配体分子在NK细胞CD56bright和CD56dim亚群表达的变化;采用51Cr释放实验及抗体阻断实验,观察NK细胞亚群的功能与凋亡诱导配体分子表达的关系;利用激光共聚焦显微镜,观察凋亡诱导配体分子在NK细胞杀伤相的分布。结果当超抗原浓度为0.1μg/mL时,TRAIL和TNF在NK细胞上的表达率及NK细胞杀伤活性于培养第2天时达到高峰,FasL在NK细胞上表达未见明显变化。TRAIL和TNF分子聚集于NK细胞与靶细胞的接触部位,FasL分布未见明显变化。结论超抗原SEA和SEB促进TRAIL和TNF在CD56dim亚群表达,TRAIL和TNF可能参与NK细胞免疫突触的形成。