转betA基因小黑杨的耐盐性分析及优良转基因株系的选择

在前期获得13个小黑杨转胆碱脱氢酶基因(betA)株系的基础上,选择9个生长正常的转基因株系与非转基因对照,用0、100、140、170、200mmol·L-15种浓度的NaCl处理盆栽苗木,分2、7、12、17、22d取处理材料叶片,测定转基因株系叶片中外源基因的最终合成产物———甜菜碱含量。盐处理60d后,测定苗木高度及转基因株系的盐害指数。结果表明,转基因株系与对照间的甜菜碱含量差异达到极显著水平,9个转基因株系的甜菜碱平均含量超过对照的27.1%;转基因株系的平均盐害指数较对照低15.8%;转基因株系的平均高度超过对照44.1%。综合转基因株系的生长速度,兼顾其耐盐性,初步选择转基因株系T4、T6、T5、T1作为生长速度快耐盐性高的优良株系。

转基因株系及不同水稻品种的几丁质酶活力及纹枯病抗性

对几个转几丁质酶基因的高世代纯合株系及不同抗感品种的几丁质酶活力进行了测定 ,并接菌调查纹枯病抗性 ,结果表明 :转基因可提高水稻对纹枯病的抗性 ,不同转基因系的抗性水平与外源几丁质酶的表达活力一致 ;在内源几丁质酶活力相对较低的情况下 ,转导外源基因可掩盖或抑制内源基因的表达 ;抗 /感品种在接菌诱导后 ,其几丁质酶活力均有所上升 ,并均在接菌 72h左右达到诱导高峰 ,但抗病品种诱导效应和强度要显著得多 ;无论是转基因株系 ,还是不同抗感品种 ,不同空间叶位叶片的几丁质酶活力无明显差异。

玉米ZmERD4基因的分离及转基因株系的获得

为了获得转ZmERD4基因玉米植株,验证ZmERD4在玉米育种中的应用价值,通过同源克隆的方法在抗旱性强的玉米自交系CN165中克隆了ZmERD4基因全长cDNA,该基因全长2 073bp,包含一个编码591个氨基酸的开放阅读框;推导的氨基酸序列和水稻中的OsERD4(XP476646)有82%的相似性,与拟南芥中的AtERD4(BAB63915)有58%的相似性。构建了由花椰菜花叶病毒35S启动子控制下的ZmERD4基因的植物表达载体,并利用农杆菌介导的方法对玉米杂交种Hi-Ⅱ进行了遗传转化,通过双丙氨磷抗性筛选、双丙氨磷抗性基因和ZmERD4基因PCR扩增对转基因后代株系进行了检测,获得了42个转ZmERD4基因株系,转化率为2%,为玉米抗旱育种提供了重要的物质基础。

盐胁迫下8个转基因小黑杨株系的抗逆性比较

以3种转基因(codA、betA、lea)小黑杨(Populus simonii×P.nigra)为材料,选取XC1、XB1、XB2、XB3、XL1、XL5、XL6、XL11共8个株系,非转基因小黑杨为对照,对其进行浓度为0.8%的NaCl胁迫处理,胁迫第6天分别测定叶绿素含量及主要生理指标。结果表明:各转基因株系的平均叶绿素含量高于对照小黑杨的7.9%;POD活性、CAT活性、APX活性都高于对照;膜的损伤程度低于对照;XL1、XL5、XL6、XB4的SOD活性高于对照。总体表现为转基因小黑杨在膜的伤害程度上低于对照,在抗氧化能力上高于对照。

芒果MiCO基因逆境胁迫下表达模式分析及转基因株系的获得

CONSTANS(CO)基因是调控植物开花光周期途径的关键基因,近来有研究发现其与植物的逆境胁迫也有关。目前CO参与植物逆境胁迫的作用尚不清楚。为了探究CO在芒果逆境胁迫中的功能,我们利用实时荧光定量技术对MiCO基因在芒果2℃低温胁迫、盐胁迫和PEG-6000模拟干旱胁迫后0 h、6 h、12 h、24 h、48 h和72 h的表达模式进行分析。结果显示,这三种逆境处理均诱导芒果MiCO基因的表达,其中盐胁迫处理条件下MiCO基因的表达水平上调,2℃低温和PEG胁迫条件下MiCO基因的表达水平下调。说明该基因参与了芒果逆境胁迫的调控。为了验证MiCO基因在芒果逆境胁迫中的功能,本研究构建了MiCO超量表达载体,将MiCO基因转化到拟南芥中,获得阳性植株,经过三代筛选得到了纯合株系,为进一步验证MiCO基因在逆境胁迫中的作用提供实验材料。

转反义trxs基因小麦株系01TY18遗传分析及抗穗发芽特性

以豫麦18为受体导入反义trxs基因获得的株系01TY18(T0)为材料,运用PCR、实时荧光RT-PCR以及离体整穗发芽的方法,对反义trxs基因在转基因小麦中的遗传稳定性、基因表达和抗穗发芽特性进行了研究.结果表明,8个T1代转基因株系中有6个株系目的基因检测呈阳性,且在以后的世代中能够稳定遗传并呈典型的孟德尔单基因3∶1分离规律;反义trxs基因在6个转基因株系中能够正常表达且表现出显著的抗穗发芽特性.与非转基因对照相比,转基因株系穗粒发芽率和穗发芽度平均分别降低62%(P<0.01)和50.8%(P<0.01).

影响转基因苹果试管微嫁接苗成活的因子

以转基因苹果组培苗嘎拉、王林、富士和乔纳金为试材,研究了影响转基因苹果试管微嫁接苗成活的几个因素。结果表明,以继代培养30d左右、生长健壮的组培苗嫁接成活率较高。适当提高嫁接苗所在培养基中BA质量浓度有利于嫁接成活率的提高,其中以MS+BA1.0mg/L+NAA0.05mg/L培养基中嫁接成活率最高。接穗以带2～4片叶片为宜。同时研究发现,不同转基因品种对嫁接成活率影响不显著。

转AtCBF4基因大豆株系的抗旱性评价

干旱胁迫条件下考察转AtCBF4基因大豆株系的光合特性(净光合速率、气孔导度、胞间CO2浓度、蒸腾速率、瞬时水分利用率)、生理特性(脯氨酸、丙二醛、可溶性糖)以及产量性状(株高、节数、单株荚数、单株粒数、百粒重)的表现,综合评价7个株系之间的抗旱性差别。结果表明:转AtCBF4基因大豆叶肉细胞中脯氨酸的含量和可溶性糖含量与受体相比较高,丙二醛含量增幅较小,光合生产能力和产量性状表现优于受体。综合结荚期和鼓粒期表现,所有转基因株系耐旱性均强于非转基因受体,其中HTCB59-5、HTCB59-2和HTCB59-4具有较强的耐旱能力。

转反义trxs基因小麦株系00T89分子鉴定及抗穗发芽特性研究

以皖麦48为受体导入反义trxs基因已获得00T89第4代(T4)转基因株系,对其进行反义基因的PCR鉴定、相对定量RT-PCR基因表达检测以及抗穗发芽特性研究。结果表明,18个T4代转基因株系中,13个株系目的基因检测呈阳性;成熟期籽粒萌发过程中,8个株系转录水平上mRNA丰度极显著降低(P<0·01),mRNA丰度与穗发芽指标呈显著和极显著的相关性(r=0·7181)。其中6个株系在开花后30d至成熟后10d表现出明显的抗穗发芽特性。与非转基因对照相比,平均穗开始发芽时间推迟2·7d(P<0·01),穗粒发芽率和穗发芽度分别降低35·5%(P<0·01)和47·5%(P<0·01),成熟后25d这些株系又逐渐恢复发芽特性,无显著差异(P>0·05)。

转反义trxs基因小麦分子鉴定及抗穗发芽株系的筛选

为给小麦抗穗发芽育种提供基础材料和参考依据,分别以豫麦18、豫麦70和豫麦34为受体,对转反义trxs基因小麦01TY18、01TY70和01TY34高代株系进行PCR分子检测,并对阳性株系进行离体整穗发芽和α-淀粉酶活性测定。结果表明,经PCR检测T7代40个转基因株系中,阳性株系占55%。与非转基因对照相比,转基因株系的穗粒发芽率和α-淀粉酶活性都有所下降,其中有19个株系穗粒发芽率显著低于对照,占阳性转基因株系的86.4%;有16个株系α-淀粉酶活性较对照显著降低,占阳性转基因株系的72.7%。综合PCR检测、穗粒发芽率和α-淀粉酶活性测定结果,共筛选出转反义trxs基因的抗穗发芽小麦株系15个,其中01TY18 8个、01TY70 5个、01TY34 2个,占所有转基因株系的37.5%、阳性转基因株系的68.2%。

抗水稻黑条矮缩病转基因材料的鉴定分析

针对水稻黑条矮缩病毒(RBSDV)的核心粒子外壳蛋白基因(S8)、毒质与非结构蛋白基因(S9)及其嵌合基因(S8&S9)构建了6个RNAi载体,经农杆菌介导转化武陵粳1号获得转基因植株。通过潮霉素溶液浸泡法对转基因植株进行初步筛选,剔除假阳性植株;再通过PCR从DNA水平进行转基因阳性鉴定;进一步通过q RT–PCR从RNA水平进行转基因表达量分析。选取q RT–PCR表达量高的单拷贝纯系S8后代进行灰飞虱传毒试验,结果表明,含有S8 RNAi片段的转基因水稻材料对RBSDV具有一定抗性。

MpCYS4基因对苹果褐斑病病原菌侵染的响应表达及其转化株系抗性鉴定

为探究半胱氨酸蛋白酶抑制剂(cystatin)基因MpCYS4在苹果响应苹果褐斑病病原菌侵染过程中的功能,以苹果矮化砧木M26野生型和MpCYS4过表达株系#1、#3、#4为材料,利用实时荧光定量PCR分析苹果褐斑病病菌侵染后MpCYS4基因在苹果叶片中的表达变化;同时,对转MpCYS4基因苹果叶片的褐斑病抗性进行鉴定,并对MpCYS4融合蛋白进行体外诱导纯化和抑菌活性分析。结果表明,MpCYS4基因的表达受褐斑病侵染诱导,其过量表达提高了苹果叶片对褐斑病的抗性,且经体外纯化的MpCYS4融合蛋白能够有效抑制褐斑病病原菌孢子的萌发和菌丝生长,表现出显著的抑菌活性。本研究结果为进一步探索MPCYS4的生物学功能及其抗病作用机制奠定了基础。

过表达转OsILP基因水稻株系的构建

采用RT-PCR和TA克隆技术,从水稻品种日本晴中扩增出类整合素候选基因(integrin-like protein,ILP)OsILP的cDNA片段。经测序鉴定,克隆获得的目的片段长为1 167 bp,包含完整的CDS,编码388个氨基酸,预测分子量43 ku。进而将该片段连接至表达载体pTCK303中,通过PCR鉴定与酶切验证,结果表明成功构建了pTCK303-OsILP过表达载体。并将表达载体质粒转化为农杆菌EHA105,再通过农杆菌介导将其导入水稻日本晴的愈伤中,经遗传转化,阳性鉴定,获得了过表达转OsILP基因水稻株系。

人源脑红蛋白转基因秀丽线虫的制备、鉴定及生理功能分析

目的以秀丽隐杆线虫为模式生物制备人源脑红蛋白(human neuroglobin,hNgb)转基因线虫,初步探讨外源性hNgb对线虫寿命和产卵率的影响。方法通过显微注射方法制备hNgb转基因线虫,使用蛋白印迹和免疫组织化学进行鉴定。使用野生型N2和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)转基因线虫作为对照组,测量转基因线虫的寿命和产卵率。结果成功获得hNgb转基因株系线虫,其寿命和产卵率与野生型N2和EGFP转基因线虫相比,差异无统计学意义。结论外源性hNgb转基因不影响线虫的发育和正常生理功能,可用于Ngb功能的深入研究。

转胡杨PeDREB2b基因白三叶株系耐盐性研究

以W1-3、W28-2、W33-3等3个转胡杨PeDREB2b基因白三叶(Trifolium repens)株系为材料,非转基因白三叶海发为对照,测定了植株在不同浓度和不同时间盐胁迫下的盐害指数、存活率、叶片相对电导率、植株地上及地下部分Na+、K+含量变化、以及Na^+/K^+,从而评价转基因白三叶株系的耐盐能力。结果表明:1)白三叶"海发"及其转基因的3个株系在不同盐浓度胁迫下30d存活率均为100%。胁迫过程中受害程度随着胁迫浓度增加和时间的延长而加重,高浓度胁迫30d后,株系W33-3的盐害指数达67%,其他株系为40%左右。2)各株系叶片相对电导率随胁迫时间延长呈不同程度的增加趋势,盐胁迫30d后,植株地上及地下部分Na+浓度呈显著升高,K+则呈降低趋势,Na+/K+比升高。3)采用隶属函数法综合分析,白三叶"海发"及其转基因的3个株系耐盐性强弱依次为W1-3>HF>W28-2>W33-3。

杨树UGT198基因的生物信息学分析、基因克隆及功能初探

【目的】研究UGT198基因是否参与调控烟草抗虫性,为未来探索其参与调控杨树抗虫性奠定基础。【方法】前期通过分析公共转录组数据发现PtrUGT198基因在杨树响应虫害的转录组中高调表达,对其进行生物信息学及进化分析。以107杨为材料,克隆UGT198基因,构建过量表达载体,利用农杆菌介导法转化烟草获得过量表达转基因株系。通过棉铃虫饲虫试验初步验证UGT198基因是否参与调控抗虫性,分析UGT198基因在调控抗虫性中发挥的功能。【结果】PtrUGT198基因完整的ORF区为1440 bp,编码479个氨基酸,理论分子量为53.14 kDa,等电点为5.92,编码不稳定疏水性蛋白。PtrUGT198蛋白的二级结构α⁃螺旋占41.75%,β⁃折叠占14.61%,β⁃转角占7.10%,无规卷曲占6.53%。PtrUGT198蛋白不存在跨膜区,预测其不属于膜蛋白,为非分泌性蛋白,该蛋白的磷酸化修饰以丝氨酸为主。同源序列对比结果显示PtrUGT198蛋白的C末端存在高度保守的植物次生产物糖基转移酶(Plant secondary product glycosyltransferase,PSPG)基序。系统进化树分析发现,PtrUGT198蛋白与同属植物毛白杨、银白杨和胡杨亲缘关系最近,其次和模式植物烟草有较近的亲缘关系。成功克隆杨树UGT198基因,构建pNC⁃UGT198基因过量表达载体,并转化烟草获得过量表达转基因株系,进行饲虫实验,得到高表达量烟草相对抗虫。【结论】首次成功克隆了UGT198基因,并初步解析其调控抗虫性的功能,为深入了解UGT198基因调控杨树抗虫机理提供参考价值。

转基因耐旱棉花研制成功

中科院新疆生态与地理研究所张道远课题组通过从耐旱灌木白花柽柳中克隆得到TaMnSOD基因，并利用转基因技术将其遗传性状转化到新疆主栽棉花品种，获得了4代转基因株系。形态及生理生化检测证实，转基因株系具备更强的抗旱性。相关成果已发表于《分子育种》杂志。

我国培育出抗旱性更强的转基因棉花

据2014年4月28日《中国科学报》报道，中科院新疆生态与地理研究所张道远课题组，从耐旱灌木白花柽柳中利用克隆技术获得了名为TaMnSOD的抗旱基因，并利用转基因技术将其遗传基因转化到新疆主栽棉花品种，获得T4代转基因株系。形态和生理生化检测证实，转基因株系具备更强的抗旱性，为抗旱棉花新品种的培育提供了分子生物学资料。相关成果发表于《分子育种》杂志。

转GsPPCK1基因苜蓿植株的获得及其耐碱性分析

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶激酶(phosphoenolpyruvate carboxylase kinase,PPCK)是一种钙不依赖的丝氨酸/苏氨酸(Ser/Thr)类蛋白激酶,参与碳氮代谢等多个生物学过程,然而其在碱胁迫反应中的作用尚未见报道。本研究在前期野生大豆碱胁迫基因表达谱数据基础上,采用同源克隆的方法分离野生大豆(Glycine soja)PPCK1基因,该基因编码的氨基酸序列与大豆(Glycine max)PPCK1蛋白(AAQ83695.1)具有99%的相似性,被命名为GsPPCK1。在50mmolL–1NaHCO3胁迫处理3h内,根和叶中GsPPCK1基因上调表达,属碱胁迫早期应答基因。通过农杆菌介导法对肇东苜蓿进行遗传转化,并对RT-PCR阳性的超表达转基因株系进行耐碱性分析,在100mmolL–1NaHCO3处理15d后转基因株系生长状态良好,而非转基因对照株系明显萎蔫、失绿、甚至死亡;转基因株系的丙二醛含量和相对质膜透性显著低于非转基因株系(P<0.05),而叶绿素含量和根系活力显著高于非转基因对照(P<0.05),说明超量表达GsPPCK1基因增强了苜蓿的耐碱能力。以上结果表明,GsPPCK1参于植物耐碱胁迫反应过程,在碱胁迫基因工程研究领域具有良好的理论和实际应用意义。