我国未批准的转基因油菜MS11品系双重数字PCR精准定量检测方法建立

随着转基因产品在农产品国际贸易中的比重不断增加,因混杂少量目的国未批准品系而引发的低水平混杂事件日益凸显。为了应对低含量转基因成分的精准定量检测需求,针对我国未批准、国际上已经商业化种植的转基因油菜MS11品系,建立了双重数字PCR定量检测方法。对5套不同油菜内源基因与MS11品系检测引物探针组合进行筛选,选出相互抑制效应低、反应效率高、内源基因单拷贝、数字PCR阳性微滴单元与阴性微滴单元区分明显的引物探针组合。后对PCR反应退火温度、引物探针浓度等进行优化。在筛选出适宜的引物探针组合,以及优化后的反应条件基础上,对反应体系的特异性、可重复性和定量精密度、灵敏度、定量准确性等进行测试。筛选和优化结果表明,油菜内源基因PEP与MS11品系引物探针组合在退火温度为58℃,引物探针比为1.5∶1.0时,反应效率最高。方法特异于转基因油菜MS11品系检测,在其他转基因作物品系和非转基因作物中无显著扩增。从10拷贝/μL到8000拷贝/μL 3个数量级的DNA模板各重复间测定绝对拷贝数和百分比含量的相对标准偏差均在可接受范围内,可重复性和定量精确度高。方法的检测下限低至2拷贝/μL,定量下限为10拷贝/μL基因组DNA。对10%、2.0%、0.5%和0.1%4个MS11品系成分含量样品定量结果表明,测定值与设定值间的偏差(bias)均在±25%之间,定量准确性高。结论表明,建立的转基因油菜MS11品系双重数字PCR精准定量方法适用于对低含量MS11品系成分的精、准定量,可以满足口岸对低水平混杂问题的应对需求。

抗草丁膦和抗草甘膦转基因油菜的抗性基因向野芥菜的流动

通过人工去雄授粉和田间隔行种植试验,研究了抗草丁膦和抗草甘膦转基因油菜(Brassica napus)中的bar基因和EPSPS基因向野芥菜(B.juncea var.gracilis)流动的可能性。结果表明在人工授粉的情况下,以野芥菜为母本,分别以两种转基因油菜为父本,亲和性指数都很高,达13以上,与野芥菜自交或开放授粉条件下的亲和性指数没有明显差异,说明两种转基因油菜和野芥菜的亲和性较好。经两次除草剂筛选,人工杂交获得的所有F1对相应的除草剂都表现出了明显的抗性,且经PCR检测扩增出了各自的特异性条带,说明人工杂交获得的所有F1都携带了相应的抗性基因。F1的适合度研究表明,两种F1种子萌发率和母本都没有明显差异,营养生长明显好于母本。但花粉活力和结实率明显下降,携带抗草丁膦基因F1的花粉活力和每角果粒数分别是32.4%和0.59粒,携带抗草甘膦基因F1的花粉活力和每角果粒数分别是35.1%和0.58粒。经两次除草剂筛选和PCR检测,表明野芥菜和抗草丁膦油菜或与抗草甘膦油菜田间隔行种植分别能产生0.02%和0.014%的携带抗性基因的F1杂种。以上结果表明抗除草剂转基因油菜的抗性基因具有向野芥菜流动的可能性,且bar和EPSPS基因向野芥菜流动的可能性类似,但对其可能引起的环境后果需要做进一步地深入研究。

野芥菜向抗除草剂转基因油菜基因流动的研究

采用人工授粉的方法,分别以转基因抗草丁膦和抗草甘膦油菜为母本,野芥菜为父本,研究野芥菜的基因流动到转基因油菜中的可能性。结果表明,野芥菜和抗草丁膦及抗草甘膦油菜的亲和性指数明显低于其自交授粉的亲和性指数,只有0.44和0.54。经除草剂筛选和PCR检测证明,所有F1都携带了相应的抗性基因并表现出对相应除草剂的抗性。对F1的适合度研究表明,两种F1种子萌发率及营养生长情况和野芥菜没有明显差异,但结实明显下降,携带抗草丁膦基因的F1和携带抗草甘膦基因的F1每个角果饱满种子粒数分别是0.50和0.61。分别以两种F1为母本,野芥菜为父本进行回交,结实仍然很低,携带抗草丁膦基因的F1和携带抗草甘膦基因的F1与野芥菜回交每个角果饱满种子粒数分别只有0.35和0.33。上述结果表明,野芥菜基因流动到两种抗性油菜的可能性均比较小。

抗除草剂转基因油菜与野芥菜的抗性回交3代子3代的适合度

【目的】抗除草剂转基因油菜(Brassica napus,AACC,2n=38)的抗性基因一旦成功漂移到近缘杂草中,将会给农田杂草防除带来很大的困难。转基因油菜的近缘杂草野芥菜(wild B.juncea,AABB,2n=36)广泛分布于中国西部地区并沿长江流域扩散,因此有必要深入研究抗除草剂转基因油菜与野芥菜回交后代的适合度,为抗性基因是否能成功漂移到近缘杂草中提供试验依据。【方法】在田间以不同密度(低密度为15株/区,高密度为30株/区)单种和混种(野芥菜与回交后代以4﹕1、3﹕2、1﹕1比例混种)野芥菜及抗性回交3代子3代(抗草甘膦转基因油菜及抗草丁膦转基因油菜与野芥菜的抗性正反回交3代子3代分别表示为BC_3mF_4R、BC3p F4R和BC_3mF_4L、BC_3pF_4L,m表示以野芥菜为母本的回交后代,p表示以野芥菜为父本的回交后代),测定抗性正反回交3代子3代的营养生长(株高、茎粗、一次分枝数、地上部单株干生物量)和生殖生长(单株有效角果数、单株种子质量、角果长、每角果饱粒数)的适合度成分,并比较供试回交后代的总适合度与野芥菜的差异。【结果】在单种条件下,BC_3mF_4R和BC_3pF_4R的各适合度成分及总适合度均与野芥菜无显著差异;尽管在高密度下BC_3mF_4L和BC3p F4L的茎粗、地上部单株干生物量和单株有效角果数显著低于野芥菜,但BC_3mF_4L和BC_3pF_4L的总适合度仍与野芥菜无显著差异;因此,在单种条件下,抗草甘膦或抗草丁膦的回交3代子3代在低密度和高密度均具有与野芥菜相当的总适合度。当回交后代与野芥菜混种时,在低密度3种比例混种下,抗草甘膦和抗草丁膦的回交3代子3代的总适合度与野芥菜无显著差异;在高密度3种比例混种下,BC_3 F_4R与野芥菜的各适合度成分及总适合度无显著差异,但BC_3 F_4L的株高、茎粗、一次分枝数、地上部单株干生物量、单株有效角果数、单株种子质量及总适合度均显著低于野芥菜。相关性分析结果表明,BC_3 F_4的各适合度成分仅与种植密度相关。【结论】抗草甘膦或抗草丁膦的正反回交3代子3代都具有在野外生存定植的可能性,且抗草甘膦的回交3代子3代比抗草丁膦的回交3代子3代的可能性更大。因此,在防范转基因油菜的基因逃逸时不仅要防范转基因油菜与近缘杂草的初始杂交,而且要防范杂交后代与近缘杂草的不断回交,以免产生适合度较高的回交后代。

油菜的遗传转化及抗溴苯腈转基因油菜的获得

以油菜(Brassica napus L.)的下胚轴和子叶为转化受体,建立了油菜的高效转化系统。在此基础上,将抗除草剂溴苯腈基因(bxn基因)导入油菜,获得了抗溴苯腈转基因油菜。分子检测实验证明,转基因油菜中含有bxn基因。转基因油菜可抗高达10^(-3)mol/L的溴苯腈。

转基因油菜筛查检测策略研究

根据收集到的国内外已商业化转基因油菜品种的基因元件信息,构建了油菜转基因检测分子特征矩阵,在分析基因元件使用频率的基础上,建立了转基因油菜的筛查检测策略。研究发现,利用P-CaMV35S、P-FMV35S和bar这三个元件组合,对现有转基因油菜品种的筛查检出率可达100%。将P-CaMV35S、P-FMV35S、bar、CP4-EPSPS、PAT和T-NOS组合,每个转化事件可检出至少两次,增加了检测的可靠性。同时,分析了不同转化事件中同名基因元件的序列差异,进一步验证了分子特征矩阵筛查方法的可行性。

RNAi沉默转基因油菜fad2基因表达的种子特异性分析

为研究RNAi沉默转基因油菜fad2基因表达的效果及其器官特异性,实时荧光定量PCR法分析比较了转基因油菜W-4与非转基因对照Westar开花后第7天、第14天、第21天、第28天的种子以及越冬期油菜根、茎、叶器官中的fad2基因的相对表达量。结果显示:对照Westsr种子中fad2基因的相对表达量随开花后的天数呈逐渐增加的趋势,但W-4种子中fad2基因的相对表达量在开花后第21天、第28天较对照Westar显著下降,降幅达到60%。说明转基因油菜W-4在种子发育过程中表达的fad2基因的dsRNA干扰了fad2基因表达。W-4与Westar在越冬期根、茎、叶器官中fad2基因的相对表达量基本一致,无显著性差异。脂肪酸组成分析结果显示:W-4种子中油酸平均含量达到81.5%较Westar增加了近15%,而多不饱和脂肪酸平均含量为5.25%,较Westar下降了近70%;但根、茎、叶中的脂肪酸含量二者无显著差异;结果表明转基因油菜中RNAi干扰fad2基因表达具有种子特异性,不干扰其它器官的fad2基因表达。研究还发现转基因油菜fad2基因表达下降的时期与napin基因表达时期同步,均始于开花后21d左右,表明目标基因的表达受napin启动子的准确控制。

从亲和性及F_1的适合度评价抗除草剂转基因油菜向不同种群野芥菜的基因漂移风险

[目的]了解抗除草剂转基因油菜（Brassica napus）向不同种群野芥菜（wild B.juncea）漂移的可能性,为抗除草剂转基因油菜的安全性评估提供依据。[方法]以抗草甘膦和抗草丁膦转基因油菜为父本,17个种群野芥菜为母本,研究人工授粉条件下的结实能力和抗性基因的传递频率及F1在温室（套袋自交）和田间（开放授粉）的适合度;统计F1后代的出苗率及抗性基因的传递频率。[结果]供试的野芥菜授2种转基因油菜花粉后每角饱粒数大于8粒;获得的F1植株对相应除草剂都具有抗性;温室和田间种植后营养生长良好;温室条件下自交不结实;田间种植后单株有效角果数、角果长及每角饱粒数均显著低于各自的亲本野芥菜,单株有效角果35.42~147.00个,每角饱粒数0.19~0.78;绝大多数F1的总适合度和各自的亲本野芥菜无显著差异。各F1后代种子都有20%以上正常出苗,且有8.33%~77.78%的后代表达对相应除草剂的抗性。[结论]2种抗除草剂转基因油菜的抗性基因具有相似的向各种群野芥菜漂移的可能性。在我国释放转基因油菜务必防范向野芥菜的基因漂移。

Bt杀虫蛋白基因在转基因油菜中的动态表达与其抗虫性研究

采用ELISA方法检测Bt杀虫基因在转基因油菜植株中的表达。试验结果表明 :在第 3至第 9叶期Bt杀虫蛋白基因在转基因油菜植株中稳定、高效地表达 ,Bt杀虫蛋白的表达量为 170ng/ 2 5mg～ 2 6 0ng/ 2 5mg鲜叶 ,占植物可溶性蛋白的 0 .0 6 7%～ 0 .10 5 % ,其抗虫效果高达 42 .5 %～ 80 .0 %。但从第 11叶期后Bt杀虫蛋白表达量显著地降低 ,只有 7ng/ 2 5mg～ 5 0ng/ 2 5mg鲜叶 ,占植物可溶性蛋白的 0 .0 0 3%～ 0 .0 2 %。

抗草甘膦转基因油菜与野芥菜回交3代子1代和子2代的适合度研究

[目的]携带抗性基因回交后代的适合度是抗除草剂转基因作物的抗性基因能否成功逃逸到野生近缘种的重要依据。本文研究抗草甘膦转基因油菜与野芥菜的回交3代子1代(BC_3F_2)和子2代(BC_3F_3)在田间条件下的适合度,为转基因油菜基因漂移的生态风险评估提供有价值的参考。[方法]以野芥菜、抗草甘膦转基因油菜与野芥菜的BC_3F_2和BC3F3为材料,研究在低密度(每区15株)和高密度(每区30株)单种及不同种植比例(野芥菜、回交后代的混种比例分别为4∶1、3∶2和1∶1)混种条件下,野芥菜与BC_3F_2和BC_3F_3的总适合度。[结果]单种条件下,BC_3F_2的总适合度均与野芥菜无显著性差异。混种条件下,种植比例为4∶1时,BC_3F_2在2种密度下的总适合度均显著低于野芥菜;在混种比例为3∶2和1∶1条件下,BC_3F_2在低密度条件下的总适合度与野芥菜相当,而在高密度下的总适合度显著低于野芥菜。BC_3F_3在各种种植条件下的总适合度均与野芥菜无显著差异。[结论]BC_3F_2的总适合度受种植密度和比例的影响,在低密度3∶2和1∶1混种比例下的总适合度与野芥菜相当;BC_3F_3的总适合度不受种植密度和比例的影响。抗草甘膦转基因油菜与野芥菜的BC_3F_2和BC_3F_3都具有在野外生存定植的可能性,且BC3F3定植的可能性较BC_3F_2更大。因此在防范转基因油菜基因逃逸的策略上,除防范初始杂交发生外,也应该防范回交后代的产生。

转基因油菜的基因流及生态风险

综合评述了转基因油菜的基因流及其生态风险.油菜作为最早的转基因作物之一目前已在加拿大和澳大利亚大面积商业化应用.(常)异花授粉作物油菜的天然异交率可达30%左右,也易与其它芸苔属作物杂交,因此转基因油菜的生态风险已引起各国科学家的高度重视.转基因油菜主要通过与其野生近缘种的花粉交换和与非转基因油菜的花粉交换两种方式进行花粉的输出.基因可能逃逸到相关野生近缘种,但在大田环境下能够得到杂种的可能性很小;由于基因的漂流在油菜田块间确实存在,因此在种植转基因油菜的过程中必须考虑其间隔距离.

转基因油菜筛查阳性质粒分子的研制及应用

【目的】转基因油菜是四大转基因作物之一,是中国转基因生物安全监管的重要对象,转基因检测为转基因安全监管提供技术支撑。转基因筛查是转基因检测的第一步,筛查靶标设置不合理会导致漏检部分转基因成分。建立转基因油菜筛查策略,并研制与筛查策略配套的阳性质粒分子,将为中国的转基因油菜安全监管提供强有力的技术支撑。【方法】通过收集数据库中登记的转基因油菜品种的外源基因元件信息,分析转基因油菜品种中常用的调控元件和标记基因,基于最大筛查覆盖率原则,确定转基因油菜的筛查靶标。通过检索数据库或查询专利,收集筛查元件的核苷酸序列。一个筛查元件通常有多个标准方法,查阅各筛查元件的检测标准,分析各标准中普通PCR引物对和实时荧光PCR引物/探针组合在筛查元件核苷酸序列中的位置,根据引物探针的结合位点,确定拟构建到质粒上的各筛查元件的核苷酸序列。人工合成各筛查元件和油菜内标基因的融合序列,克隆到常用质粒pUC18,构建阳性质粒分子。采用各筛查元件的普通PCR和实时荧光PCR方法,评估阳性质粒分子的适用性。【结果】建立了转基因油菜的筛查策略,通过检测CaMV 35S启动子、FMV 35S启动子、Bar、PAT、CP4-EPSPS、NPTⅡ、HPT、NOS终止子和PinⅡ终止子共9个基因元件,可实现已知信息转基因油菜品种的全覆盖。构建出聚合9个筛查元件和2个油菜内标基因HMG I/Y和CruA的转基因油菜筛查质粒分子pYCSC-1905。9个筛查元件和2个油菜内标基因的扩增效率均在90%—110%,证明质粒分子上的不同靶标序列没有相互干扰,影响PCR的扩增效率。质粒分子pYCSC-1905可用作9个筛查元件和2个油菜内标基因的通用阳性对照,适用于国家标准(GB/T和农业农村部公告)、出入境检验检疫行业标准(SN/T)和欧盟标准。【结论】提出的转基因油菜筛查策略涵盖9个基因元件,可实现从商业化到安全评价各阶段转基因油菜的筛查检测,显著降低转基因油菜的筛查漏检率。研制的配套质粒分子pYCSC-1905为转基因油菜筛查和各基因元件标准方法的应用提供了通用标准样品,保证检测机构间检测数据的准确性和可比性。

转基因油菜与野芥菜混作对土壤线虫群落的影响

随着转基因作物在全球的广泛种植,转基因作物对非靶标生物的影响受到人们的广泛关注。转Bt基因抗虫作物与非转基因作物种间混作是避免昆虫产生抗性的一种生态防御策略,但混作对非靶标生物尤其是土壤线虫影响研究较少。设置不同比例的转基因油菜(Brassica napus)与野芥菜(B.juncea)混作5种处理,包括处理A、B、C、D、E分别为转基因油菜和野芥菜比例0∶100;25∶75;50∶50;75∶25;100∶0,调查不同生育期土壤线虫种类与数量变化。结果表明,在油菜与野芥菜生育期内,不同处理线虫优势类群均为拟丽突属Acrobeloides和真滑刃属Aphelenchus,各处理线虫属数由多到少顺序为处理B(30属)>处理C(28属)>处理A(26属)>处理D和处理E(25属)。线虫生活史策略(c-p值)组成一致,各处理间线虫生活史组成不存在明显差异。不同处理的线虫总数以及各营养类群均无显著差异,线虫群落生态指数亦无显著差异,但不同采样时期间线虫ShannonWiener多样性指数、Simpson优势度指数、均匀度指数、成熟度指数和线虫通路指数差异显著。结果表明转基因油菜与野芥菜单作和混作短期内不影响土壤线虫群落结构。

优化反向PCR法分离转基因油菜外源T-DNA侧翼序列的研究

[目的]优化反向PCR(IPCR)条件分离油菜转基因外源T-DNA的侧翼序列。[方法]以单拷贝的转基因油菜FS4为研究材料,用改良CTAB法提取转基因油菜总DNA,并进行酶切、纯化、自连接,再通过两轮巢式PCR扩增,进行序列对比。[结果]两轮巢式PCR扩增得到1个大小为4.0kb的片段,其序列与油菜数据库中BH652424和BZ044084两序列同源性分别高达97.8%和63.4%。根据序列比对结果设计特异引物对进行PCR验证的结果,也证明了FS4转基因油菜中T-DNA的确插入在该位点。[结论]优化后的IPCR条件能成功分离油菜转基因外源T-DNA的侧翼序列。

转基因油菜籽中重金属铅、镉、铜、铬、铁含量的测定

本实验对抗除草剂品种的转基因油菜籽进行湿法消解预处理,处理液采用石墨炉和火焰原子吸收光谱法进行检测,测定重金属铅、镉、铜、铬、铁的含量,并做加标回收实验。按照相同方法处理非转基因油菜籽,并测定其重金属的含量,通过比较,发现该品种的转基因油菜籽与非转基因油菜籽中这五种重金属的含量没有明显差别。

抗草丁膦转基因油菜与野芥菜的抗性回交3代子1代和子2代的适合度

如果抗除草剂转基因油菜的抗性基因渗入到野芥菜中,会给野芥菜的防除带来很大困难。因此在抗除草剂转基因油菜环境释放前对抗性基因向野芥菜的渗入开展深入的研究非常必要。以抗草丁膦转基因油菜与野芥菜的携带抗性基因回交3代子1代和子2代(BC3m F2和BC3p F2及BC3m F3和BC3p F3,m表示以野芥菜为母本的回交后代,p表示以野芥菜为父本的回交后代)为材料,在田间条件下研究了它们在不同密度(低密度为15株/区,高密度为30株/区)及不同种植比例(单种,野芥菜与回交后代以4∶1、3∶2、1∶1混种)时的适合度成分和总适合度。结果表明,无论是低密度还是高密度条件下,单种时BC3F2和BC3F3的总适合度均与野芥菜无显著差异。低密度混种时,在4∶1和3∶2下,只有BC3m F3的总适合度与野芥菜无显著差异,其余各后代的总适合度均显著小于野芥菜;以1∶1混种时,只有BC3m F2和BC3m F3的总适合度与野芥菜无显著差异。高密度混种时,3个比例混种下4种供试回交后代的总适合度均显著小于野芥菜。相关性分析结果表明,BC3m F3的各适合度成分都与混种比例不相关。表明携带抗性基因的BC3F2和BC3F3在野外都具有生存定植的可能性,且BC3m F3定植的可能性较其他供试回交后代更大。因此在防范转基因油菜基因逃逸的策略上,在防范初始杂交发生的同时,也应该防范回交后代的产生。

外源基因在转基因油菜后代中的表达及遗传学分析

以转基因油菜后代 ( R1 和 R2 代 )株系为材料 ,系统地研究了苏云金杆菌杀虫蛋白基因Cry A和选择标记基因 npt 导入油菜后的遗传规律、表达强度和抗虫效应 .结果表明 :R1 代卡那霉素抗性为 3∶ 1分离方式 ,在 R2 代卡那霉素抗性植株中 ,有三分之一为 npt 基因纯合型( T∶ T) ,另三分之二为杂合型 ( T∶O) ,其遗传方式符合孟德尔单因子显性遗传 ;转化植株可耐受1 50 mg/ L那卡霉素的选择压力 ;约一半的转化植株具有杀虫或抑虫效力 ,幼虫校正死亡率最高可达 78% .

转基因油菜抗旱、抗寒及休眠能力的比较

以3个转基因油菜品系及3个对照品种为材料,在大田条件下比较研究了转基因油菜与非转基因对照苗期的抗旱能力、抗寒能力及其种子在大田土壤中的休眠能力。结果表明,转基因油菜与非转基因对照苗期都有较好的抗旱能力、抗寒能力,两者之间无显著性差异。在埋入土壤表层(3cm)与深层(20cm)条件下,转基因与非转基因对照种子之间的萌发率差异均不显著。

转基因油菜的外源Barstar基因向近缘种的转移研究

在人工杂交与田间自然授粉两种条件下,研究了转Barstar基因油菜T742向非转基因油菜、其他芸薹属、十字花科植物和杂草的基因转移情况.结果表明,转基因油菜与周围非转基因油菜和新疆野生油菜杂交能产生一定数量的种子,经PPT抗性与PCR检测,其中部分种子含有Barstar基因,而与其他十字花科植物或杂草杂交不能得到杂种;基因转移受到母本类型的影响,转基因油菜T742与3种类型油菜的杂交亲合率从高到低为甘蓝型、白菜型、芥菜型.可见转基因油菜的外源Barstar基因可向周围非转基因油菜和新疆野生油菜进行转移,而很难向其他十字花科植物或杂草转移.

转基因油菜雄性不育系15A结实性的研究

本研究以转基因油菜雄性不育系15 A为材料,采用自交,异交,天然异交研究了3种不同授粉方式的结实性表现,采用隔离制种方式研究了不同行比制种对结实性的影响,采用不同辅助授粉方式研究了辅助授粉对结实性的影响。结果表明:15 A自交结实为0,不育性彻底。异交和天然异交结实好,有利于杂交制种。隔离制种父母本1∶5行比的情况下,母本的结实正常,单株产量高。3种人工辅助方式对15 A的结实性没有明显的影响。