102例HIV-1感染者病毒株反转录酶基因多态性及耐药性变异研究

目的:目前中国未接受或已接受反转录酶抑制剂(RTI)治疗的HIV感染者的HIV反转录酶基因类型的数据较少。本研究探讨了HIV-1反转录酶的基因多态性,及在RTI选择性压力下出现的已知和未知变异位点。方法:分析研究21例未接受治疗及81例接受RTI治疗的HIV感染者的RT基因。大部分感染者(>80%)应用司他夫定(d4T)+地达诺新(ddI)+奈韦拉平(NVP)或d4T+拉米夫定(3TC)+依菲韦仑(EFV)三联HAART治疗方案。结果:在未接受治疗的患者中,发现了4个高度多态性位点(122、200、207和211)。在接受RTI治疗的患者中,发现了2种耐药相关变异(RAMs):①接受ddI+d4T+NVP治疗方案的患者中发现,K65R(9.8%)、L74V(7.4%)、M184V(7.4%)、Q151M(5%)和胸腺嘧啶类似物变异(TAMs)(9.3%),包括T215Y(5.5%);②接受d4T+3TC+EFV治疗方案的患者中发现,T215Y(23%)、M184V(20%)和TAMs(15.4%)。在所有病例中,非核苷反转录酶抑制剂(NNRTI)RAM的出现率很高(41.9%),而在142、221、224和228位点发现了4种可疑的新RAMs。结论:目前中国非核苷类反转录酶抑制剂(NNRTI)耐药相关变异十分普遍,本研究描述了RTI选择性变异的基因模式,提出了新的一些变异与RTI治疗的相关性。

金丝桃素与乙基金丝桃素的全合成及对人免疫缺陷病毒逆转录酶的抑制活性

金丝桃素与乙基金丝桃素的全合成及对人免疫缺陷病毒逆转录酶的抑制活性赵晶张致平陈鸿珊陈湘红（中国医学科学院医药生物技术研究所，北京１０００５０）近年发现由贯叶金丝桃（Ｈｙｐｅｒｉｃｕｍｐｅｒｚｏｒａｔｕｍ），三棱三叶金丝桃（Ｈ．ｔｒｉｑｕｅｔｒｉｆ...

火龙果Ty3-gypsy类反转录转座子反转录酶序列的克隆及分析

【目的】克隆Ty3-gypsy类反转录转座子反转录酶(RT)序列并分析其特性,为火龙果遗传变异和进化研究提供新的信息。【方法】根据Ty3-gypsy类反转录转座子RT保守区设计简并引物,从红肉和白肉火龙果及其突变体中扩增出430 bp左右的目标片段,回收、克隆、测序获得RT序列,并进行生物信息学分析;采用RT-PCR检测其转录活性。【结果】共获得82条RT序列,其中有55条序列发生终止密码子突变,5条序列发生移码突变;经RT序列对比,火龙果与水稻、拟南芥有较高的同源性;3条RT序列具有转录活性。【结论】火龙果Ty3-gypsy类反转录转座子RT序列具有高度异质性,部分序列具有转录活性,与其他物种存在反转录转座子的横向传递。

人端粒酶反转录酶和绿色荧光蛋白融合基因慢病毒表达载体的构建

背景:外源性端粒酶反转录酶的表达可重建端粒酶活性,诱导细胞永生化。目的:采用慢病毒载体作为基因转移载体,克隆人端粒酶反转录酶的编码区全序列,同时选用绿色荧光蛋白作为目的基因表达标志物,构建人端粒酶反转录酶慢病毒表达载体。设计、时间及地点:开放性实验,单一样本观察,于2007-06/2008-03在暨南大学生物工程研究所及暨南大学附属第一医院中心实验室完成。材料:pBABE-puro-hTERT质粒由Robert Weinberg教授惠赠,质粒pDONR221,pLenti6/V5-DEST,ccdBSurvival,Stbl3及293FT细胞由暨南大学生物工程研究所提供。方法:以pBABE-puro-hTERT质粒为模板聚合酶链反应法获取目的基因人端粒酶反转录酶(包含酶切位点BglⅡ、HindⅢ),通过BP反应克隆至pDONR221,以质粒pEGFP-N1为模板,以聚合酶链反应法获取目的基因增强型绿色荧光蛋白(包含酶切位点HindⅢ,BgⅢ),通过酶切及连接反应形成pDONR221-hTERT-EGFP。采用LR重组酶将pDONR221-hTERT-EGFP和pLenti6/V5-DEST进行重组反应,形成pLenti6/V5-DEST-hTERT-EGFP。将pLenti6/V5-DEST-hTERT-EGFP与包装质粒混合,利用脂质体共转染293FT细胞。主要观察指标:通过酶切、聚合酶链式反应及测序验证重组质粒pDONR221-hTERT-EGFP和pLenti6/V5-DEST-hTERT-EGFP是否构建成功。包装重组慢病毒,应用荧光显微镜观察报告基因绿色荧光蛋白在293FT细胞中的表达情况。结果:测序发现慢病毒入门载体pDONR221包含目的基因hTERT1547位点存在点突变(原碱基A变成G),通过定点突变技术成功诱变并鉴定慢病毒表达载体pLenti6/V5-DEST-hTERT-EGFP成功构建。转染后的293FT细胞在荧光显微镜下观察可见强绿色荧光。结论:实验成功构建了人端粒酶反转录酶和绿色荧光蛋白融合基因的慢病毒表达载体,为人端粒酶反转录酶稳定转染提供快速、简洁的方法。

人参总RNA提取方法及反转录酶的比较

为了探索人参根、叶片总RNA的提取方法,以多年生人参根、叶片为材料,比较7种提取方法的总RNA质量。结果表明:除改良CTAB法对人参根总RNA的提取效果不明显,其余方法均能从人参根、叶片中提取、分离到总RNA,其中RNAPure高纯总RNA快速提取试剂盒法能提取到完整性较好、纯度较高的总RNA,琼脂糖凝胶电泳显示的条带清晰完整,根中RNA的D260 nm/D280 nm为1.87,RNA浓度为351.8 ng/μL;用Reverse Transcriptase M-MLV(RNase H-)试剂盒、Prime Script Reverse Transcriptase试剂盒、Go ScriptTMReverse Transcription System试剂盒对提取的总RNA进行反转录,其中用Go ScriptTMReverse Transcription System试剂盒反转录后进行PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳条带较亮,证明转录效果较好。经反转录、PCR证明,提取的总RNA适用于后续的分子试验研究。

miR-1182调控胃癌细胞人端粒酶反转录酶的分子机制及其对迁移能力的影响

目的研究miR-1182在胃癌细胞中调控人端粒酶反转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)的机制及对其迁移能力的影响。方法胃癌细胞MKN28中转染miR-1182类似物,qRT-PCR检测转染后细胞miR-1182的相对表达量,Western blot检测转染后细胞hTERT的表达变化;进一步通过生物信息学预测miR-1182与hTERT mRNA的结合位点,双荧光素酶实验分析miR-1182对hTERT mRNA的作用机制;Transwell实验检测转染miR-1182类似物对MKN28细胞体外迁移能力的影响。结果 qRT-PCR表明miR-1182组的miR-1182的相对表达量(10.168±2.645)明显高于对照组(1.008±0.167)(P<0.01)。Western blot结果显示在胃癌细胞系中过表达miR-1182后,hTERT的蛋白水平下调。双荧光素酶实验表明miR-1182可与hTERT mRNA的ORF区结合,且其主要结合部位为hTERT mRNA的ORF-1;在Transwell迁移实验中,miR-1182类似物转染细胞后,miR-1182组穿膜细胞数为(23.333±4.509)/视野,对照组穿膜细胞数为(71.000±4.582)/视野,miR-1182组细胞迁移能力明显低于对照组(P<0.01)。结论 miR-1182通过与胃癌细胞hTERT的ORF区结合,从而在转录后水平抑制hTERT的表达,并发现其可抑制胃癌细胞的迁移能力。

端粒酶反转录酶活化与p53金属蛋白酶-9表达对非小细胞肺癌发生的影响

目的探讨人端粒酶反转录酶(hTERT)、p53、金属蛋白酶-9(MMP-9)与非小细胞肺癌(NSCLC)发生的内在联系及其作用。方法应用原位杂交、HE及免疫组织化学技术对104例NSCLC组织进行检测,探讨NSCLC发生的分子机制及诊断的可能性。结果(1)hTERT mRNA、p53、MMP-9在NSCLC中均有较高的表达,阳性率分别为73.08%,69.23%,84.62%。(2)hTERT mRNA在鳞癌中表达为64.71%,腺癌中为88.89%(2χ=6.997,P<0.01)。(3)p53与hTERT mRNA阳性表达呈正相关性(r=0.651,P<0.05),二者的阳性共表达为53.85%,一致性表达为65.40%。p53与MMP阳性表达呈正相关性(r=0.477,P<0.05),二者的阳性共表达为53.85%,一致性表达为53.85%。hTERT mRNA与MMP-9阳性表达呈正相关性(r=0.671,P<0.01),二者阳性共表达率为71.15%,一致性表达率为75.00%。结论p53、hTERT mRNA、MMP-9具有协同促进NSCLC发生的作用;hTERT mRNA的表达与NSCLC的类型有关。

不同发育阶段人表皮干细胞端粒酶反转录酶表达的比较

目的:目前已知端粒酶活性的丧失及其增殖相关基因表达的改变是造成多种成体干细胞体外复制和扩增受限的主要原因,而端粒酶反转录酶对端粒酶活性起关键作用。体外分离培养人胚胎、少儿、成人3种不同皮肤来源的表皮干细胞,对比观察不同发育阶段端粒酶反转录酶表达的差异。方法:实验于2005-09/2007-04在南昌大学第一附属医院烧伤研究所完成。①对象:因创伤等原因致意外流产的妊娠24～26周龄胎儿皮肤标本,4～12周岁少儿及25～45岁成年人烧伤整形植皮手术剩余皮片标本,分别由南昌大学第一附属医院产科、烧伤科提供,产妇与烧伤患者对治疗及实验均知情同意,实验经医院医学伦理委员会批准。②实验方法:取胎儿、少儿和成年人的全层皮肤,用胰蛋白酶和EDTA联合消化法分离表皮,胶原快速贴附法纯化人表皮干细胞,用未黏附的角质细胞作为对照,以含表皮生长因子、角质细胞无血清培养液组成的表皮干细胞培养基进行体外培养。③实验评估:通过β_1整合素、角蛋白19、p63免疫细胞化学染色对培养细胞进行鉴定,计算克隆形成率。以免疫细胞化学染色法和图像定量分析法检测3种不同皮肤来源的表皮干细胞端粒酶反转录酶的表达差异。结果:①细胞生长特征:分离培养的人表皮干细胞呈明显克隆性生长,克隆形成率高于角质细胞对照组(P<0.05)。②表皮干细胞的鉴定:细胞克隆经免疫细胞化学染色后,β_1整合素、角蛋白19、p63均呈阳性表达。③端粒酶反转录酶免疫细胞化学染色及定量表达:不同皮肤来源的表皮干细胞端粒酶反转录酶均呈阳性,但表达强度不同,人胚胎>少儿>成人。3种皮肤来源的表皮干细胞平均吸光度值和阳性面积值均随年龄增加而逐渐降低,人胚胎>少儿>成人(P<0.05)。结论:人胚胎、少儿、成人皮肤来源的表皮干细胞均有端粒酶反转录酶表达,其表达强度依次减弱。提示诱导和增强端粒酶反转录酶的表达对维持表皮干细胞在体外自我更新和增殖能力可能具有重要意义。

RNA干扰端粒酶反转录酶基因慢病毒表达载体的构建及鉴定

背景:端粒酶反转录酶(telomerase reverse transcriptase,TERT)对端粒酶活化起重要作用,但利用构建针对其基因的慢病毒抑制其在脊髓星形胶质细胞中的表达却少有报道。目的:构建用于RNA干扰的靶向大鼠脊髓源星形胶质细胞端粒酶反转录酶基因的慢病毒载体,并观察其对端粒酶反转录酶表达的抑制作用。方法:通过设计合成出shRNA-TERT序列,经聚合酶链反应扩增后定向连接到pLentilox3.7U6载体上构建重组质粒,经转染DH5α细胞筛选阳性菌落后行测序鉴定。将pLentilox3.7U6-TERT重组质粒转染293T细胞,包装产生重组慢病毒Le-TERT并测定其滴度,再用Le-TERT感染大鼠脊髓星形胶质细胞,实时定量-聚合酶链反应检测各细胞株TERT基因表达水平,并利用Western blot和免疫荧光分别检测TERT蛋白的表达。结果与结论:基因测序鉴定证明,pLentilox3.7U6-TERT重组质粒构建成功,并成功包装慢病毒。实时定量PCR、Western blot和免疫荧光检测结果表明,Le-TERT转染星形胶质细胞4 d后,对TERT mRNA的干扰效率可达(63.98±2.6)%,Le-TERT在转然后的星形胶质细胞中呈低表达。结果证实,实验构建的重组表达载体pLentilox3.7U6-TERT能够产生有效滴度的慢病毒,感染大鼠脊髓星形胶质细胞后,该载体可以有效抑制TERT的表达。

人端粒酶反转录酶基因诱导人永生化成骨细胞的生物学特性

目的:研究反转录病毒(hTERT)基因诱导的人永生化成骨细胞系Clone5的生物学特性,包括增殖能力、细胞周期和是否恶性变。方法:收集30～31代Clone5和6～7代人成骨细胞(hOB),绘制两种细胞的生长曲线并用流式细胞仪检测细胞周期特征,软琼脂集落实验和裸鼠致瘤实验检测Clone5是否恶性变。结果:由生长曲线计算出细胞倍增时间:hOB:190h;Clone5:62h;曲线显示Clone5的增殖能力明显增强;流式细胞仪检测发现,Clone5细胞周期中G1期细胞占53.46%,S期细胞占28.24%,凋亡率为0.76%,hOBG1期细胞占79.81%,S期细胞占19.76%,凋亡率为33.33%。和hOB相比,Clone5G1期细胞比例减少,S期比例增加,细胞的凋亡率显著降低;软琼脂集落实验未见细胞团形成,裸鼠接种不致瘤。结论:转导hTERT基因的Clone5增殖能力明显增强,凋亡率降低,且未发生恶性变,可用做组织工程的种子细胞和研究正常骨生理、生化的工具细胞。

再谈乙型肝炎病毒反转录酶区/表面抗原区基因变异的临床发生特点及意义

在我国,拉米夫定(LAM)、阿德福韦酯(ADV)和恩替卡韦(ETV)长期广泛用于临床抗乙型肝炎病毒(HBV)治疗,导致恩替卡韦耐药患者累积增加,耐药变异形式复杂多样,其挽救治疗也成了临床关注的重点问题。HBV聚合酶/反转录酶(RT)区/表面抗原(HBsAg)S区基因重叠,核苷(酸)类似物引起的耐药变异可同时造成S区基因变异,其中rt A181T变异可同时引起sW172终止突变,形成截短型HBsAg,影响疾病进展;rt A181T有时还可引起sW172非终止变异,其临床发生特点和意义尚不明确;HBsAg阴转是慢性乙型肝炎功能性治愈的重要标志,但临床上有少数患者可同时检出血清HBsAg和HBs Ab阳性,其意义与机制尚未完全明确。我们的研究发现,发生在HBsAg主要亲水区(MHR)的免疫逃逸相关变异多见于隐匿性HBV感染患者和HBsAg/HBs Ab双阳性的HBV感染患者,其中如发生新增N-糖基化变异,则进展为肝细胞癌的风险显著增加;从患者分离的免疫逃逸变异株可显著降低HBsAg的抗原性和反应性。上述研究有助于深入认识HBV RT/S基因变异发生的临床特点、机制和意义,帮助临床合理制定抗病毒治疗方案,预测疾病进展风险。

榄香烯乳对胃癌细胞人端粒酶反转录酶及其启动子的影响

目的:观察榄香烯乳对胃癌细胞株SGC7901人端粒酶反转录酶(hTERT)表达及其启动子的影响,以深入了解榄香烯乳的抗癌机制。方法:以榄香烯乳处理胃癌细胞,分别采用实时定量PCR和免疫荧光标记法检测癌细胞hTERT mRNA和蛋白水平的表达。采用脂质体转染法将携带hTERT启动子和报告基因的质粒转染至胃癌细胞株SGC7901细胞中,2 h后加入不同浓度的榄香烯乳,孵育48 h后,分别检测其报告基因萤虫素酶活性。结果:榄香烯乳处理后,胃癌SGC7901细胞hTERT mRNA和蛋白水平呈浓度和时间依赖性下调。榄香烯乳处理组萤虫素酶活性下降,且呈浓度依赖性。结论:榄香烯乳可能通过下调hTERT启动子活性,抑制hTERT表达,从而抑制胃癌细胞端粒酶活性。

辛伐他汀对颅内动脉瘤大鼠端粒长度、端粒酶反转录酶及端粒重复序列结合因子2基因表达的影响

目的探讨辛伐他汀对颅内动脉瘤(IA)大鼠端粒长度、端粒酶反转录酶(TERT)和端粒重复序列结合因子2(TRF2)基因表达的影响。方法将36只SD大鼠分为对照组、模型组和辛伐他汀组,每组12只。对模型组及辛伐他丁组的大鼠切除双侧卵巢并结扎左侧颈总动脉及双侧肾动脉后支以构建IA模型,对照组仅暴露相应组织及血管后缝合。建模后模型组和辛伐他汀组分别给予生理盐水及辛伐他汀灌胃。于建模后4个月,测定各组大鼠外周血白细胞端粒相对长度、TERT和TRF2 mRNA的相对表达量。结果建模后4个月,模型组和辛伐他汀组各有8只大鼠形成IA,对照组无大鼠形成IA;对照组、辛伐他汀组和模型组大鼠的端粒相对长度依次缩短(P<0.05),而对照组、模型组和辛伐他汀组TRF2 mRNA相对表达量依次升高(P<0.05);模型组和辛伐他汀组的TERT mRNA相对表达量低于对照组(P<0.05),但两组间比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论 IA大鼠可能由于端粒酶活性降低而发生端粒长度缩短,辛伐他汀可通过促进TRF2的表达而发挥保护端粒作用。

人端粒酶反转录酶小发夹RNA质粒表达载体的构建及鉴定

背景:端粒酶反转录酶是端粒酶的活性亚基,已成为肿瘤研究的热点。RNA干扰技术作为一种基因沉默方法,具有高效、特异等优点,现已广泛应用于肿瘤、病毒等研究领域。目的:构建针对人端粒酶反转录酶的小发夹RNA质粒表达载体,并观察其对乳腺癌T47D细胞人端粒酶反转录酶基因的表达和端粒酶活性的影响。方法:以Genbank中人端粒酶反转录酶基因的mRNA序列为基础,设计人端粒酶反转录酶基因的小干扰RNA序列,将其连接到具有G418抗性的质粒pBAsi-hU6-Neo(BamHⅠ/HindⅢ)中,应用基因测序加以验证,扩增提取质粒,以脂质体转染表达小发夹RNA的质粒到乳腺癌T47D细胞,抗生素G418筛选出转染成功的各组细胞。结果与结论:实验所构建的人端粒酶反转录酶的小发夹RNA质粒表达载体,经测序验证无误。将pBAsi-hU6-Neo重组质粒转染入T47D细胞,经G418筛选获得了转染成功的细胞。经RT-PCR和Western blot检测,转染后的人端粒酶反转录酶基因在mRNA和蛋白水平的表达均明显降低(P<0.01),经TRAP-ELISA法检测实验组细胞端粒酶活性出现显著下降(P<0.01)。结果证实,实验成功构建人端粒酶反转录酶的小发夹RNA质粒表达载体,实验所设计的小干扰RNA能有效抑制肿瘤细胞人端粒酶反转录酶基因的表达,进而降低细胞的端粒酶活性。

胃癌患者外周血人端粒酶反转录酶 基质金属蛋白酶-7 mRNA的表达及临床意义

目的应用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)法检测胃癌患者外周血中人端粒酶反转录酶(HTERT)及基质金属蛋白酶(MMP)-7mRNA的表达情况,探讨其对监测胃癌血液微转移的临床意义及其对预后的影响。方法采用Trizol法提取血液标本中的总RNA,将其反转录成cDNA,然后用RT-PCR技术检测血液标本中MMP-7mRNA和HTERTmRNA表达,计算样本的△Ct值。结果 126例胃癌患者中,HTERTmRNA阳性58例,阴性68例。MMP-7mRNA阳性46例,阴性80例。不同性别、年龄、分化程度的胃癌患者外周血HTERT、MMP-7mRNA阳性率差异无统计学意义。Ⅲ、Ⅳ期患者外周血HTERTmRNA阳性率较Ⅰ、Ⅱ期患者明显增高,差异有统计学意义。有远处转移的胃癌患者较无远处转移的患者外周血HTERT、MMP-7mRNA阳性率明显增高,差异有统计学意义。癌胚抗原阳性患者外周血HTERT、MMP-7mRNA阳性率较癌胚抗原阴性的患者明显增高,差异有统计学意义。无远处转移的胃癌患者中,HTERT、MMP-7阳性与阴性患者复发转移情况比较,检测后6、12个月HTERT阳性组较阴性组肿瘤复发转移率显著增高,差异有统计学意义。检测后12个月MMP-7阳性组较阴性组肿瘤复发转移率增高,差异有统计学意义。结论胃癌患者外周血HTERT及MMP-7mRNA表达对早期发现血液微转移及预后具有重要意义,值得进一步研究。

HIV-1非核苷类反转录酶仰制剂依非韦伦

依非韦伦是一种新型的HIV-1反转录酶抑制剂,该药与核苷类反转录酶抑制剂或蛋白酶抑制剂联合用于艾滋病治疗。本文阐述依非韦伦的作用机制、药动学特点、不良反应、耐药性及有关临床研究结果。

人端粒酶逆转录酶基因RNAi表达载体的构建、鉴定

目的构建端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的RNA干扰(RNAi)表达载体。方法化学合成能编码针对hTERT基因的短发夹RNA(shRNA)序列的寡核苷酸,退火处理后克隆到pSilencer1.0-U6 shRNA表达载体的U6RNA聚合酶Ⅲ(PolⅢ)启动子的下游,构建重组RNAi质粒pSliencer-hTERT。结果经酶切电泳及测序分析证实,目的序列成功插入到预计位点。结论已成功构建pSliencer-hTERT载体,为进一步研究其对端粒酶活性的抑制作用打下基础。

妊娠期肝内胆汁淤积症患者胎盘线粒体呼吸链酶活性和端粒酶反转录酶改变的研究

目的研究胎盘滋养细胞线粒体呼吸链酶活性及端粒酶反转录酶(hTERT)的表达与妊娠期肝内胆汁淤积症(ICP)的关系。方法选取27例ICP患者(ICP组)及18例正常孕妇(对照组),采用酶组织化学法分析各组胎盘滋养细胞中线粒体呼吸链酶活性,采用免疫组织化学方法检测各组胎盘滋养细胞中hTERT的表达情况,采用实时荧光定量聚合酶链反应定量检测各组胎盘中hTERTmRNA的表达情况。结果细胞色素c氧化酶、三磷酸腺苷酶和琥珀酸脱氢酶在ICP组(包括ICP轻度亚组及ICP重度亚组)和对照组胎盘滋养细胞中的表达均呈阳性,ICP组上述酶活性均显著低于对照组(P值分别<0.05、0.01)。hTERT在ICP组(112.67±41.40)、ICP轻度亚组(109.56±42.66)及ICP重度亚组(118.89±40.46)胎盘滋养细胞中的表达水平均显著高于对照组(29.06±14.30,P值均<0.05)。ICP轻度亚组与ICP重度亚组间的线粒体呼吸链酶活性和hTERT表达水平的差异均无统计学意义(P值均>0.05)。ICP组、ICP轻度亚组、ICP重度亚组及对照组hTERTmRNA的表达水平分别为3.10±0.12、3.32±0.13、2.66±0.22、2.76±0.08,18srRNA的表达水平分别为0.09±0.11、0.13±0.14、0.23±0.24、0.10±0.11,各组间hTERTmRNA和18srRNA表达水平的差异均无统计学意义(P值均>0.05)。结论 ICP患者胎盘绒毛受损,滋养细胞线粒体呼吸链酶活性下降,hTERT蛋白表达的增加无法弥补增多的细胞凋亡,机体失代偿,导致胎盘功能下降,这可能是ICP胎儿宫内缺氧的一种发生机制。

人端粒酶反转录酶启动子的克隆与肿瘤靶向治疗的研究

目的克隆hTERT启动子,并观察hTERT启动子调控下tk/GCV系统对人肺癌细胞系A549的特异性杀伤效果。方法设计特异性引物,以HepG2基因组DNA为模板,用PCR方法扩增hTERT启动子;分别构建hTERT启动子和hCMV启动子调控的LacZ、tk基因真核表达载体;将上述质粒用脂质体转染A549细胞和人胚肺成纤维细胞系MRC5后,通过RT-PCR和β-Gal染色观察hTERT启动子工作情况;用MTT法检测不同浓度的GCV对A549和MRC5细胞的细胞毒作用。结果成功克隆hTERT上游-280bp^+40bp的核心启动子。RT-PCR和β-Gal染色显示hTERT启动子能有效地调控其下游tk基因、LacZ基因在端粒酶阳性的肿瘤细胞中特异性转录和表达;hTERT启动子调控的tk/GCV系统对端粒酶阳性的肿瘤细胞系A549有明显的特异性杀伤效应。结论hTERT启动子可特异性地调控目的基因在端粒酶阳性的肿瘤细胞中表达而不影响正常的细胞,表明端粒酶启动子调控自杀基因的表达是一种很有希望的肿瘤靶向基因治疗策略。

人端粒酶反转录酶和脆性组氨酸三联体基因在口腔鳞癌中的表达及意义

端粒酶被认为是迄今为止最具有人体肿瘤特异性和敏感性的分子标志物,人端粒酶反转录酶（human telomerase reverse transcriptase,hTRT）是端粒酶活性的限速酶,只在端粒酶阳性的肿瘤细胞和永生化细胞中表达,与端粒酶活性平行相关[1]。脆性组氨酸三联体基因（fragile histidine triad,FHIT）是1996年发现的一种抑癌基因,