人LIGHT和HSV-TK-EGFP基因共转染的MSCs抗肿瘤免疫的体内研究

目的研究与单纯疱疹病毒的糖蛋白D竞争结合单纯疱疹病毒进入介导物(herpes virus entry mediator,HVEM)的淋巴毒素类似物(homologous to lymphotoxins,exhibits inducible expression,and competes with HSV glycoprotein D for HVEM,a receptor expressed by T lymphocytes,LIGHT)基因和单纯疱疹病毒胸苷激酶(herpes simplex virus thymidine kinase,HSV-TK)基因共转染的骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)在体内的抗肿瘤免疫功能。方法将pIRES2-LIGHT基因和HSV-TK-EGFP基因共转染小鼠骨髓间充质干细胞(MSCs/LT组),以转染空载体和转染HSV-TK-EGFP基因的骨髓间充质干细胞作对照。流式细胞仪检测LIGHT分子和HSV-TK-EGFP分子在稳定转染的骨髓间充质干细胞上的表达。体内迁移实验观察MSCs/LT在小鼠体内迁移情况。观察更昔洛韦注射前后MSCs/LT对荷瘤小鼠体内肿瘤的治疗作用。ELISA法检测小鼠肿瘤组织中IFN-γ,IL-2和IL-10的水平。结果流式细胞仪检测发现,MSCs/LT能稳定高表达LIGHT分子。MSCs/LT有特异地向肿瘤组织趋化的特性。MSCs/LT和MSCs/T有较好的抑制肿瘤生长的能力,但在更昔洛韦诱导后,MSCs/LT的抗肿瘤效应下降甚至消失。同时,MSCs/LT可促使T细胞进入肿瘤组织,并促进T细胞分泌IL-2、IFN-γ,抑制IL-10分泌(P<0.05)。结论共转染人LIGHT和HSV-TK-EGFP基因的骨髓间充质干细胞能稳定高表达LIGHT分子,能特异性地向荷瘤小鼠体内肿瘤组织趋化并抑制肿瘤的生长,这种体内抗肿瘤功能可能与促进T淋巴细胞IL-2、IFN-γ等细胞因子的分泌,改善局部免疫抑制环境有关。

NT3基因转染对噪声性耳聋的影响研究

目的验证阳离子脂质体介导神经营养因子3(Neurotrophin-3,NT3)基因转染对噪声致豚鼠耳聋的保护作用。方法选取广西医科大学动物实验中心提供的60只健康花色黑目豚鼠为研究对象,按随机数字表法分为5组,每组12只(实验过程中部分动物死亡,实际实验数据按每组10只统计)。Ⅰ组未受噪声影响,Ⅱ组注入人工外淋巴液未受噪声刺激,Ⅲ组注入人工外淋巴液后受噪声刺激,Ⅳ组在注入空质粒后受噪声刺激,V组在注入含NT3基因的质粒后受噪声刺激。噪声为4 kHz的稳态白噪声,强度100 dB,8 h/d,连续10 d,休息5 d,再通过听性脑干反应(Auditory Brain-Stem Response,ABR)测试和免疫组织化学染色来评估听阈变化和耳蜗螺旋神经节细胞中NT3蛋白的表达情况。结果V组ABR阈值高于Ⅰ、Ⅱ组,但低于Ⅲ、Ⅳ组,差异有统计学意义(P均<0.05)。耳蜗螺旋神经节细胞处NT3蛋白表达量以V组较其余各组更高,差异有统计学意义(P均<0.05)。结论NT3基因转染后阈值增幅减小,听功能受损有一定程度减轻,对噪声致豚鼠耳聋具有一定程度的保护作用。

研究生实验教学中细胞转染技术结合斑点免疫印迹技术的实验探索

在研究生组织及细胞培养实验教学中,细胞转染技术是一个重要的组成部分,以往实验方案使用携带荧光蛋白GFP基因的质粒转染细胞后,可使用荧光显微镜进行观察定性分析转染是否成功并粗略计算转染效率,但对于没有荧光标记的细胞转染结果分析检测方法在教学上尚有欠缺。本实验针对这个问题,在检测方法中加入斑点免疫印迹技术,并对实验方案及分析方法进行了探索,以便于学生掌握更全面的细胞生物学分析技术。

不同转染方法应用于体细胞转基因效率的研究

试验旨在比较不同转染方法介导绿色荧光蛋白(EGFP)基因转染猪不同体细胞的效果。原代分离培养来源于猪脂肪和骨髓的两种间充质干细及成纤维细胞,含有EGFP的质粒分别通过脂质体、罗氏转染试剂和电穿孔法转入猪3种体细胞中,使用倒置荧光显微镜观察EGFP的表达,并通过血细胞计数法分析细胞相对存活率,流式细胞仪检测细胞转染效率。结果表明,3种方法转染不同体细胞48 h均有绿色荧光蛋白的表达。在不同方法转染相同体细胞的比较中,细胞存活率从高到低依次为罗氏转染试剂>脂质体>电穿孔法,罗氏转染试剂和脂质体转染后的细胞存活率显著高于电穿孔法(P<0.05),转染效率从高到低依次为电穿孔法>罗氏转染试剂>脂质体,电穿孔法的转染效率明显高于罗氏和脂质体转染试剂,同时罗氏转染试剂的转染效率显著高于脂质体(P<0.05)。采用相同方法转染不同体细胞的比较中,3种体细胞在相同方法转染后的存活率无显著性差异(P>0.05),电穿孔法转染间充质干细胞的效率均显著高于成纤维细胞(P<0.05);罗氏转染试剂和脂质体分别转染3种体细胞的效率无显著性差异(P>0.05)。3种方法均可用于转染猪体细胞,综合考虑转染效率和细胞存活率,电穿孔法的转染效果最好,可用于转染细胞状态较佳的细胞,其次为罗氏转染试剂。

鲤上皮瘤细胞两种转染试剂的条件优化及应用

鲤上皮瘤细胞是常用的鱼类细胞系,广泛使用在各种病毒学和基因功能研究中。利用细胞转染技术在鲤上皮瘤细胞进行基因功能研究时,转染试剂和DNA的剂量以及取样时间没有统一的数据支持。为解决该问题,选取两种常用转染试剂Lipofectamine®2000和FuGENE®HD,分别对荧光蛋白标记的多种质粒进行多配组转染试验,多温度、多时间节点追踪记录转染效率。28℃,以35 mm培养皿铺板,16μL Lipofectamine®2000和4μg DNA在转染后48 h达到最高转染效率(5.92±0.52)%;12μL FuGENE®HD和4μg DNA在转染72 h后转染效率达到(9.81±0.33)%。为验证该条件,构建一个鲤高不饱和脂肪酸合成相关转录因子过氧化物酶体增殖物激活受体蛋白α(PPARα)的EGFP标签载体,该载体利用两种转染试剂分别获得了约4%和约8%的转染效率。以实时荧光定量PCR检测该转录因子对下游脂肪酸去饱和酶2(fads2)基因的转录调控效应,虽然两种转染试剂本身可导致下游基因的上调,但与空载质粒组相比,两种转染试剂高表达转录因子均对下游靶基因产生了转录激活效应。本试验获得了常用转染试剂Lipofectamine®2000和FuGENE®HD在鲤上皮瘤细胞细胞转染时的最适转染试剂和DNA剂量和最优取样时间,并在一转录调控实例中进行了验证,试验结果为后续充分利用鲤上皮瘤细胞进行基因功能研究提供了数据支持,有助于更好地服务于渔业种质资源育种创新。

成年小鼠心肌细胞腺病毒转染及缺氧/复氧诱导损伤模型的建立

目的 采用非Langendorff方法分离成年小鼠心肌细胞(adult mouse cardiomyocytes, AMCMs),并建立腺病毒转染及缺氧/复氧诱导细胞损伤模型,为应用AMCMs进行心肌缺血体外实验的研究提供便捷、实用、可操作性强的系统方法。方法 应用非Langendorff方法分离AMCMs,观察贴壁后2、24、48及72 h细胞的形态,计算存活率,并应用α-actinin免疫荧光染色观察AMCMs完整性;应用腺病毒转染AMCMs,观察并统计转染36、48 h后的转染效率;通过缺氧45 min/复氧24 h,进行碘化丙啶(propidium iodide, PI)染色,统计PI阳性细胞率以明确缺氧/复氧损伤模型的建立。结果 与AMCMs贴壁后2 h相比,贴壁后24和48 h的细胞存活率无显著下降,贴壁后72 h的细胞存活率显著下降;AMCMs细胞结构完整,可进行腺病毒转染,36和48 h转染效率分别可达82.07%±0.60%和82.84%±1.18%;缺氧/复氧诱导AMCMs可成功建立细胞损伤模型,PI染色阳性细胞达42.28%±3.10%。结论 本研究应用非Langendorff方法分离培养的AMCMs,细胞存活率高,并建立腺病毒转染和缺氧/复氧诱导细胞损伤模型,为体外建立AMCMs基因修饰、缺氧/复氧损伤模型提供了简单易行的系统方法。

高纯度RBP4抗体的制备及在水动力转染小鼠肝癌模型中的应用

目的:制备高纯度视黄醇结合蛋白4(RBP4)单克隆抗体并应用其检测高压水动力转染小鼠肝癌模型中RBP4的表达水平。方法:将RBP4重组蛋白表达菌株培养并诱导表达,使用AKTA系统纯化蛋白,通过杂交瘤的方式制备高纯度RBP4单克隆抗体;将7周龄SPF级C57BL/6J小鼠随机分为实验组和对照组,每组6只,雌雄各半,利用高压水动力转染法联合SB11转座子系统与CRISPR/Cas9系统构建实验组小鼠肝癌模型;将RBP4单克隆抗体应用于免疫组化法检测小鼠肝癌组织中RBP4的表达水平。结果:成功获得纯度95%以上的重组RBP4蛋白,制备RBP4单克隆抗体过程中杂交瘤细胞融合率60%,最终获得3株阳性单克隆细胞株,经纯化获得高效价(1∶243 000)、高纯度(96.77%)单克隆抗体。成功建立高压水动力转染小鼠肝癌模型,实验组肝癌发生率100%,肝脏呈现典型肝癌病理特征,对照未出现肝癌。利用制备的RBP4单克隆抗体进行免疫组化检测,发现实验组肝癌组织中RBP4表达水平显著低于对照组(P<0.001)。结论:本研究制备的RBP4单克隆抗体具有高效价和高纯度特点,RBP4蛋白表达水平在高压水动力转染小鼠肝癌组织中明显降低,RBP4与肝癌发生和发展的关系值得进一步研究。

基因递送中阳离子脂质体结构对转染效率及细胞毒性的影响研究进展

阳离子脂质体在基因治疗和基因沉默领域被广泛应用,其数量繁多,结构多样,有优化和改善基因递送行为的功能,随着基因治疗研究的逐渐深入,新型阳离子脂质体也被不断开发。阳离子脂质体主要有4个组成部分,即亲水的阳离子头部、疏水的脂质尾部、连接键以及辅助脂质,每个部分的结构对基因递送中阳离子脂质的转染效率和细胞毒性具有重要影响。可电离阳离子脂质细胞毒性较低,已有产品上市。本综述可为阳离子脂质体的设计提供一个概念框架,为阳离子脂质体的选择提供一定理论支持。

胞质分裂作用因子4过表达慢病毒载体的构建和稳定转染Neuro-2a细胞的建立

目的:构建胞质分裂作用因子4(DOCK4)过表达慢病毒载体,建立DOCK4稳定过表达的Neuro-2a细胞。方法:在美国国家生物信息中心(NCBI)查找DOCK4的序列并设计合成引物,采用聚合酶链式反应(PCR)法扩增获取DOCK4基因序列,通过Bam HⅠ和AgeⅠ限制性内切酶酶切后,将其与酶切后的慢病毒载体GV492进行连接,构建GV492-DOCK4过表达重组质粒,PCR法鉴定筛选出与目的基因片段长度大小相近的阳性克隆。将GV492-对照质粒和GV492-DOCK4过表达重组质粒分别转染至HEK293T细胞中,转染48 h后收集慢病毒进行包装并测定病毒滴度。将Neuro-2a细胞分为GV492-对照组和GV492-DOCK4组,分别采用GV492-对照组慢病毒和GV492-DOCK4过表达慢病毒感染Neuro-2a细胞,慢病毒感染复数(MOI)为100,感染72 h后采用嘌呤霉素(10 mg·L^(-1))筛选出成功感染GV492-对照组慢病毒和GV492-DOCK4过表达慢病毒的Neuro-2a细胞,荧光显微镜观察各组Neuro-2a细胞生长状态及绿色荧光蛋白表达情况;采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法和Western blotting法检测各组Neuro-2a细胞中DOCK4 mRNA和DOCK4蛋白表达水平。结果:PCR检测,GV492-DOCK4过表达重组质粒的基因片段长度约为691 bp,测序结果显示GV492-DOCK4过表达重组质粒基因序列与设计合成的DOCK4过表达序列一致;GV492-对照组和GV492-DOCK4过表达组慢病毒的滴度分别为2.5×10^(8) TU·mL^(-1)和2.5×10^(8) TU·mL^(-1);荧光显微镜观察,各组Neuro-2a细胞生长状态良好且存在绿色荧光蛋白表达;RT-qPCR法检测,与GV492-对照组比较,GV492-DOCK4组Neuro-2a细胞中DOCK4 mRNA表达水平明显升高(P<0.01);Western blotting法检测,各组细胞在相对分子质量225000附近出现特异性条带,与GV492-对照组比较,GV492-DOCK4组Neuro-2a细胞中DOCK4蛋白表达水平明显升高(P<0.01)。结论:本研究成功构建DOCK4过表达慢病毒载体,建立了稳定过表达DOCK4的Neuro-2a细胞。

EIF4A3 shRNA慢病毒载体的构建及其稳定转染细胞系的建立

目的:构建真核细胞翻译起始因子4A3(EIF4A3)-短发夹RNA(shRNA)慢病毒载体,建立Neuro-2a-EIF4A3-shRNA稳定转染细胞系。方法:通过美国国家生物技术信息中心(NCBI)数据库检索EIF4A3基因序列,设计并合成PCR鉴定引物,并将其连接至经EcoRⅠ和AgeⅠ酶切的慢病毒GV493载体,构建GV493-EIF4A3-shRNA慢病毒质粒,PCR筛选阳性克隆并测序鉴定。将GV493空载质粒和GV493-EIF4A3-shRNA重组质粒分别转染至HEK293T细胞中,分别为GV493对照慢病毒和GV493-EIF4A3-shRNA慢病毒,转染48 h后收集慢病毒进行包装并测定病毒滴度。将Neuro-2a细胞分为空白组、GV493对照组和GV493-EIF4A3 shRNA组,空白组不作处理,GV493对照组和GV493-EIF4A3 shRNA组分别采用相应慢病毒感染Neuro-2a细胞,慢病毒感染复数(MOI)为100,使用10 mg·L-1嘌呤霉素筛选成功感染慢病毒的Neuro-2a细胞,荧光显微镜观察各组Neuro-2a细胞的生长状态和绿色荧光表达情况;实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法和Western blotting法检测各组Neuro-2a细胞中EIF4A3 mRNA及蛋白表达水平。结果:PCR测序结果显示GV493-EIF4A3-shRNA重组质粒基因序列与设计合成的EIF4A3-shRNA序列一致,成功构建GV493-EIF4A3慢病毒载体。荧光显微镜观察可见HEK293T细胞荧光表达强烈,生长状态良好,慢病毒包装成功。GV493-对照慢病毒和GV493-EIF4A3-shRNA慢病毒的滴度均为2×10~8 TU·mL^(-1),GV493对照组和GV493-EIF4A3 shRNA组Neuro-2a细胞生长状态良好且表达绿色荧光,表明慢病毒感染稳定细胞系构建成功。RT-qPCR法,与空白组和GV493对照组比较,GV493-EIF4A3shRNA组Neuro-2a细胞EIF4A3mRNA表达水平明显降低(P<0.01)。Western blotting法,各组在相对分子质量49000处出现特异性条带,提示Neuro-2a细胞中EIF4A3蛋白表达成功;与空白组和GV493对照组比较,GV493-EIF4A3 shRNA组Neuro-2a细胞中EIF4A3蛋白表达水平明显降低(P<0.01)。结论:成功构建GV493-EIF4A3-shRNA慢病毒载体,建立了Neuro-2a-EIF4A3-shRNA稳定转染细胞系,为EIF4A3在颅内动脉粥样硬化的作用机制研究提供了参考。

利用不同方法将小分子NADPH转染进入细胞的比较

目的利用非代谢途径直接将外源小分子烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)转染进入细胞内的方法。方法对比3种不同转染试剂(X-tremeGENE TM HP DNA、Lipofectamine TM RNAiMAX和Lipofectamine TM 2000)将NADPH转染到人骨肉瘤细胞系U2OS和小鼠胚胎成纤维细胞系3T3L1中的效果,并通过油红O染色比较它们对脂肪细胞分化的影响。结果用X-tremeGENE HP DNA转染试剂转染NADPH可以有效提高细胞内NADPH水平(P<0.001)。随着NADPH转染浓度(10μmol/L NADPH与10μL转染试剂)的增加,细胞中的NADPH水平呈剂量依赖性增加。此外使用3种转染试剂在3T3L1前脂肪细胞中转染NADPH,只有使用X-tremeGENE HP DNA转染试剂转染NADPH的脂肪细胞分化更明显(P<0.001)。结论X-tremeGENE HP DNA转染试剂能够成功地将外源NADPH转染进入细胞内,并促进3T3L1脂肪细胞的分化和脂质积累。

GPx6过表达慢病毒载体和稳定转染细胞系的构建

为了建立稳定表达谷胱甘肽过氧化物酶6(Glutathione peroxidase 6,GPx6)的真核表达细胞系,对GPx6进行基因克隆,构建慢病毒表达载体,建立表达猪源GPx6的CHO-K1细胞系.根据NCBI数据库中的猪GPx6基因的c DNA序列,利用Primer5设计PCR扩增引物.在猪附睾组织中克隆出6His-GPx6基因,构建含有6His-GPx6的慢病毒过表达载体,利用三质粒包装系统进行慢病毒包装,慢病毒侵染CHO-K1细胞,进一步筛选获得阳性单克隆细胞系,通过免疫荧光、蛋白印迹和实时荧光定量确定目的基因表达效果.试验成功克隆出6His-GPx6基因,构建了含有6His标签的GPx6过表达慢病毒载体,并成功获得了含有GPx6的CHO-K1细胞系.为下一步研究GPx6在猪繁殖力的提高和精液稀释液添加剂的应用提供新思路.

人成纤维细胞稳定转染的方法比较

目的采用3种不同的方法将质粒pEGFP-N1转染人成纤维细胞,从中寻找最佳的稳定转染的方法。方法分别采用阳离子聚合物转染、阳离子脂质体转染和电转染方法,将能表达G418抗性蛋白和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的质粒pEGFP-N1转染人成纤维细胞。24h后,荧光显微镜下观察EGFP表达,流式细胞术测定瞬时转染率;通过G418筛选得到稳定转染的细胞。结果电转染有最高的瞬时转染效率(56.8%),稳定转染得到的阳性克隆最多,且从细胞筛选到扩增至得到阳性大克隆所用的时间也最少(约20d);用阳离子聚合物瞬时转染率低(1.7%),稳定筛选同样可以得到阳性大克隆,但是数量很少且从细胞筛选到扩增至阳性大克隆所用的时间也最多(约30d);阳离子脂质体转染效果居中,瞬时转染率为39.9%,从细胞筛选到扩增至得到阳性大克隆所用的时间约25d。结论用电转染法将质粒pEGFP-N1转染人成纤维细胞是最佳的转染方法。

柠檬酸铁铵对悬浮HEK293细胞转染的影响机制探究

基于聚乙烯亚胺(polyethyleneimine,PEI)的悬浮人胚胎肾细胞(human embryonic kidney 293 cells,HEK293)转染技术前景广阔,但培养基组分会影响转染效率。简单的离心换液存在污染风险,且影响细胞状态。探究抑制转染效率的关键组分对转染过程的影响机制,有利于从根本上解决该问题。首先通过探究培养基中对转染效率具有潜在影响的组分确定关键组分柠檬酸铁铵(ferric ammonium citrate,FAC)的抑制作用,然后通过考察柠檬酸铁铵添加对细胞状态、PEI与DNA形成的复合物(PEI-DNA complex,PEI-DNA复合物)结合情况、目的基因表达情况的影响,分析其抑制转染效率的机制。结果表明,高浓度的柠檬酸铁铵对细胞转染存在明显抑制作用,且该抑制作用随着柠檬酸铁铵浓度的升高而逐渐增强。当柠檬酸根和铁离子同时存在时才会抑制细胞转染过程。过高浓度的柠檬酸铁铵使PEI-DNA复合物的粒径显著增加,复合物进入细胞更加困难,导致进入细胞的复合物数量减少,最终引起细胞转染效率的大幅下降。柠檬酸铁铵通过影响PEI-DNA复合物的大小限制DNA进入细胞,从而抑制PEI介导的悬浮HEK293细胞转染过程。控制转染时柠檬酸铁铵浓度在20μmol/L内可解决其对转染过程的抑制作用。本研究深入认识了柠檬酸铁铵对PEI介导的悬浮HEK293细胞转染过程的影响及其机制,为悬浮HEK293细胞转染培养基的开发和理性设计提供有力参考。

阳离子脂质体转染条件对转染效率的影响

分析不同浓度的四环素、阿奇霉素、氯霉素和庆大霉素和不同PH值、细胞状态对脂质体Lipo2000转染效率产生影响。方法 1.HeLa细胞转染前24小时在MEM培养基中分别加入不同种类不同浓度的抗生素,48小时后根据GFP阳性细胞数量分析抗生素对转染的影响。2.HeLa细胞转染前24小时放置在不同PH值的MEM培养基中,根据GFP阳性细胞数量分析不同PH值对转染的影响。3.观察 对在室温放置不同天数的HeLa细胞转染率,分析不同细胞状态对转染效率的影响。结果 1.不同种类抗生素以及同种抗生素不同浓度均对脂质体转染效率的敏感性不同,用庆大霉素作为抗生素转染效率最佳,四环素转染效率最差。2.不同转染细胞浓度条件下在PH=8.0碱性培养基中转染效率最佳。3.室温放置的细胞脂质体LipofectamineTM2000的转染效率显著降低。结论 使用庆大霉素抗生素以及在PH值8.0、细胞状态最佳条件下转染效率敏感性最高。

超声靶向微泡破坏技术介导基因转染在乳腺癌治疗中的研究进展

乳腺癌全球发病率逐年上升,严重威胁女性健康。近年来,随着生物技术的快速发展,基因治疗在乳腺癌中的研究日益增多。超声靶向微泡破坏作为一种潜在的基因或药物递送系统,既可作为载体,又可增加生物屏障的通透性,从而提高肿瘤的治疗效果,已广泛应用于乳腺癌基因治疗研究。考虑到常规基因载体的固有缺陷,研究者倾向将其与超声靶向微泡破坏技术联合应用以提高基因转染的安全性和有效性。本文对超声靶向微泡破坏技术及其与常规基因载体联合介导基因转染治疗乳腺癌的研究进展做一综述。

3种介导猪NR2F2基因转染PK15细胞方法的比较研究

试验旨在研究3种转染方法对猪肾上皮细胞(PK15)的转染效率,为以PK15细胞为模型研究外源基因的功能提供参考。本研究以PK15细胞为研究对象,用脂质体、电穿孔、慢病毒3种转染方法转染后,在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达,采用实时荧光定量PCR检测EGFP和NR2F2基因的表达情况,采用CCK-8检测细胞存活率,进而比较3种方法的转染效果。结果显示,转染PK15细胞后,电穿孔和慢病毒方法转染效率极显著高于脂质体(P<0.01),但电穿孔方法和慢病毒方法之间差异不显著(P>0.05);EGFP和NR2F2基因的实时荧光定量PCR结果显示慢病毒方法效果最好,脂质体方法较差,与细胞转染效率基本一致;CCK-8结果显示,电穿孔转染后细胞存活率最低,极显著低于对照组(P<0.01),脂质体方法显著低于对照组(P<0.05),慢病毒方法与对照组间差异不显著(P>0.05)。综合考虑转染效率及细胞活性,本研究认为慢病毒转染方法最适合转染PK15细胞,为今后高效转染PK15细胞提供了理想的方法。

脂质体介导转染N2a细胞的优化方法

背景:阳离子脂质体介导的细胞转染具有结果可靠、可重复性强的特点,但面临一个共同的缺点,就是转染效率常较低。目的:探讨阳离子脂质体转染N2a细胞(小鼠神经胶质瘤细胞)的优化方法。方法:采用24孔培养板,1.5μL阳离子脂质体Lipofectamine?LTX介导,通过贴壁法和悬浮法,将500 ng带有绿色荧光蛋白(GFP)基因的重组质粒pcDNA3-GFP转入N2a细胞,倒置荧光显微镜观察细胞内绿色荧光蛋白表达情况,并比较二者转染效率。采用悬浮转染法,将500 ng质粒DNA分别用1.0,1.5,2.0,2.5μL Lipofectamine?LTX进行转染,探讨最适脂质体和DNA比例。结果与结论:1.5μL脂质体/500 ng DNA,悬浮法转染效率显著高于贴壁法转染效率(P<0.01);1.0,1.5,2.0,2.5μL Lipofectamine?LTX对500 ng质粒DNA的转染效率分别为(76.60±3.85)%,(80.00±4.17)%,(88.00±5.89)%,(54.96±4.23)%,提示脂质体2.0μL与质粒DNA 500 ng的转染效率最高。

磷酸钙法转染瘤细胞效率的优化

为了探索磷酸钙法转染瘤细胞的最佳转染条件,以磷酸钙法将ANXA2特异性重组干扰质粒pU6H1-GFP-siANXA2导入人肝癌细胞SMMC-7721并优化了以下转染参数：转染前细胞汇合率、质粒剂量、质粒复合物形成时间、孵育时间、血清、抗生素有无及细胞传代次数等.以荧光显微镜观察GFP表达、半定量RT-PCR和western blotting评估转染效率.结果显示,转染前细胞50%~60%汇合率、8μg质粒用量（直径30 mm培养皿）、20~30 min沉淀形成时间及6 h孵育时间转染效率较高;细胞传代次数及抗生素有无对转染效率影响不显著,但血清在实验条件下是必不可少的.转染48 h后,GFP表达进入高峰期、ANXA2 mRNA和蛋白水平下调（P〈0.05）.

小鼠骨样细胞MLO-Y4转染方法的研究

为了建立质粒转染小鼠骨样细胞MLO-Y4的方法,分别采用阳离子脂质体法和电转染法将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)质粒pEGFP-C1转染小鼠骨样细胞MLO-Y4,正常培养48h后检测并统计转染率和死亡率。结果显示,脂质体法转染,当质粒与脂质体比例为1∶4时,转染效率可达到(36.8±3.7)%,细胞死亡率为(18.4±1.9)%;电转染法转染,脉冲电压240 V,脉冲时间300μs,脉冲次数3次时,转染率最高,可达到(23.8±2.3)%,细胞死亡率为(14.1±1.1)%。而后MTT实验显示脂质体转染法相对于电转染法对MLO-Y4细胞的增殖有一定的抑制作用,但对后续实验研究影响不大。脂质体转染法转染小鼠骨样细胞MLO-Y4优于电转染法。