枣ZjPG基因表达分析及载体构建

【目的】克隆枣多聚半乳糖醛酸酶(Polygalacturonase,PG)基因,分析ZjPG基因表达模式并构建过表达载体,为探究ZjPG基因调控枣裂果的分子机制及培育抗裂枣品种提供理论参考。【方法】以壶瓶枣为试验材料,克隆ZjPG基因(ID:LOC107426373),采用ExPASy、SOPMA、SWISS-MODEL等在线工具对ZjPG蛋白进行生物信息学分析;利用MEGA 7.0构建基于PG氨基酸序列的系统发育进化树并分析ZjPG基因启动子顺式作用元件;通过荧光定量PCR检测枣不同组织(幼叶、成熟叶、花、幼果和膨大期、白熟期、脆熟期及完熟期果实)与不同浓度茉莉酸甲酯(MeJA,0.2和0.4 mol/L)和脱落酸(ABA,0.2 mol/L)处理下枣果实及脆熟期正常果实和开裂果实中ZjPG基因的相对表达量,并构建ZjPG基因过表达载体。【结果】壶瓶枣中ZjPG基因的编码区(CDS)序列全长为1353 bp,与NCBI网站ZjPG基因CDS序列相似性为99.70%,氨基酸序列相似性为99.33%,说明成功克隆ZjPG基因。ZjPG蛋白分子量为49145.28 Da,编码450个氨基酸残基,理论等电点为6.27,无跨膜结构域,为稳定亲水性蛋白,含有Pgu1保守序列。其二级结构由12.67%的α-螺旋,32.22%的延伸链,8.00%的β-折叠及47.11%的无规则卷曲组成。系统发育进化树结果显示,ZjPG与拟南芥AtPG和葡萄VvPG的亲缘关系较近,ZjPG与其他9个物种的PG蛋白基序具有高保守性。ZjPG基因的启动子中包含多个激素响应顺式作用元件。实时荧光定量PCR检测结果显示,ABA和MeJA均可诱导ZjPG基因表达;裂果中ZjPG基因相对表达量显著高于正常果(P<0.05);ZjPG基因在壶瓶枣的叶、花和果实中均有表达,在完熟期果实中的相对表达量最高。成功构建pCAMBIA-1300-ZjPG表达载体。【结论】成功克隆壶瓶枣ZjPG基因CDS序列并成功构建该基因的过表达载体,不同物种之间的PG蛋白序列具有高度保守性,ZjPG基因的表达受到ABA和MeJA信号调控,在裂果中高表达,ZjPG基因表达具有组织特异性和时空特异性。

苦瓜McPDS基因克隆及CRISPR/Cas9基因编辑载体构建

以苦瓜八氢番茄红素脱氢酶(phytoene dehydrogenase,PDS)基因为靶标,构建其特异gRNA的CRISPR/Cas9基因编辑载体,以期为建立苦瓜CRISPR/Cas9基因编辑技术体系奠定基础。以苦瓜自交系B07叶片cDNA为模板,同源克隆苦瓜McPDS基因CDS序列。结果表明,McPDS基因CDS序列全长1731 bp,编码576个氨基酸,蛋白质相对分子质量为64.44 kD,理论等电点(PI)为7.09。跨膜结构分析结果表明,该蛋白为亲水性非跨膜蛋白。系统进化树分析结果表明,McPDS与黄瓜、甜瓜等葫芦科植物中的PDS蛋白同源性较高。此外,以McPDS为靶标基因,在5’端筛选2个高特异性靶点,经设计引物,成功构建1个双靶点CRISPR/Cas9基因编辑载体,为苦瓜基因编辑体系的建立奠定了技术基础。

甜菜BvPCNA基因RNAi载体构建

【目的】增殖细胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen, PCNA)在植物中广泛存在,但是其在植物中的功能研究较少。本研究可以为BvPCNA-like基因的功能分析奠定基础。【方法】课题组前期在甜菜基因组中克隆获得一个基因位点,命名为BvPCNA-like基因,本研究以BvPCNA-like基因的克隆载体为初始材料,选取适宜的靶序列,利用植物表达载体pFGC5941作为基础载体,使靶序列上游启动子为35 S,植物筛选标记为抗除草剂基因BlpR,设计靶序列特异性引物,采取PCR-酶切-连接方法,构建BvPCNA-RNAi载体。【结果】通过RCR鉴定表明已获得了预期目标载体,插入片段由正向靶序列BvPCNA-F、中间片段、反向靶序列BvPCNA-R组成,靶序列长度为320 bp。【结论】本研究所得载体适用于对双子叶植物进行遗传转化,可以作为BvPCNA-like基因理论研究或应用研究的载体材料。

鼠源ATP5B基因克隆及其原核和真核表达载体构建

【目的】克隆鼠源ATP5B基因,构建其原核和真核表达载体,为研究ATP5B蛋白功能及其在病毒感染过程中的作用机制提供基础。【方法】克隆鼠源ATP5B基因编码区(CDS),运用ProtParam、ProtScale和SignalP-5.0等对ATP5B蛋白进行生物信息学分析。采用同源重组方法构建原核表达载体pGEX-4T-1-ATP5B-Flag和真核表达载体pcDNA3.0-ATP5B-Flag。以原核表达载体pGEX-4T-1-ATP5B-Flag转化大肠杆菌BL21感受态细胞,利用IPTG进行诱导表达,分析最适诱导温度和IPTG浓度。以真核表达载体pcDNA3.0-ATP5B-Flag转染HEK-293T细胞,通过Western blotting和间接免疫荧光试验(IFA)检测ATP5B蛋白在细胞中的表达及分布情况。【结果】鼠源ATP5B基因CDS长1590 bp,鼠源ATP5B蛋白由529个氨基酸残基构成,分子量为55 kD,理论等电点(pI)为5.21,属于稳定的疏水性蛋白,无跨膜结构域和信号肽,不属于分泌蛋白;鼠源ATP5B蛋白二级结构中α-螺旋占43.67%,无规则卷曲占32.51%,β-转角占9.45%,延伸链占14.37%。原核表达载体pGEX-4T-1-ATP5B-Flag经IPTG诱导后,通过考马斯亮蓝染色和Western blotting在81 kD处成功检测到融合蛋白,且主要以包涵体形式表达,诱导条件以30℃、0.5 mmol/L IPTG的效果更好。以真核表达载体pcDNA3.0-ATP5B-Flag转染HEK-293T细胞后,在55 kD处检测到Flag标签特异性条带,即ATP5B蛋白在HEK-293T细胞中成功表达,IFA检测结果表明该蛋白主要定位在细胞质中。【结论】成功构建鼠源ATP5B基因原核和真核表达载体,原核表达载体表达出的融合蛋白主要以包涵体形式存在,只有少量可溶蛋白,真核表达的ATP5B蛋白主要定位在细胞质中。鼠源ATP5B蛋白是理化性质稳定的疏水性蛋白,无信号肽位点,不属于分泌蛋白。

绣球‘杜丽’AP 3基因克隆与基因编辑载体构建

绣球(Hydrangea macrophylla)是以花序为主要观赏部位的园林植物,多用作切花装饰和景观营造,在亚洲、美洲、欧洲广泛栽培。为探究AP 3基因在绣球花萼形成过程中的功能,加快重瓣绣球新品种培育进程,该研究以绣球‘杜丽’为材料,克隆其MADS-box B类基因HmAP 3,并结合生物信息学方法预测基因功能;根据HmAP 3序列信息,筛选出高特异性编辑靶点并构建CRISPR/Cas9基因编辑载体,通过农杆菌转化法将载体整合到绣球基因组中。结果表明:(1)克隆到1段HmAP 3基因的cDNA序列,其序列全长546 bp,共编码181个氨基酸,测序结果表明其氨基酸序列与参考序列一致性为100%,与拟南芥AtAP3相似度为58.8%。(2)不同属植物AP3氨基酸序列差异较大,在同属不同物种中,AP3蛋白主要结构较为保守,仅在少数基序上存在差异。(3)在HmAP 3中共鉴定到2个高特异性靶点,并成功构建2个单靶点CRISPR/Cas9基因编辑载体。(4)该研究共获得5株基因组内含有Cas 9序列的抗性芽,但其靶点均未突变,在抗性芽中没有检测到Cas9表达。该研究探讨了AP 3基因在重瓣绣球育种中的价值,对绣球的CRISPR/Cas9基因编辑技术进行了初探,为绣球优良品种繁育工作奠定了基础。

辣椒CaWRKY39基因克隆及其酵母单杂交pGADT7载体构建

辣椒是我国重要的经济作物之一,但番茄斑萎病毒(TSWV)极易造成其巨大的生产损失,亟需有效的防治策略。前期研究发现,辣椒转录因子CaWRKY39在TSWV侵染下特异性高表达,推测其可能在辣椒抗TSWV中发挥重要作用。本研究从辣椒‘萧新19’叶片中克隆了CaWRKY39基因,并对其进行生物信息学分析,结果表明,CaWRKY39的CDS全长为1 035 bp,编码一个由344个氨基酸组成、相对分子量为38 570.53 Da、理论等电点为9.59的稳定疏水蛋白,该蛋白二级结构和三级结构主要由无规则卷曲构成,占比为60.76%。系统进化分析发现CaWRKY39蛋白与棉花GhWRKY39蛋白亲缘关系最近,表明两者功能可能具有相似性。为进一步验证CaWRKY39对相关抗性基因的靶向调控作用,采用RT-PCR技术扩增CaWRKY39基因CDS序列,利用NdeⅠ、EcoRⅠ双酶切,并通过无缝克隆的方法成功构建了酵母单杂交表达载体pGADT7-CaWRKY39。本研究结果可为深入研究CaWRKY39转录因子参与辣椒抗TSWV病毒的分子机理提供技术支持和参考。

拟南芥WRKY13基因表达载体构建及鉴定分析

铁是植物生长所必需的微量元素,目前植物受到缺铁胁迫的现象广泛存在,严重影响了植物的生长,减少了作物的产量。因此筛选和克隆植物缺铁胁迫耐受基因对解决农业生产问题具有极大的科学价值和现实意义。文章以拟南芥为实验材料,通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术克隆WRKY13基因的启动子区域,成功构建了ProWRKY13∶GUS融合表达载体;利用浸花法将ProWRKY13∶GUS载体转化拟南芥,经鉴定分析后可知,获得了阳性转基因植株。对转基因植株进行缺铁诱导的GUS组织染色,实验结果为研究缺铁胁迫下WRKY13基因的功能及转录水平变化提供了重要依据。

猪转录因子YY1基因克隆、序列特征及真核表达载体构建

YY1(Yin-Yang1,YY1)作为重要的转录因子对基因表达调控起到重要的作用。本研究旨在克隆猪YY1基因CDS区序列,利用生物信息学软件分析猪YY1基因编码蛋白的特性和功能。利用免疫荧光检测YY1在猪卵泡颗粒细胞中的定位;利用同源重组构建YY1真核表达载体,通过qRT-PCR及Western Blot(WB)检测YY1过表达载体在猪原代卵泡颗粒细胞中的表达效率。本研究成功克隆了猪YY1基因全长CDS区,生物信息学分析结果表明猪YY1蛋白由411个氨基酸组成,相对分子质量为44.3 kDa,为亲水性与酸性蛋白,无跨膜结构域与信号肽,二级结构主要含有α-螺旋(16.06%)、延伸链(19.71%)、β-转角(7.54%)和无规则卷曲(56.69%),YY1主要定位于细胞核,共含39个潜在的磷酸化位点,互作蛋白有EP300、E2H2、HDAC1、HDAC2等。免疫荧光检测发现YY1主要在猪原代卵泡颗粒细胞的细胞核中表达,qPCR和Western Blot检测结果显示该真核表达载体在猪原代卵泡颗粒细胞中成功表达。本研究为进一步探究猪转录因子YY1的生物学功能及提高母猪的繁殖率提供了理论依据。

番茄SlERF-H6基因VIGS沉默载体构建

番茄(Solanum lycopersicum)具有较高的营养价值,深受消费者的喜爱,目前番茄已经成为广泛种植的经济作物之一。乙烯响应因子(ethylene response factor,ERF)是一类植物特有的转录因子。ERF在植物形态发生、逆境响应、成熟衰老、激素信号转导和代谢物调节等多种生理过程中起重要的调节作用。文章以番茄的SlERF-H6(LOC101259323)基因为研究对象,通过对SlERF-H6的基因序列进行分析,获得该基因的特异性区域沉默序列。利用同源重组技术成功构建了番茄SlERF-H6病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)载体。为进一步探究番茄SlERF-H6基因在果实成熟中的作用提供参考。

BMP7过表达慢病毒载体构建及其对小鼠主动脉平滑肌细胞钙化的影响

目的构建骨形态发生蛋白7(BMP7)过表达慢病毒载体,分析BMP7过表达对小鼠主动脉内皮细胞Jagged1表达的影响及其对共培养血管平滑肌细胞(VSMCs)钙化的影响。方法根据目的基因信息Mouse-BMP7(NM_007557.3)和质粒信息pLVX-zsGreen-C1进行基因序列合成,构建BMP7过表达慢病毒。qPCR检测BMP7过表达慢病毒感染效率;Western blot检测其感染的小鼠主动脉内皮细胞Jagged1蛋白表达。将过表达BMP7慢病毒感染的内皮细胞与VSMCs共培养,茜素红染色观察共培养后VSMCs钙化情况。结果成功构建BMP7过表达慢病毒载体并转染至小鼠主动脉内皮细胞。qPCR检测结果提示,与正常对照组比较,BMP7过表达组的BMP7 mRNA相对表达量显著升高(P<0.01),空载体对照组BMP7 mRNA无显著变化(P>0.05)。Western blot结果显示,BMP7过表达组内皮细胞Jagged1蛋白表达水平较正常对照组显著降低(P<0.01),而空载体对照组内皮细胞Jagged1蛋白水平较正常对照组无显著改变(P>0.05)。茜素红染色结果提示,与感染过表达BMP7慢病毒的内皮细胞共培养后,VSMCs的钙化程度明显增加。结论成功构建小鼠BMP7过表达慢病毒载体,并发现过表达BMP7可以降低小鼠主动脉内皮细胞Jagged1表达,并促进共培养的VSMCs钙化。

硒诱导的黄瓜耐镉转录本鉴定分析及表达载体构建

以黄瓜乙烯响应因子CsERF7转录本为研究对象,通过外源硒缓解黄瓜镉胁迫试验分析其表达及黄瓜生长状况,并克隆CsERF7基因,构建过表达载体转化拟南芥,同时分析CsERF7的理化性质和功能。结果表明,外源硒显著升高了镉胁迫引起的黄瓜生长指标的降低,CsERF7在镉处理下的表达丰度是对照的56%,而镉+硒比单独镉处理上调表达4.53倍,与RNA-seq结果相符,此基因可能在硒调控黄瓜镉胁迫响应中起作用。同时,成功构建超表达载体pEGOEP35S-H-ERF7-GFP,转化拟南芥获得转基因株系。生物信息学分析表明,黄瓜CsERF7基因属于AP2/ERF家族的AP2亚家族,开放阅读框ORF长度588bp,编码196个氨基酸,有1个AP2结构域;该蛋白属于非跨膜亲水性蛋白,亚细胞定位预测定位在线粒体中,存在22个氨基酸磷酸化位点;其二级结构主要由α-螺旋和延伸链构成,与三级结构预测结果高度一致,所得蛋白序列与黄瓜、甜瓜同源性最高。

甜瓜AMS基因结构分析及基因编辑载体构建

【目的】研究鉴定甜瓜雄性不育候选基因ABORTED MICROSPORES(AMS)的基因家族,分析CRISPR基因编技术并构建其敲除载体,为甜瓜雄性不育基因AMS功能验证提供依据。【方法】采用生物信息学技术鉴定甜瓜雄性不育候选基因ABORTED MICROSPORES(AMS)家族基因,分析其进化关系、保守基序及理化性质。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术以甜瓜AMS基因外显子区设计gRNA引物,以载体pHSN401为模板,扩增获得sgRNA克隆框,使用Bsa I酶切pHSN401载体,利用DNA重组酶构建重组载体并转化农杆菌,挑选单克隆进行培养,随后进行菌液PCR鉴定。【结果】甜瓜AMS基因编码的蛋白质长度从501~605 aa不等,平均分子量约为59351 Da,等电点为5.04~6.45,甜瓜大部分AMS基因定位在细胞核;利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,在AMS基因的CDS区设计3个靶位点,分别是AMS-pHSN401-1、AMS-pHSN401-2和AMS-pHSN401-3。【结论】AMS基因主要被预测在细胞核中表达,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建甜瓜敲除重组载体AMS-pHSN401并转化农杆菌,获得阳性克隆。

多靶点沉默CCR5基因载体构建及沉默效果验证

目的筛选沉默CCR5基因的靶点并验证多靶点沉默CCR5基因的效果。方法检索人CCR5基因的cDNA序列,设计针对CCR5 mRNA的siRNA,选择与靶基因结合具有高特异性的3个siRNA序列,合成shRNA双链,构建多靶点沉默CCR5重组质粒。同时合成CCR5过表达质粒。经测序验证后进行质粒慢病毒包装。首先,用CCR5过表达慢病毒转染Jurkat T细胞,实时荧光逆转录定量聚合酶链反应(real-time reverse transcription quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测CCR5过表达情况。Control组(空白对照)为Jurkat T细胞,将CCR5过表达细胞分组为CCR5-OE组(CCR5过表达)、CCR5-OE-NC组(CCR5过表达阴性对照)、CCR5-OE-沉默组(CCR5过表达沉默)。RT-qPCR和Western bolt检测CCR5沉默重组质粒对目的基因的沉默效果。实验中各项数据的分析选用SPSS软件,作图选用GraphPad Prism软件。结果测序结果证明,CCR5过表达质粒含有目的序列,CCR5沉默重组质粒中含有3个目的靶点序列。RT-qPCR检测CCR5过表达情况显示,细胞CCR5的基因表达显著升高,可进行后续实验。CCR5沉默慢病毒感染后,RT-qPCR和Western bolt检测各组CCR5表达结果显示,多靶点CCR5沉默组的CCR5基因表达水平和蛋白表达水平较CCR5-OE组降低(P均<0.05)。结论成功构建多靶点沉默CCR5基因重组质粒,验证多靶点沉默CCR5基因的有效性,为基因编辑治疗艾滋病提供实验数据。

宗地花猪LOX基因CDS区克隆、真核表达载体构建及生物信息学分析

本研究旨在对宗地花猪LOX(Lysyl Oxidase)基因编码区(Coding Sequence,CDS)区进行克隆和分析,构建其真核表达载体,并对该基因进行生物信息学分析。实验采用RT-PCR克隆方法,以GenBank中公布的猪LOX基因序列为模板,克隆宗地花猪背最长肌组织LOX基因CDS区序列,测序鉴定后进行生物信息学分析,同时构建该基因真核表达载体pEGFP-C1-LOX。结果表明:克隆得到LOX基因CDS区全长1260 bp,编码419个氨基酸,编码蛋白的分子量为47009.34Da,有45个磷酸化位点,为无跨膜区域的疏水性蛋白,其核苷酸序列与牛、鸡、黑猩猩、狗、驴、羊、马及人的相似性分别为90.9%、74.6%、89.2%、91%、91.3%、90.8%、84.4%和44.5%,不同物种间相似性较高,进化过程中具有高度保守性,与牛、羊、驴、狗亲缘关系较近,LOX蛋白主要定位在细胞核。本研究首次克隆出宗地花猪LOX基因CDS区全长序列,并成功构建LOX基因真核表达载体pEGFP-C1-LOX,为进一步探索宗地花猪LOX基因功能及作用机制提供了理论基础。

组织社会学视角下产学研创协同发展中的创新载体构建——兼论产教联合体的未来发展

在组织社会学视角下,产学研创协同发展可以视为产教融合的一个高级阶段,是在产学研发展基础上的合理化跃升,也是我国创新驱动发展战略落地、提升国家技术创新水平、创新型技术人才培养的时代需求。从订单培养到产教联合体,见证了中国职业教育界在产教融合上的不懈探索。但从国内外比较来看,我国现有的产学研组织更多地着眼于既有技术的推广,而对于创新的关注度均有待提升,产学研创组织发展中的“先天不足”“后天乏力”和成长性难题不容忽视。包括产教联合体在内的产学研创创新载体的协同发展需要在组织载体上不断创新,在组织构建和机制优化、评价与激励、学习机制等方面进行提升和优化。

牦牛VEGFA双荧光素酶载体构建及与miR-200b的靶向验证

为探究微小RNA(miR-200b)与血管内皮生长因子A(VEGFA)基因之间的靶向关系,采用miRanda和Targetscan软件预测牦牛miR-200b与VEGFA可能存在结合位点,构建了VEGFA基因3′UTR区的野生型和突变型双荧光素酶载体。利用与目的miRNA靶种子序列相结合基因的突变序列,构建该靶基因的突变型重组质粒(pGL3-promoter-mut VEGFA),再进行重组质粒和目的miRNA的miRNA mimic的共转染实验。结果表明,预测到的miR-200b与VEGFA基因的3′UTR区存在结合位点。PCR进行扩增和测序之后,VEGFA基因3′UTR区的野生型、突变型载体构建成功。共转染VEGFA野生型载体和miR-200b mimic的双荧光素酶活性极显著低于对照组(P<0.05),VEGFA突变型载体和miR-200b mimic共转染的双荧光素酶活性与对照组无显著差异(P>0.05)。说明VEGFA基因的3′UTR区能与miR-200b结合并抑制双荧光素酶活性,验证了VEGFA是miR-200b的靶基因。

LGALS3BP 3’UTR荧光素酶报告基因载体构建及鉴定

目的构建LGALS3BP(lectin,galactoside-binding,soluble,3 binding protein,LGALS3BP)基因3’非编码区(3’-untranslated region,3’UTR)的野生型及突变型荧光素酶报告基因重组载体并进行鉴定,以备进一步研究miRNA对LGALS3BP基因的调控。方法Targetscan软件预测LGALS3BP 3’UTR上的miRNA结合位点;以人肝癌细胞系SMMC-7721基因组DNA为模板,进行PCR扩增,获得野生型LGALS3BP基因3’UTR片段,经双酶切将目的片段定向插入报告基因载体pGL3-Control中,将克隆好的重组载体转化大肠埃希菌DH5α感受态细胞进行扩增,采用菌落PCR及测序监定重组子。设计位点突变型LGALS3BP 3’UTR扩增引物,以构建的野生型LGALS3BP 3’UTR重组质粒为模板,采用重叠PCR及定点突变PCR技术进行扩增分别构建单独位点及双位点突变型重组荧光素酶报告基因载体。结果野生型LGALS3BP 3’UTR重组质粒经菌落PCR鉴定,可见871 bp的目的基因片段,大小与预期相符;测序结果表明,插入序列与LGALS3BP 3’UTR序列完全一致且插入方向正确。Targetscan软件预测到LGALS3BP 3’UTR区有两个感兴趣的miRNA结合位点。突变型LGALS3BP 3’UTR重组质粒测序鉴定结果表明,单独位点及双位点突变型重组质粒中均成功引入结合位点突变。结论成功构建LGALS3BP的3’UTR野生型(pGL3-LGAL-W-3’UTR)、两个单独位点突变型(pGL3-LGAL-M1-3’UTR和pGL3-LGAL-M2-3’UTR)及双位点突变型(pGL3-LGAL-M-3’UTR)重组荧光素酶报告基因载体,为后续研究miRNA对LGALS3BP基因的调控奠定基础。

和田羊FGF5基因RNA干扰载体构建及筛选

试验旨在构建并筛选出高效的和田羊成纤维细胞生长因子5(FGF5)基因的RNA干扰载体,根据和田羊FGF5基因序列,设计4条短发夹RNA(shRNA)干扰片段和1条阴性对照片段。扩增后克隆至pGPU6载体,获得4个重组质粒pGPU6-shRNA-FGF1、pGPU6-shRNA-FGF2、pGPU6-shRNA-FGF3、pGPU6-shRNAFGF4和阴性对照质粒pGPU6-shRNA-FGF5。通过琼脂糖凝胶电泳和DNA测序对质粒进行酶切鉴定和测序鉴定。鉴定后的质粒通过电刺激法转染至和田羊成纤维细胞,通过qRT-PCR和Western Blotting(WB)分析FGF5基因的表达情况。结果显示,与阴性载体相比,4个RNA干扰表达载体均可显著降低FGF5 mRNA和蛋白的表达量(P<0.05),其中pGPU6-shRNA-FGF3干扰效率最高,为85.20%。研究表明,FGF5干扰表达载体构建成功并可有效干扰和田羊FGF5基因表达。

多基因共表达载体构建的研究进展

多基因共表达载体在研究多外源基因的表达及蛋白互作实验中有着广泛的应用,可以简化相关实验流程,提高基因表达效率。本文就载体构建技术、多启动子共表达载体的构建、多顺反子共表达载体的构建等现状作了综述,并对多基因共表达载体未来的发展趋势进行了展望,以期为构建多基因共表达载体提供参考。

芥菜型油菜BjuA03.TTG2基因启动子克隆及表达载体构建

为进一步分析芥菜型油菜BjuA03.TTG2启动子在调控该基因表达中的作用,本研究以含有该基因的BAC单克隆质粒DNA为模板,通过普通PCR获得BjuA03.TTG2上游1 839 bp的DNA序列。利用PlantCARE在线分析软件分析BjuA03.TTG2启动子序列,含有许多与应答相关的顺式作用元件,如激素、光、低温等。根据BjuA03.TTG2启动子顺式作用元件的位置设计引物,采用5’端系列缺失分析法,利用PCR方法对BjuA03.TTG2基因上游启动子序列进行特异扩增,分别克隆了1 839、1 497、1 165、863、627、377和297 bp的启动子片段并构建到pCAMBIA1304植物表达载体中。鉴定结果说明7个BjuA03.TTG2启动子不同区段与GUS融合的植物表达载体构建成功。研究结果为进一步分析BjuA03.TTG2启动子的功能作用提供前期基础。