猪2型圆环病毒辽宁分离株ORF2基因真核表达载体的构建及鉴定

PCV2基因片段ORF2编码病毒衣壳蛋白,是主要的免疫原蛋白,并且基因序列比较保守,是构建核酸疫苗的首选基因片段。本试验构建真核表达载体pIRES-ORF2,并转染Hela细胞,进行了间接免疫荧光试验。结果表明,在荧光显微镜下可以看到转有pIRES-ORF2质粒的细胞玻片上有明显的黄绿色荧光。

鹅星状病毒辽宁株分离鉴定及遗传变异分析与抗原表位预测

从辽宁某鹅场无菌采集病死雏鹅肝脏、肾脏等病料,通过鹅胚接种、核酸检测、电镜观察等方法进行病原的分离鉴定,并对所分离的毒株进行遗传变异分析和抗原表位预测。经过接种病料鹅胚的病变特征观察、病毒PCR核酸扩增和序列分析以及透射电镜形态鉴定,确认成功分离到1株GAstV(goose astrovirus),暂命名GAstV/LN/202101(简称LN202101)。针对编码衣壳蛋白保守结构域N和P2 Capsid domain的核苷酸序列对该毒株进行遗传进化树和同源性分析,结果显示该毒株与江西株JX01(MZ576222.1)等近2年发现的毒株亲缘关系较近,在同一簇分支,且属于GAstV-Ⅱ型;但同源性已表现出差异。以HAstV(human astrovirus)已验证表位为参考,依据抗原抗体结合模型,结合生信方法推测以下4段序列可能为GAstV的抗原表位:453~467aa(PQADSRSRYNANITF)、508~513aa(VCNTLA)、525~553aa(TAVLRVNTSTTSTGGQITELRNRLNIADG)和585~597aa(DSNPGETFQSFKM)。结果表明,GAstV辽宁流行株与国内其他地区为同一来源,但已发生变异;辽宁株衣壳蛋白部分抗原优势表位较多,可以作为近2年流行毒株的代表。该研究结果为进一步明确该病毒遗传进化特点和抗原特征,开发相应亚单位疫苗和抗体等生物防控制品奠定了基础。

猪伪狂犬病病毒LN1301株分离鉴定及其gE和TK基因的变异分析

通过查明辽宁省猪伪狂犬病(pseudorabies,PR)的传染来源及其病原变异情况,为建立有针对性的诊断与防制方法提供基础依据。采集辽宁某猪场疑似伪狂犬病病死仔猪的脑组织病料,应用非洲绿猴肾(Vero)细胞分离培养,通过电子显微镜观察、病毒中和试验、聚合酶链反应、病毒TCID50测定和动物试验对所分离的病毒进行鉴定。结果确认从辽宁省成功分离到1株猪伪狂犬病病毒野毒株,暂命名为PRVLN/1301株。应用猪伪狂犬病毒(PRV)标准株设计引物对分离到的病毒进行gE和TK基因PCR扩增、T-A克隆、测序,成功扩增克隆出猪伪狂犬病病毒辽宁株PRVLN1301的主要毒力基因gE和TK基因序列。通过系统进化树分析表明该毒株与国内外参考毒株的同源性均在97%以上,核苷酸序列分析结果显示所分离的PRVgE基因存在第995位点由C-A的突变、第999位点由T-G的突变,氨基酸序列比对结果显示存在1个氨基酸L-Q位点的变化,即由亮氨酸变为谷氨酰胺,TK基因没有变异和缺失。说明该毒株与其他地区毒株为同一来源,但存在部分位点的变异。

猪流行性腹泻病毒LN-2015-1株分离鉴定及其S基因的变异分析

为了解辽宁猪流行性腹泻病毒(PEDV)来源及变异特性,经PCR诊断,细胞分离,细胞病变观察、RT-PCR以及S基因序列鉴定,成功分离1株PEDV毒株(LN-2015-1)。S基因序列分析显示,与CV777毒株相比,除点突变外,分离株还出现最长9bp的插入,6bp的缺失和13bp连续突变。氨基酸也存在最长3aa插入和2aa缺失,同时存在4处连续3个及以上的氨基酸突变,抗原表位分析表明在5个表位区共发生16个氨基酸的突变。同源性分析显示与HB-HA2015毒株的同源关系最近,序列相似性为99.2%,与2010年以来国内外代表变异毒株同源性较高,达到98.5%~98.8%,而与2010年以前的传统同源性较低,在93.2%~95.6%之间;进化树分析显示该毒株与近年来国内外流行的变异毒株属于同一群,并且与HB-HA2015形成一小的分支,而与传统毒株进化距离较远。