一种用于过氧亚硝酸根检测的近红外比率荧光探针的研制

设计合成了一种基于半花菁的近红外比率荧光探针分子Cy-P,并将其用于活细胞中的外源性和内源性过氧亚硝酸根(ONOO-)荧光成像检测.研究结果表明:探针分子Cy-P自身具有较大的π共轭结构,其最大发射波长在近红外区域;加入ONOO-后,强氧化性的ONOO-会导致Cy-P的π共轭体系被破坏,并生成蓝色荧光物质,最大发射波长蓝移了268 nm;探针分子Cy-P对ONOO-线性检测范围为0~15μmol/L,检测下限为13 nmol/L;该探针分子对ONOO-的识别性能优于其他各种可能干扰的生物分析物;该探针分子具有低细胞毒性,适用于活细胞中的外源性和内源性ONOO-的成像检测.

过氧亚硝酸根对蛋白质损伤的研究进展

过氧亚硝酸根——一氧化氮和超氧根阴离子快速结合的产物,是生物体内产生的一种强氧化剂和细胞毒性物质,它可以介导生物大分子包括DNA、蛋白质和脂质的修饰与损伤。近年来,由于许多疾病条件下都发现大量过氧亚硝酸根诱导的蛋白质损伤产物,因此过氧亚硝酸根与蛋白质的相互作用引起了人们的广泛关注。本文详尽地介绍了过氧亚硝酸根介导蛋白质损伤对人体的病理作用和过氧亚硝酸根与蛋白质作用机制等方面的最新研究进展,并对未来过氧亚硝酸根与蛋白质相互作用的研究作了展望。

过氧亚硝酸根与细胞信号转导

生物系统中产生的过氧亚硝酸根(peroxynitrite,ONOO-)具有强氧化性,能够损伤多种生物大分子,产生细胞毒性。细胞通过激活信号通路产生应激反应,其中包括蛋白质酪氨酸激酶(PTK)依赖的多种路径,而ONOO-通过硝化或氧化作用调节酪氨酸的磷酸化。酪氨酸残基的硝化能直接影响酪氨酸的磷酸化,而磷酸酶的氧化将导致酪氨酸磷酸化/去磷酸化平衡的改变,ONOO-激活细胞信号转导通路的作用机制对认识其生理病理功能具有重要意义。

过氧亚硝酸根离子诱导DNA断裂机理的研究

在体内NO和超氧阴离子生成的过氧亚硝酸根离子(ONOO-,peroxynitrite)是一种强氧化性物质,它可以诱导DNA单链断裂使DNA发生损伤。为了探讨ONOO-断裂DNA的作用机理,以质粒DNApBR322为研究对象,采用琼脂糖凝胶和硫代巴比妥酸(TBA)显色反应等方法对ONOO-与DNA的反应进行研究。结果表明ONOO-能明显使DNA发生断裂,而且随着ONOO-浓度的增加,DNA断裂的程度增加,在酸性和中性条件下ONOO-断裂DNA的能力明显高于碱性介质,而CO2对该反应有显著的抑制作用,TBA显色反应进一步证实该反应为自由基机理,其机理为ONOO-与H+形成ONOOH,然后裂解为二氧化氮自由基(·NO2)和羟基自由基(·OH),继而对DNA造成损伤。

流动注射法探究模拟酶催化过氧亚硝酸根氧化酪氨酸的动力学特征

过氧亚硝酸根作为生物体内高活性自由基,能损伤多种生物大分子进而引起一系列重大疾病,对其含量测定和反应机制的研究具有重要意义。过氧亚硝酸根性质活泼,反应速率快,捕捉其动态过程十分困难。本文首次利用流动注射分析仪探究在不同模拟酶血红蛋白和氯化血红素的催化下,过氧亚硝酸根氧化酪氨酸体系的动力学特征。结果表明:过氧亚硝酸根在两种酶催化下氧化酪氨酸的过程均遵循MichaelisMenten的动力学规律;根据米氏常数K_m和最大初速率V_(max),推断其反应机制,经模拟酶催化的过氧亚硝酸根能直接氧化与模拟酶结合后的酪氨酸快速生成酪氨酸二聚体,未生成·OH和O_2^-·。此外,我们还检测了不同温度、pH下两种模拟酶催化的速率常数,得到血红蛋白催化该体系的最适条件为25℃和pH 8.0,速率常数k_(cat)=1.035×10~6 mol·L^(-1)·s^(-1),氯化血红素适宜在37℃和pH 9.5的条件下催化该体系,速率常数k_(cat)=6.842×10~5 mol·L^(-1)·s^(-1);比较动力学参数K_m^(Hb)(4.46μmol·L^(-1))<K_m^(Hemin)(4.90μmol·L^(-1)),V_(max)~Hb(Hb)(0.072ΔI_F/s)>V_(max)^(Hemin)(0.026ΔI_F/s),发现最适条件下血红蛋白的速率常数大于氯化血红素,得到血红蛋白对于该体系的催化活性高于氯化血红素。以上结果为探究酶催化法测定过氧亚硝酸根含量及其反应机理提供动力学参数,对于防治生物体内自由基引起的相关疾病与诊断新技术的开发奠定理论基础。

一种光照诱导原位产生过氧亚硝酸根的新方法

已证实体内过氧亚硝酸根离子与人体多种病理反应相关。采用S-亚硝基硫醇为一氧化氮供体化合物、水溶性优于核黄素的聚乙二醇化核黄素为光敏剂,在光照条件下各自分解出一氧化氮和超氧负离子,并迅速原位转化为过氧亚硝酸根离子。利用酪氨酸和牛血清白蛋白分别作为过氧亚硝酸根离子捕获剂,证实了这是一种体外产生过氧亚硝酸根的有效方法。

过氧亚硝酸根联合碱性成纤维细胞生长因子对人晶状体上皮细胞细胞外信号调节激酶(ERK)磷酸化水平的影响

目的探讨过氧亚硝酸根(peroxynitrite,ONOO^-)和重组人碱性成纤维细胞生长因子(recombinant human basic fibroblast growth factor,b FGF)共同作用对人晶状体上皮细胞细胞外信号调节激酶(ERK)磷酸化水平的影响。初步探讨ONOO^-导致白内障发生的可能机制。方法将培养的HLEC细胞分为4组,对照组(未经ONOO^-和b FGF处理)、b FGF单独处理组、b FGF+ONOO^-处理组[b FGF预处理1 h后加入不同浓度ONOO^-(50μmol·L^(-1)、100μmol·L^(-1)、200μmol·L^(-1))处理1 h]和ONOO^-+b FGF处理组[不同浓度ONOO^-(50μmol·L^(-1)、100μmol·L^(-1)、200μmol·L^(-1))预处理1 h后加入b FGF处理1 h]。检测各组细胞内ERK磷酸化水平的变化。结果 b FGF单独处理组和b FGF+ONOO^-(50μmol·L^(-1)、100μmol·L^(-1)、200μmol·L^(-1))处理组中磷酸化ERK相对表达值分别为5.17±0.35、4.42±0.12、3.91±0.15和0.49±0.08,与对照组(1.00±0.05)相比差异有统计学意义(F=402.83,P<0.001),结果显示ONOO^-可以抑制由b FGF诱导的ERK磷酸化水平的增加(F=310.34,P<0.05)。ONOO^-(50μmol·L^(-1)、100μmol·L^(-1)、200μmol·L^(-1))+b FGF处理组中磷酸化ERK相对表达值分别为3.36±0.04、3.32±0.06和2.92±0.08,与对照组(1.00±0.02)相比,所有处理组的ERK磷酸化水平均显著增加(F=518.94,P<0.001);50μmol·L^(-1)和100μmol·L^(-1)ONOO^-处理细胞后经b FGF处理,ERK磷酸化水平较b FGF单独处理组(3.04±0.05)显著增加(F=35.53,P<0.05),而200μmol·L^(-1)ONOO^-处理组与bF GF单独处理组相比差异无统计学意义(P>0.05)。结论 ONOO^-诱导的白内障的发生可能与ERK磷酸化的紊乱有关。

同步荧光光谱比率法检测过氧亚硝酸根及其清除剂的研究

利用同步荧光光谱建立了一种新的荧光比率法检测过氧亚硝酸根（ONOO-）及评价其清除剂的方法。酪氨酸自身有荧光,在pH 8.5的磷酸缓冲溶液中,酪氨酸与CO2和ONOO-反应生成强荧光的酪氨酸二聚体,利用同步荧光光谱技术,在荧光发射光谱中能同时获得酪氨酸单体（λem=364nm）与二聚体的荧光峰（λem=406nm）,且两峰的荧光强度的比值与ONOO-的浓度呈计量相关。结果表明荧光强度的比值不受实验参数改变的影响,与传统的荧光法相比,有利于扩大检测的线性范围,提高灵敏度。荧光强度的比值与ONOO-的浓度在1.60×10^-7mol·L^-1～6.00×10^-6mol·L^-1范围内呈线性关系,线性相关系数为0.999,检测限为1.84×10^-8mol·L^-1。对浓度为1.00×10^-6mol·L^-1ONOO-平行测定8次,其相对标准偏差为2.4%。利用该法测得抗癌药米托蒽醌的IC50为0.065μg·mL^-1。方法简便易行,试剂廉价易得,体系稳定,可作为一种检测ONOO-及筛选其清除剂的方法。

几种色素抑制过氧亚硝酸根损伤酪氨酸能力的对比

过氧亚硝酸根可以通过强氧化性及强硝化性损伤酪氨酸,从而损害人体健康.姜黄素、原花青素、槲皮素和柚皮素具有抗氧化、抗硝化性,但其自身颜色在研究酪氨酸硝化损伤的常规方法中易造成干扰.为测定色素抑制3-硝基酪氨酸生成的能力,使用高效液相色谱-二极管阵列检测器(HPLC-PDAD,High Performance Liquid Chromatography-Photodiode Array Detector)法对硝化损伤体系成分进行分离,使用荧光光谱法测定色素抑制酪氨酸二聚体生成能力,邻苯三酚自氧化法测定超氧根阴离子抑制能力.结果表明3-硝基酪氨酸抑制率从大到小为姜黄素、原花青素、柚皮素、槲皮素、V_C;酪氨酸二聚体抑制率从大到小为原花青素、姜黄素、柚皮素、槲皮素、V_C;邻苯三酚自氧化抑制率从大到小为姜黄素、槲皮素、柚皮素、V_C,原花青素无明显影响.分析表明4种色素成分抗氧化、抗硝化能力与其结构密切相关.

流动注射化学发光法测定过氧亚硝酸根的研究

基于碱性条件下过氧亚硝酸根-亚硫酸钠-荧光素化学发光新体系中过氧亚硝酸根浓度与化学发光强度呈线性关系,建立了流动注射化学发光法测定过氧亚硝酸根浓度的新方法。在优化实验条件下,方法的线性范围为2.384×10-6—1.192×10-4mol/L,r2=0.9994,最低检测浓度为2.384×10-6mol/L,平行测定11次相对标准偏差为0.36%。并将该方法与鲁米诺体系进行了对比,结果满意。

基于能量转移的稀土上转换发光复合体系检测过氧亚硝酸根

采用热分解法制备得到核壳双层结构的稀土上转换发光纳米粒子(UCNP)。通过表面活性剂的软模板法制备了SiO_(2)包覆的蛋黄-壳(yolk-shell)结构稀土纳米粒子YSUCNP,介孔SiO_(2)包裹层赋予稀土纳米粒子YSUCNP亲水性。利用荧光探针NOF2功能化稀土纳米粒子YSUCNP,得到具有过氧亚硝酸根(ONOO^(-))响应能力的复合检测体系YSUCNP-NOF2。该体系能够在纯水体系中实现发光能量转移的ONOO^(-)上转换发光检测。利用稀土上转换纳米材料的近红外激发优势,在细胞层次实现了ONOO^(-)的上转换发光成像检测。

高灵敏过氧亚硝酸根双光子荧光探针的构建与应用

炎症是生物体内与许多疾病相关的重要保护反应,过氧亚硝酸根(ONOO-)参与炎症过程,与炎症有着密切联系。采用6-羟基-2,3,4,4a-四氢-1H-氧杂蒽-1-酮(GCTPOC)作为双光子荧光团(双光子荧光活性截面δΦ=262 GM(1 GM=1×10^(-50)cm^(4)·s·photons^(-1)·molecule^(-1)),激发波长λ_(ex)=860 nm)设计并合成一种用于检测过氧亚硝酸根的双光子荧光探针GCTONOO。该探针具有良好的荧光响应,检出限低(13.5 nmol/L)、Stokes位移大(135 nm),可特异性识别ONOO^(-)。细胞急性炎症模型实验结果表明,该探针可实现细胞炎症过程中ONOO^(-)的荧光成像分析。

柚皮黄酮抑制硝化和氧化作用的研究

以抑制过氧亚硝酸根硝化酪氨酸生成3-硝基酪氨酸评价了柚皮黄酮的抗硝化作用;以Fenton反应产生羟基自由基体系和邻苯三酚自氧化产生超氧阴离子自由基体系,用紫外可见分光光度法测定了柚皮黄酮对羟基自由基和超氧阴离子自由基的清除效果。结果表明,柚皮苷的抗硝化作用较强,而芦丁和橙皮苷没有明显的抗硝化作用;3种柚皮黄酮清除羟基自由基的效果在μg.mL-1水平就已经比较显著(超过50%),且显示出浓度依赖性,作用大小依次为:柚皮苷>橙皮苷>芦丁;3种柚皮黄酮在μg.mL-1水平清除超氧阴离子自由基的作用大小依次为:芦丁>柚皮苷>橙皮苷。

谷胱甘肽和Ebselen对胰岛素硝化的抑制及其相互作用机理的研究

生物体内NO和超氧阴离子快速反应生成的过氧亚硝酸根离子(ONOO-,peroxynitrite)是一种强细胞毒性物质,它诱导蛋白质酪氨酸残基硝化是其损伤生物系统的重要途径之一。为了探讨谷胱甘肽和ebselen对胰岛素硝化的抑制及其相互作用机理,采用UV鄄Vis、HPLC和ESI鄄MS等方法,研究了ONOO-对胰岛素的硝化作用、小分子抗氧化剂谷胱甘肽(GSH)和ebselen对ONOO-硝化胰岛素的影响以及它们之间的相互作用。结果表明单独的GSH和ebselen对ONOO-引发的胰岛素硝化均有明显的抑制,而作为谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)的底物GSH与GPx的模型化合物ebselen之间存在相互拮抗作用,经过对其产物分析,确定其机理是GSH和ebselen能够直接反应生成一种加合物,从而抑制了GSH和ebselen各自的抗硝化能力。

蛋白质酪氨酸硝化的研究

蛋白质酪氨酸硝基化是一种重要的蛋白质翻译后修饰,与多种病症相关。经由过氧亚硝酸根(ONOO-)和NO2-/H2O2/血红素过氧化物酶体系是促使蛋白质硝化最主要的两种途径,其反应为自由基机理。本文对体内蛋白质硝基化的途径、机制及其生物学意义作了综述,指出蛋白质的硝化具有选择性,特定酪氨酸残基发生硝化能够改变蛋白质的结构和功能,影响其免疫应答和可能涉及的信号转导过程,从而具有重要的生物学意义。

蛋白质硝基化反应的途径

导致蛋白质发生硝基化反应的途径有多种,主要可以分为ONOO^-途径和非ONOO^-途径两类。ONOO^-途径导致的蛋白质硝基化可因金属离子或CO_2的存在而强化,非ONOO^-途径导致的蛋白质硝基化则是亚硝酸盐或其它含氮物质在氧化剂存在下,经含铁卟啉的蛋白质催化而引发的。各种途径导致的蛋白质硝基化都伴随着蛋白质氧化的存在。

不同因素对胰岛素硝化的影响

生物体内一氧化氮和超氧阴离子(.O2-)快速反应生成的过氧亚硝酸根离子(ONOO-)是一种强细胞毒性物质,它能够硝化胰岛素的酪氨酸残基。采用UV-Vis和Native-PAGE等方法,在体外研究了不同因素对ONOO-硝化胰岛素的影响。结果表明,在生理pH值条件下,CO2/HCO3-对胰岛素的硝化有催化作用,而葡萄糖和血清白蛋白以及一些抗氧化剂却对胰岛素的硝化有抑制作用。

MsrB1对ONOO^-诱导的人晶状体上皮细胞周期的影响

目的探讨蛋氨酸亚砜还原酶B1(methionine sulfoxide reductase B1,MsrB1)基因沉默对过氧亚硝酸根(ONOO-)诱导的人晶状体上皮细胞(human lens epithelial cells,HLEC)细胞周期的影响和ERK信号通路在其中的调节作用。方法将培养的HLEC分为两组:正常组和MsrB1基因沉默组,分别用0μmol·L-1、100μmol·L-1、200μmol·L-1和300μmol·L-1 ONOO-处理20 min后,继续培养12 h。用RT-PCR法检测MsrB1基因表达水平变化,流式细胞仪检测细胞周期水平变化,Western blot法检测MsrB1基因沉默和ONOO-对pERK表达水平的影响。结果 300μmol·L-1 ONOO-处理HLEC会导致MsrB1表达水平显著下降(P<0.01),当MsrB1基因沉默细胞经300μmol·L-1ONOO-处理后,MsrB1表达水平进一步显著下调(P<0.05)。经200μmol·L-1或300μmol·L-1 ONOO-处理,HLEC细胞周期分别阻滞在G2/M期和S期,当MsrB1基因沉默细胞经200μmol·L-1或300μmol·L-1 ONOO-处理后,更多的细胞阻滞在G2/M期或S期(P<0.05)。pERK检测结果表明,MsrB1基因沉默前后经ONOO-处理导致的细胞周期阻滞和pERK表达水平显著下降有关(P<0.01)。结论 ONOO-可以下调HLEC MsrB1表达水平,MsrB1基因沉默细胞经ONOO-处理,pERK表达水平显著下降,导致更多细胞阻滞在G2/M期和S期。

不同物质抑制胰岛素硝化的活性比较

生物体内NO和超氧阴离子快速反应生成的过氧亚硝酸根离子是一种强细胞毒性物质,可以硝化胰岛素酪氨酸残基。为了探讨不同物质对过氧亚硝酸根离子硝化胰岛素的抑制作用,建立了一种比较不同化合物抗胰岛素硝化相对活性大小的方法。结果表明,不饱和脂肪酸和一些抗氧化剂具有较高的抑制活性。

铁配合物对胰岛素硝化的影响

生物体内一氧化氮和超氧阴离子快速反应生成的过氧亚硝酸根离子是一种强细胞毒性物质,它能够硝化胰岛素酪氨酸残基.采用UV-VIS在体外研究了几种铁配合物对过氧亚硝酸根离子硝化胰岛素反应的影响,并对影响铁配合物催化活性的因素进行了讨论.在生理pH条件下,Fe3+DTPA和柠檬酸铁对硝化反应无明显影响,Fe3+EDTA可显著催化硝化反应.