GRIM-19表达对子宫颈癌HeLa细胞增殖的影响

目的:通过体内和体外实验探讨GRIM-19表达对子宫颈癌HeLa细胞增殖的影响。方法:采用脂质体转染法将GRIM-19重组质粒转染HeLa细胞,建立稳定表达GRIM-19的细胞株;采用RT-PCR和Western印迹法检测HeLa细胞转染GRIM19重组质粒前后GRIM-19 mRNA和蛋白水平的表达情况;应用MTT法检测各组细胞增殖水平,并将HeLa/con、HeLa/GRIM-19细胞接种到裸鼠皮下以检测荷瘤情况;同时对移植瘤检测其GRIM-19 mRNA及其下游STAT3 mRNA的表达水平。结果:建立稳定表达GRIM-19基因的HeLa/GRIM-19细胞株。RT-PCR结果显示GRIM-19基因在HeLa/GRIM-19细胞中mRHA表达明显增加,Western印迹法检测同样发现GRIM-19蛋白的表达显著升高,而STAT3的表达明显受到抑制。MTT检测结果显示HeLa/GRIM-19细胞增殖较HeLa/con明显减慢(P<0.05),其接种后肿瘤生长速度亦明显减慢(P<0.01)。移植瘤的RT-PCR结果表明GRIM-19表达升高、STAT3表达降低。结论:GRIM-19的表达可以抑制子宫颈癌细胞的增殖,可能作为子宫颈癌治疗的一个新靶点。

羧甲基壳聚糖温敏凝胶对小鼠L929细胞增殖的影响

目的:研究自制羧甲基壳聚糖温敏凝胶对小鼠肺成纤维细胞(L929)增殖的影响及其组织相容性。方法:用羧甲基壳聚糖(CMCS)与甘油磷酸盐(GP)互配,制备羧甲基壳聚糖温敏凝胶,22只小鼠分为正常对照组1只、空白对照组3只,2%凝胶组和5%凝胶组各9只。采用四甲基偶氮唑盐法(MTT)分别测定质量浓度为50、10、2、0.4、0.08倍的羧甲基壳聚糖温敏凝胶浸提液对体外培养的L929细胞的增殖情况;分别将2%和5%的温敏凝胶植入小鼠皮下,于3、7、14d处死,常规组织切片,HE染色观察凝胶周围组织的炎症反应。结果:培养24h^96h,0.4倍及0.08倍浸提液组与阴性和阳性对照组的OD值差异有统计学意义(P<0.05);培养48、72、96h后,除50倍浸提液组外其余各实验组与阴性和阳性对照组的OD值差异有统计学意义(P<0.05),其中0.4倍浸提液促细胞增殖作用最为明显;凝胶植入后前3d,实验组以急性炎症为主,随着时间的延长各实验组炎症细胞逐渐减少至消失。结论:羧甲基壳聚糖温敏凝胶对L929细胞有明显的促进作用,且具有良好的组织相容性,在牙周病治疗中具有潜在的应用价值。

利用DNA免疫技术制备抗登革2型病毒NS2B蛋白多克隆抗体

目的构建登革2型病毒(dengue virus serotype2,DV2)非结构蛋白NS2B的真核表达质粒pCAGGS-P7/NS2B,进行DNA免疫,制备小鼠抗NS2B特异性多克隆抗体。方法PCR扩增DV2-NS2B基因片段,构建真核表达载体pCAGGS-P7/NS2B,采用脂质体介导的方法转染Vero细胞,检测目标蛋白的表达。用该表达质粒免疫BALB/c小鼠,制备抗NS2B抗血清。结果成功构建真核表达重组质粒pCAGGS-P7/NS2B,该重组质粒具有良好的免疫原性,免疫小鼠后所获的抗血清,抗体效价达1∶3200,Western blot和间接免疫荧光证实抗血清能特异性地识别DV2-NS2B蛋白。结论通过DNA免疫所制备小鼠抗DV2-NS2B抗血清能特异性地识别DV2-NS2B蛋白。

血管生成抑制剂SU6668联合5-Fu对人结肠癌裸鼠移植瘤肝转移的影响

目的:探讨血管生成抑制剂SU6668联合5-Fu对人结肠癌肝转移的抑制作用。方法:将结肠癌HT-29细胞注入裸鼠脾脏,建立结肠癌肝转移模型。将裸鼠随机分为联合治疗组、SU6668组、5-Fu组和对照组4组。治疗6周后,处死裸鼠,计数肝转移率和肝转移结节数。采用免疫组化SABC法和图像分析系统对肝转移肿瘤组织的微血管密度(microvessel density,MVD)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(base fibroblast growth factor,bFGF)的表达进行定量分析。结果:各组转移率依次下降,差异有统计学意义(P<0.01);在肝转移结节数目比较上,对照组结节数大于20个时各组裸鼠所占比例差异有统计学意义(P<0.01)。联合治疗组和SU6668组分别与5-Fu组及对照组相比,MVD均显著减少(P<0.05)。联合治疗组、SU6668组、5-Fu组与对照组比较,VEGF、bFGF均显著降低,且联合治疗组、SU6668组、5-Fu组3组间差异有统计学意义(P<0.05)。结论:SU6668通过抗血管生成抑制结肠癌的肝转移,与5-Fu联合应用具有协同效应,为安全有效的抗肿瘤策略。

白眉蝮蛇蛇毒中L-氨基酸氧化酶的分离及其诱导急性肺损伤的作用

目的:从白眉蝮蛇蛇毒分离纯化L-氨基酸氧化酶,并研究其对肺组织的影响.方法:通过Heparin-Sepharose FF及Q-Sepharose HP从白眉蝮蛇蛇毒中分离纯化得到一个L-氨基酸氧化酶,命名为ABU-LAO.给Balb/c小鼠静脉注射50,5,0.5μg药物或生理盐水100μL,每组6只,6 h或24 h后取材,肺组织常规切片,HE染色.高倍镜视野下计算平均红细胞数(RBCs)、平均肺泡内多形核白细胞数(IAPLs)、平均肺泡隔多形核白细胞数(ASPLs);用图像分析仪测平均肺泡面积(MACA).结果:纯化ABU-LAO并在SDS-PAGE上测定其表观M r约为60000.与生理盐水组相比RBCs,IAPLs,ASPLs,MACA在注射ABU-LAO后有显著改变(P<0.0125).结论:通过两步层析法分离纯化得到ABU-LAO,它能诱导小鼠发生严重的急性肺损伤.

核因子κB抑制剂与多烯紫杉醇联合治疗未分化甲状腺癌的体内研究

目的：研究核因子κB（NF-κB）抑制剂DHMEQ和多烯紫杉醇联合治疗未分化甲状腺癌（ATC）的效果。方法：将裸鼠随机分为多烯紫杉醇组、DHMEQ组、联合用药组和对照组,每组6只,于两髋外侧皮下分别接种细胞数目为5×106的ATC细胞系FRO,在2周时间内将药物进行腹腔内注射,多烯紫杉醇用量为每天5mg/kg（第5和12天腹腔内注射）,DHMEQ用量为每天6mg/kg（第5~18天腹腔内注射）,动物实验的整个观察周期为32d。在第19天从不同治疗组中抽取1只裸鼠处死,取下瘤体做TUNEL凋亡染色。结果：在接受不同方案治疗后,4组裸鼠的荷瘤体积均随着接种天数的增加而增加,不同处理因素、不同处理时间及交互作用差异具有统计学意义（F处理=54.05,F时间=300.18,F交互=70.06,均P〈0.01）。染色结果显示联合用药较单独用药的染色阳性凋亡细胞数多。4组细胞凋亡指数差异有统计学意义,多烯紫杉醇组和DHMEQ组的凋亡指数皆高于对照组,联合用药组的凋亡指数高于多烯紫杉醇组和DHMEQ组,差别均有统计学意义（均P〈0.01）。结论：联合应用NF-κB抑制剂和多烯紫杉醇治疗ATC肿瘤可以更有效地抑制瘤体的增长,获得协同治疗的效果。

过继转移FasL基因修饰的树突细胞对小鼠自然流产模型胚胎丢失的影响

目的：观察过继转移FasL基因修饰的树突细胞（DC）对小鼠自然流产模型胚胎丢失的影响，探讨它在诱导妊娠免疫耐受中的作用。方法：构建鼠源FasL（mFasL）真核表达载体pcDNA3．1-mFasL，用电转染法将它转染给DBA／2雄鼠骨髓来源的DC，将转染成功的mFasL-DC于交配前经腹腔注射给CBA／J母鼠。实验动物分为6组：（1）正常妊娠模型组（CBA／J×BALB／c）；（2）未添加干预的流产模型组（CBA／J×DBA／2）；（3）转输DC培养基（DCCM）的流产模型组；（4）转输单纯DC（DC）的流产模型组；（5）转输转染空质粒DC的流产模型组；（6）转输转染mFasL质粒DC的流产模型组，于妊娠第12～14天观察孕鼠胚胎丢失率。结果：转输mFasL—DC后孕鼠胚胎丢失率明显低于未添加干预或转输DC培养基的流产模型组（P〈0．01），与转输单纯DC或带空质粒的DC组相比，其胚胎丢失率也明显下降（P〈0．05），它与正常妊娠组相比胚胎丢失率无显著差异（P〉0．05）；转输单纯DC或空质粒的DC组与未添加干预流产模型组相比胚胎丢失率有所下降，但没有统计学差异；转输DC培养基组与未加干预组之间胚胎丢失率无统计学差异（P〉0．05）。结论：过继转移mFasL-DC能诱导妊娠免疫耐受，降低小鼠自然流产模型孕鼠胚胎丢失率。

恩度联合放疗对鼻咽癌裸鼠成瘤的抑制作用及机制

目的:观察恩度联合放疗对鼻咽癌裸鼠成瘤的抑制作用及对血管内皮生长因子(VEGF)和生存素SurvivinmRNA表达的影响。方法:建立鼻咽癌裸鼠成瘤模型,成瘤后随机分为对照组、恩度组、放疗组和恩度+放疗联合组(联合组),观察各组移植瘤的生长速度和瘤体大小的变化。4周后处死裸鼠摘取瘤体,电镜观察各组肿瘤凋亡情况,应用实时荧光定量PCR检测各组瘤体组织中的VEGF和Survivin mRNA的表达水平。结果:联合组肿瘤体积增长受到明显抑制,对照组生长迅速,恩度组与放疗组居中。恩度组、放疗组和联合组的VEGF表达水平均低于对照组,联合组低于放疗组,差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01),放疗组和联合组的Survivin表达水平均低于对照组,联合组低于放疗组,差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。成瘤组织中VEGF与Survivin的表达呈正相关(r=0.679,P<0.01)。结论:恩度联合放疗能明显抑制鼻咽癌裸鼠移植瘤的生长,这种作用可能与VEGF和Survivin表达下调有关。

移植途径对骨髓间充质干细胞调节小鼠心脏移植排斥反应的影响

目的探讨不同途径注射骨髓间充质干细胞(BMSCs)对调节小鼠心脏移植排斥反应的影响。方法 BALB/c和C57小鼠分别作为供体和受体,建立颈部心脏移植模型,随机分为4组,每组12只,A组在移植成功后立即经移植心脏升主动脉注射C57来源绿色荧光BMSCs悬液30μL(含1×10~6细胞),B组同样时间点经移植心脏右心室腔内注射相同数量细胞,C组同样时间点移植心脏心肌内注射相同数量细胞,D组为空白对照组。移植后第7天各组处死4只小鼠,切取移植心脏,荧光显微镜下观察绿色荧光细胞的存活情况,HE染色观察移植心脏的病理学改变,流式细胞学检测移植物浸润白细胞中巨噬细胞的比例,其余8只小鼠用来观察移植心脏的存活时间。结果术后第7天,仅A组移植心脏内可见绿色荧光细胞,病理学检测发现A组排斥反应受到明显抑制,心肌间质内细胞浸润明显减少,局灶性的心肌细胞损害,B组和C组移植心脏间质内可见多灶性淋巴细胞浸润并伴有心肌细胞变性坏死,而D组小鼠心脏见满视野大量白细胞浸润,心肌结构消失,心肌坏死。流式细胞学检测发现A组移植心脏内巨噬细胞的比例明显高于其他3组,A组的心脏存活时间明显长于其他3组。结论 BMSCs能减轻心脏移植排斥反应,动脉途径注射优于静脉和心肌局部注射途径,其机制可能与骨髓间充质干细胞在移植心脏内存活时间以及巨噬细胞比例增加有关。

Syndecan-1在小鼠结肠炎模型中的表达和意义

背景:Syndecan-1是一种由硫酸乙酰肝素链和硫酸软骨素链修饰的Ⅰ型跨膜蛋白,主要表达于上皮细胞和内皮细胞,与炎症发生的各个环节均有密切联系。目的:观察结肠炎模型小鼠结肠组织中Syndecan-1的表达,探讨其在炎症性肠病(IBD)中的作用。方法:以三硝基苯磺酸(TNBS)-乙醇溶液灌肠诱导小鼠结肠炎模型。于造模后3、7、14、21d分批处死各组小鼠,于光学显微镜下观察结肠组织学改变并评分;分别以逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫组化方法检测结肠组织Syndecan-1mRNA和蛋白水平的表达。结果:各模型组结肠组织学评分均显著高于正常对照组(P<0.01),以造模后第3d最高,其后逐渐减低。各模型组结肠组织Syndecan-1mRNA表达水平与正常对照组相比差异无统计学意义,但蛋白表达评分均显著低于正常对照组(P<0.01),以造模后第3d最低,其后逐渐回升。结论:结肠组织Syndecan-1蛋白表达与模型小鼠结肠炎病变严重程度有关,有可能成为IBD诊治和病情监测的指标之一。

高表达IDO的树突状细胞抑制T细胞增殖的实验研究

目的:研究基因转染后高表达吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)的树突状细胞(DC)对T细胞增殖的抑制作用,以探讨其在器官移植中排斥反应的作用。方法:采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)从腹膜炎小鼠的小肠组织中获取IDO全长cDNA片段,将其克隆至真核表达质粒pTracer中,构建真核表达质粒IDO-pTracer,随后用LipofectamineTM2000介导转染小鼠脾脏DC,分为未转染组、空载体转染组、IDO基因转染组和IDO基因转染并添加1-甲基色氨酸(1-MT)组,以混合淋巴细胞反应的方法检测转染后DC对同种异系T细胞增殖的作用。结果:克隆的小鼠IDO基因全长cDNA大小约1.3kb,无碱基突变,以构建的重组真核表达质粒IDO-pTracer转染DC后,混合淋巴细胞反应结果显示IDO基因转染组的刺激指数(SI)低于未转染组、空载体转染组及IDO基因转染并添加1-MT组,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:成功构建了IDO基因的真核表达载体IDO-pTracer,且IDO基因转染DC具有抑制异系T细胞增殖的作用。

人生长激素对乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响

目的:探讨人生长激素对人乳腺癌细胞株MCF-7增殖和凋亡的影响。方法:建立乳腺癌裸鼠移植瘤模型,将40只裸鼠随机分为:对照组、重组人生长激素(rhGH)组、5-氟尿嘧啶(5-FU)组和rhGH+5-FU组,各组腹腔注射给药,2周后观察各组药物对肿瘤生长的影响。分别采用MTT法和免疫组化检测肿瘤细胞增殖,TUNEI法检测移植瘤组织的细胞凋亡。结果:5-FU组和rhGH+5-FU组的肿瘤质量、PI及S期的人乳腺癌细胞数均明显小于对照组(P<0.01),AI、G0/G1期人乳腺癌细胞数均明显大于对照组(P<0.05或P<0.01);rhGH+5-FU组的PI及G2M期人乳腺癌细胞数均明显小于5-FU组(P<0.05)。结论:人生长激素在体内对人乳腺癌细胞既无明显的增殖作用,也无明显的凋亡作用,但与5-FU联用后能增强化疗对MCF-7乳腺癌细胞的效果,且具有协同作用。

单纯疱疹病毒Ⅱ型gD糖蛋白核酸疫苗的构建及免疫观察

目的:构建用于防治单纯疱疹病毒Ⅱ型(HSV-Ⅱ)引起的生殖器疱疹的DNA疫苗,并探讨其免疫保护作用。方法:利用PCR法从HSV-ⅡSav株中扩增出gD糖蛋白基因的全部编码序列,将其插入pcDNA3中,构建HSV-IIgD核酸疫苗,用PCR法、酶切法和测序法进行鉴定;将重组质粒转染COS-7细胞,用原位ELISA检测表达产物;对BALB/c小鼠进行肌肉免疫,用微量细胞中和试验、ELISA、脾T淋巴细胞增殖反应和病毒攻击试验检测免疫效果。结果:构建的HSV-ⅡgD核酸疫苗具有良好的免疫原性,对小鼠具有保护作用。结论:本实验成功构建出了具有免疫防御效应的HSV-ⅡgD核酸疫苗。

盐溶法构建磨损颗粒诱导小鼠颅骨溶解模型方法的建立及评价

目的:探讨构建新型磨损颗粒诱导的骨溶解模型,为研究人工关节无菌性松动提供简单、方便的实验动物模型。方法:制备无菌盐包埋磨损颗粒;采用随机数字表法将50只BALB/c小鼠分为空白对照组、纯盐组、气囊植骨组和盐包埋磨损颗粒组,其中气囊植骨组20只,其他各组10只;气囊植骨组小鼠术后21d,余3组术后14d获取小鼠颅骨组织标本,HE染色观察炎细胞渗出量和骨溶解面积;扫描电镜观测骨片吸收陷窝面积百分比;抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色检测破骨细胞增殖分化。结果:HE染色,与空白对照组和纯盐组比较,气囊植骨组和盐包埋磨损颗粒组小鼠的炎性细胞渗出量、骨溶解面积明显增大(P<0.01);与气囊植骨组比较,盐包埋磨损颗粒组小鼠TRAP染色破骨细胞数量明显增多(P<0.01);扫描电镜观察,盐包埋磨损颗粒组小鼠骨片吸收陷窝面积百分比显著高于气囊植骨组(P<0.01)。结论:盐溶法是一种简单、经济、快速准确的构建小鼠颅骨溶解模型方法,能够真实模拟人工关节松动发生的病理过程。

蒿鳖养阴软坚方对ConA诱导小鼠肝纤维化的预防作用

目的:探讨蒿鳖养阴软坚方对伴刀豆球蛋白A(ConA)诱导小鼠肝纤维化的预防作用。方法:94只Balb/c小鼠根据体质量采用随机区组法分为7组,正常组8只,模型组16只,蒿鳖养阴软坚方高、中、低剂量组,复方鳖甲软肝片组和秋水仙碱组各14只。采用尾静脉注射ConA制备小鼠肝纤维化模型,以蒿鳖养阴软坚方作为预防用药。采用HE染色及胶原染色法观察肝组织形态;盐酸水解法测定肝组织胶原蛋白的含量;放射免疫法测定血清透明质酸(HA)和Ⅲ型前胶原(PCⅢ)水平。结果:模型组肝纤维化程度分期及计分均高于正常组(P<0.01),中、低剂量组肝纤维化程度分期均低于模型组(P<0.05)。模型组肝组织胶原蛋白含量高于正常组(P<0.01),高、中、低剂量组肝组织胶原蛋白含量皆明显低于模型组(P<0.05或P<0.01)。结论:蒿鳖养阴软坚方对ConA诱导小鼠肝纤维化具有预防作用。

血管内皮生长因子受体-3抗体对人喉鳞癌裸鼠移植瘤生长的影响

目的探讨血管内皮生长因子受体-3(VEGFR-3)抗体对人喉鳞癌裸鼠移植瘤是否具有生长抑制作用。方法利用人喉鳞癌细胞株Hep-2细胞建立裸鼠喉癌模型,分成2组,每组12只,瘤周注射用药。观察肿瘤体积,生长曲线以及抑瘤率。结果 VEGFR-3抗体可以引起荷瘤体积和质量的减少,较0.9%氯化钠注射液对照组差异有统计学意义(t=11.64,P<0.05)。VEGFR-3抗体组抑瘤率为48.21%。结论阻断VEGFR-3受体有望成为喉癌淋巴结转移预防和治疗的潜在靶点。

小鼠腹水IgG类单克隆抗体的制备及活性研究

目的探讨小鼠腹水IgG类单克隆抗体制备及盐析法纯化的最佳条件。方法依次研究诱导剂、小鼠鼠龄及性别对小鼠腹水抗体产量和活性的影响;分别用辛酸-硫酸铵法(CA-AS)、硫酸铵沉淀法(AS)粗提小鼠腹水,比较两种方法所得粗提抗体的活性及IgG回收率。结果弗氏不完全佐剂(Freund’s incomplete adjuvant,FIA)预处理10～12周龄Balb/c小鼠可显著提高小鼠腹水产量;腹水经CA-AS法纯化后抗体效价为1:3.2×104,IgG回收率为50%～60%,优于AS法。结论弗氏不完全佐剂预处理10～12周龄Balb/c小鼠制备腹水,然后用CA-AS法纯化。

登革2型病毒粘附人血小板的体外研究初探

目的:了解登革2型病毒(DEN-2)是否能在体外粘附人血小板并制备抗人血小板抗体。方法:密度梯度离心法分离血小板,DEN-2与血小板体外共孵育2 h,间接免疫荧光法分析DEN-2粘附人血小板情况。采用TritonX-100裂解法制备血小板蛋白并经皮下注射免疫BALB/C小鼠获取抗血小板血清,经Western blot、间接免疫荧光及间接ELISA对抗血清进行鉴定及效价测定。结果:间接免疫荧光法提示DEN-2可体外粘附人血小板;Western blot、间接免疫荧光法表明获得特异性抗人血小板抗体,间接ELISA测定抗体效价可达到1∶12 800。结论:DEN-2能够在体外粘附人血小板,血小板蛋白免疫BALB/C小鼠后可产生较高效价的抗人血小板抗体,为今后研究血小板在DEN-2感染中的免疫学功能奠定一定的基础。

免疫磁珠分离法分选提纯骨髓造血干细胞CD117

目的:探讨用免疫磁珠分离法(magnetic activated cell sorting,MACS)从小鼠股骨、胫骨分离纯化骨髓造血干细胞CD117的方法。方法:收集小鼠骨髓细胞,台盼蓝染色观察其活力,用免疫磁珠分离法分选CD117细胞,流式细胞仪检测荧光标记CD117表达阳性率。结果;未分选前CD117细胞纯度为(41.56±18.77)%,MACS分选CD117细胞纯度(88.68±4.74)%,纯化前后有明显差异(P<0.05)。结论:MACS阳性选择法分选系统能有效分选骨髓造血干细胞CD117。

内分泌—免疫系统相互关系的研究——Ⅰ.甲状腺素对荷瘤鼠及免疫损伤鼠免疫功能的调节

本研究证实,S_(130)肉瘤(腹水型)、肝癌及CCl_4慢性中毒致免疫功能损伤的BALB/C小鼠均伴有血清T_3,T_4明显降低。用小剂量甲状腺片1.2(μg·g)/d治疗后,见血清T_3,T_4逐渐恢复,并伴有巨噬细胞-胸腺淋巴细胞受体活性变化、吞噬活性升高,脾NK细胞自然杀伤效应增强及溶血素抗体测定OD值增高等免疫指标的改变。表明小剂量甲状腺素对免疫损伤鼠及荷瘤鼠有免疫调节的生物活性作用。