血清成纤维细胞生长因子-21、亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性与妊娠期亚临床甲状腺功能减退症的相关性

目的 探究血清成纤维细胞生长因子-21(FGF-21)、亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因多态性与妊娠期亚临床甲状腺功能减退症(SCH)的相关性。方法 选取2022年7月至2023年7月山西省临汾市人民医院收诊的妊娠期SCH患者106例为SCH组,另选取院内同期孕检的健康妊娠期女性106例为健康组。收集两组病历资料,筛查SCH的相关因素,分析血清FGF-21、MTHFR基因多态性对SCH发生的评估效能。结果 SCH组的空腹血糖、血清促甲状腺素(TSH)、FGF-21高于健康组(P<0.05);两组CC、CT、TT基因型分布频率比较,差异有统计学意义(P<0.05)。SCH组T等位基因分布频率高于健康组(P<0.05)。多因素分析结果显示,血清FGF-21(OR=3.330,95%CI:1.138~9.743)、MTHFR基因多态性(OR=4.104,95%CI:1.403~12.008)是SCH发生的影响因素(P<0.05)。血清FGF-21、MTHFR基因多态性单一及联合诊断SCH发生的受试者操作特征曲线下面积分别为0.738、0.670、0.851。结论 血清FGF-21水平升高、MTHFR基因TT基因型的妊娠期女性SCH发生风险更高,两项联合具有一定的诊断价值。

育龄期不明原因复发性流产的高危因素及其与亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性的关系

目的 分析育龄期不明原因复发性流产(URSA)的高危因素及其与亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因多态性的关系。方法 选择2020年6月~2023年5月浙江省海宁市第二人民医院确诊的育龄期URSA妇女93例(URSA组),另选择同期正常妊娠育龄期妇女99例(非URSA组)。根据临床经验并参考相关文献收集可能影响育龄期不明原因复发性流产的高危因素,包括年龄(<35岁、≥35岁)、BMI(<18.5kg/m^(2)、18.5~24kg/m^(2),>24kg/m^(2))、受教育年限(初中及以下、初中以上)、吸烟史、饮酒、孕期补充叶酸史、家庭人均月收入(<3000元、≥3000元)、人工流产史、职业类型(脑力为主、体力为主)、居住地(农村、城镇)、MTHFR基因多态性(CC、CT、TT)。通过单因素和多因素Logistic回归分析法分析育龄期妇女URSA发生的高危因素。结果 MTHFR基因C677T位点TT型、受教育程度为初中及以下、有人工流产史为育龄期妇女URSA的高危因素(OR分别为1.763、1.740、2.149,P<0.05或P<0.01),孕期补充叶酸为育龄期妇女URSA的保护因素(OR=0.569,P<0.01)。结论 育龄期妇女发生URSA与MTHFR基因多态性密切相关,相关影响因素包括MTHFR基因C677T位点TT型、受教育年限为初中及以下、有人工流产史、孕期未补充叶酸,可作为临床干预的参考。

光/氧化还原酶协同催化的不对称合成研究进展

氧化还原酶是一类重要的酶,它可以将氧化还原反应进行转换。含有黄素和烟酰胺的酶如酮还原酶、烯烃还原酶等氧化还原酶可以在光能的激发下产生自由基中间体,从而引发进一步的转化反应,还能引发酶的非天然反应活性,获得新酶催化功能。这种光/氧化还原酶协同催化比单一的光催化和酶催化更能实现具有挑战性的反应。光/酶协同催化研究虽然处于发展的初期,但是在可见光与烯烃还原酶催化解锁酶的非天然反应研究领域展现出了广阔的应用前景。本文围绕光/氧化还原酶协同催化的不对称合成应用,重点介绍了其在烯烃异构化/不对称还原反应、α-乙酰氧基苯并环己酮的不对称还原反应、烯烃/酮/烯酰胺的不对称还原反应、β-烷基取代的环己酮原位消旋化/不对称还原反应和分子内/分子间的不对称氧化还原偶联反应方面的相关研究进展。

烯还原酶不对称还原(R)-香芹酮的研究

(2R,5R)-二氢香芹酮是一种重要的手性中间体,可用于合成多种活性化合物,常采用不对称还原(R)-香芹酮的方法合成。相较于化学方法,烯还原酶催化还原(R)-香芹酮不需要危险的氢气、贵金属催化剂和高温等苛刻的条件,且来源于Corynebacterium casei的烯还原酶(CcER)能有效地还原(R)-香芹酮产生(2R,5R)-二氢香芹酮。考察了pH、反应温度、辅酶NAD~+浓度和辅底物葡萄糖浓度对反应的影响,研究表明最佳反应条件为pH 8、反应温度30℃、NAD^(+)浓度0.6 mmol/L、葡萄糖浓度30 mmol/L;反应6 h后,(R)-香芹酮的转化率可达96%,产物(2R,5R)-二氢香芹酮的光学纯度可达95%;烯还原酶催化能力强,具有生产(2R,5R)-二氢香芹酮的潜力。

在牙周炎治疗中应用黄嘌呤氧化还原酶抑制剂的应用前景

牙周炎是临床上常见的一种慢性炎症性疾病,影响着全球数亿人口。目前临床上,对于牙周炎的治疗方法虽然在不断更新与改进,但由于该病发病机制复杂,治疗难度较大。牙周炎主要与嘌呤代谢有关,其中,黄嘌呤氧化还原酶(XOR)在牙周炎的发病机制中扮演着重要角色。本文通过文献回顾,发现XOR抑制剂具有抗氧化、抗炎和抗骨质疏松的效应,并且在治疗感染性、炎症性和溶骨性疾病的临床实践中已显示出效果。尽管目前缺乏直接证据表明XOR抑制剂能改善牙周微生态失衡,但它们能够调节肠道菌群失衡,并且有间接证据支持其对牙周微生态有益。因此,XOR抑制剂可能作为免疫调节剂,通过抑制炎症、氧化应激和抗破骨作用,对牙周炎的治疗发挥辅助作用。

H型高血压急性缺血性脑卒中患者亚甲基四氢叶酸还原酶C677T基因多态性及其与肾功能的相关性

目的观察H型高血压急性缺血性脑卒中患者亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)C677T的基因多态性,分析其与H型高血压急性缺血性脑卒中患者肾功能的相关性。方法选择153例H型高血压急性缺血性脑卒中患者为观察组,同期158例非H型高血压急性缺血性脑卒中患者为对照组。两组均采集外周静脉血,采用PCR扩增和微阵列技术检测MTHFR C677T基因型,测算全身免疫炎症指数(SII),采用日立7600型全自动生化分析仪检测两组血清肌酐,据此测算肾小球滤过率(eGFR)。采用多元线性回归分析法分析MTHFR C677T基因型与H型高血压急性缺血性脑卒中患者同型半胱氨酸(Hcy)、eGFR的相关性,采用Spearman相关分析法分析SII与H型高血压急性缺血性脑卒中患者eGFR、Hcy的相关性。结果与对照组相比,观察组患者TT基因型分布频率最高,T等位基因频率最高(χ^(2)分别为19.188、5.138,P均<0.05)。观察组、对照组患者SII分别为583.54(384.97,903.73)、425.03(310.26,583.16),二者相比,P<0.05。与CC、CT基因型比较,TT基因型的H型高血压急性缺血性脑卒中患者血清Hcy水平高,eGFR水平低(F分别为28.544、3.749,P均<0.05)。MTHFR C677T TT基因型与H型高血压急性缺血性脑卒中患者血清Hcy呈正相关(β=4.173,P<0.05),与eGFR呈负相关(β=-6.559,P<0.05)。SII与H型高血压急性缺血性脑卒中血清Hcy水平呈正相关(r=0.226,P<0.05),与eGFR呈负相关(r=-0.129,P<0.05)。结论H型高血压急性缺血性脑卒中患者MTHFR C677T基因型主要为TT型。MTHFR C677T TT基因型的H型高血压急性缺血性脑卒中患者可能更易引起肾功能下降。

精胺氧化酶靶向调控硫氧还蛋白还原酶1促进结肠癌恶性进展

目的探讨精胺氧化酶(spermine oxidase,SMOX)靶向调控硫氧还蛋白还原酶1(thioredoxin reductase 1,TR1)对结肠癌恶性进展的影响。方法收集2018年9月至2019年6月就诊于南京市第一医院的30例结肠癌患者的结肠癌组织及其癌旁组织。采用免疫组织化学染色检测组织中的SMOX表达。采用Western blot实验检测结肠癌细胞株(HCT116、SW480、DLD-1、SW620、Caco-2、HCT-15、T84和LS123)和正常结肠细胞株NCM460的SMOX表达。利用基因表达谱互作分析(Gene Expression Profiling Interactive Analysis,GEPIA)网站查询SMOX在结肠癌组织与癌旁组织中的表达情况和SMOX表达水平与患者总生存的关系。采用Western blot实验检测上述细胞和组织中代谢产物亚精胺合成酶的水平。利用2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯(2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate,DCFH-DA)结合流式细胞术和组织免疫荧光实验分别检测结肠细胞和组织中代谢副产物活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平。选取SMOX表达水平最高的结肠癌细胞株HCT116和SW480为实验对象,构建慢病毒载体,用PLKO.1-puro-shCtrl、PLKO.1-puro-shSMOX、PLKO.1-puro-shSMOX+pcDNA3.1和PLKO.1-puro-shSMOX+pcDNA3.1-TR1分别转染细胞,分别为shCtrl组、shSMOX组、shSMOX+pcDNA3.1组和shSMOX+TR1组。Western blot实验检测HCT116和SW480细胞shCtrl组和shSMOX组SMOX与TR1的表达情况,以及HCT116细胞shSMOX+pcDNA3.1组和shSMOX+TR1组的TR1表达水平。利用细胞计数试剂盒(Cell Counting Kit-8,CCK-8)检测细胞增殖活力。碘化丙啶(propidium iodide,PI)单染结合流式细胞术检测肿瘤细胞周期变化。PI/异硫氰酸荧光素-膜连蛋白(PI/fluorescein isothiocyanate-Annexin V,PI/FITC-Annexin V)双染结合流式细胞术检测细胞凋亡/坏死情况。Transwell体外侵袭实验分析细胞侵袭能力。shCtrl组、shSMOX组、shSMOX+pcDNA3.1组和shSMOX+TR1组的HCT116细胞稀释至浓度为1×107个/mL的细胞悬液分别向裸鼠右侧腋窝皮下注射0.2 mL细胞悬液,建立裸鼠结肠癌移植瘤模型。4周后处死裸鼠,分离组织,剥取肿瘤称重。运用免疫组织化学染色检测裸鼠结肠肿瘤组织中Ki-67阳性细胞数。结果SMOX在8种结肠癌细胞株和结肠癌组织中的表达水平均高于正常结肠细胞株和癌旁组织,且与不良预后有关(均P<0.05)。与正常结肠细胞和癌旁组织比较,8种结肠癌细胞和结肠癌组织中的代谢产物亚精胺合成酶和ROS水平随SMOX的高表达同步升高(均P<0.05)。与shCtrl组比较,shSMOX组G_(0)/G_(1)期细胞数目增多,PI/Annexin V双阳性细胞数目增加,细胞增殖活性降低,侵袭数量减少,SMOX和TR1表达水平降低(均P<0.05)。与shSMOX组和shSMOX+pcDNA3.1组比较,shSMOX+TR1组TR1表达水平升高,S期细胞数目增多,PI/Annexin V双阳性细胞数目减少,细胞增殖活性升高(均P<0.05)。裸鼠结肠癌移植瘤模型显示,注射后14 d,与shCtrl组比较,shSMOX组和shSMOX+pcDNA3.1组肿瘤体积和重量均降低,结肠肿瘤组织中Ki-67阳性细胞数减少,而shSMOX+TR1组肿瘤体积、重量和结肠肿瘤组织中Ki-67阳性细胞数则较shSMOX+pcDNA3.1组增加(均P<0.05)。结论SMOX在结肠癌细胞和组织中表达上调,可能通过靶向提高TR1的表达促进细胞周期运转,抑制细胞凋亡,促进细胞增殖和侵袭能力及肿瘤生长,进而促进结肠癌恶性进展。

华法林耐药突变体减弱人维生素K环氧化物还原酶与华法林的结合能力

目的探讨人维生素K环氧化物还原酶(VKORC1)耐药突变体对华法林耐药的机制。方法利用与华法林结合导致VKORC1电泳迁移率变化的原理进行电泳迁移实验,并通过酶联免疫吸附实验检测VKORC1的活性和华法林抑制VKORC1的半抑制浓度(IC_(50)),评价VKORC1耐药突变体与华法林的结合能力。结果华法林与VKORC1结合后,保护其柔性跨膜螺旋1(TM1)中的一个半胱氨酸免受N-乙基马来酰亚胺(NEM)的修饰,从而增加VKORC1的电泳迁移率。增加华法林浓度可以增加具有快速迁移效应的VKORC1。与野生型VKORC1相比,华法林耐药突变体的快速迁移效应减弱或消失,表明华法林与耐药突变体的结合能力减弱;且突变体快速迁移效应越弱,其对华法林的耐药性越强。结论VKORC1耐药突变体与华法林的结合能力减弱是华法林耐药的主要原因。

大豆谷胱甘肽还原酶基因的扩增及连作胁迫应答

利用数据库Phytozome获得大豆胱甘肽还原酶(Glutathione reductase,GR)基因4个成员的编码序列(Coding sequence,CDS)序列,以大豆叶片和根中RNA为模板,经RT-PCR扩增获得Glyma10g03740和Glyma02g16010基因,二者大小均为1638 bp,基因结构相似;获得Glyma16g27210和Glyma02g08180基因,二者结构相似,基因大小均为1506 bp。系统进化分析显示,Glyma10g03740/Glyma02g16010和Glyma16g27210/Glyma02g08180蛋白聚类于不同分支,但分别都与豇豆、尖叶菜豆和芸豆亲缘关系最近。4个成员的结构域相同,均含有FAD/NAD-binding_dom结构域和Pyr_nucl-dis_OxRdtase_dimer结构域。三级结构显示Glyma16g27210和Glyma02g08180构象相似,Glyma10g03740和Glyma02g16010构象相似,4个蛋白均以二聚体结构存在,互作蛋白完全相同,包括2个硫氧还蛋白还原酶和8个硫氧还蛋白。RT-qPCR方法分析GRs基因对连作逆境的响应,结果显示,在连作胁迫下,敏感品种HF55的GRs基因表达在根中启动较早(出苗后15 d内),而叶片中启动较晚,出苗后45 d时表达仍呈上升趋势;对于抗性品种KX8,根和叶片中GRs基因各成员均在出苗后15~45 d表达量达到最高,30 d时根中GRs基因总表达量增加达19.03倍,叶片中GRs基因总表达量增加2.50倍。

杧果铁还原酶(FRO)编码基因的鉴定与表达模式分析

铁(Fe)是植物生长发育的必需微量元素之一,参与植物体内多种生命活动和代谢过程。有关铁素吸收、转运和分配吸收的分子机制研究主要体现在一年生模式作物,果树中铁吸收与转运相关基因的生物学功能依然未知。本研究从二倍体杧果桂热82中克隆并鉴定了11个铁还原酶(FRO)编码基因,命名为MiFRO1~MiFRO11;除MiFRO1缺失Motif2~Motif5基序外,其他MiFROs均含有10个典型的Motif基序,除MiFRO3具有独特的三级结构外,其他MiFROs拥有相近的三级结构;11种不同科、属植物FRO蛋白的氨基酸水平一致性约为42.07%,MiFROs的氨基酸水平一致性约为62.43%;系统进化树表明MiFROs倾向于单独聚集在一起,在系统发育树上与其他10种植物的同源蛋白进化距离较远;实时荧光定量PCR表明MiFRO8在杧果树体中的整体表达水平最高,MiFRO4、MiFRO5、MiFRO8和MiFRO11在成年树体新生叶片和嫁接苗叶片中的表达量最高,MiFRO6和MiFRO7在成年树体新生韧皮部和嫁接苗茎部的表达水平最高,MiFRO1和MiFRO10在幼果的表达水平最高,MiFRO2和MiFRO9在嫁接苗根部的表达量最高,而MiFRO3在盛开期花朵中的表达量最高。此外,MiFROs在根部易受缺铁和NaCl胁迫的诱导而显著增加;MiFRO3、MiFRO5和MiFRO8受高铁毒害的抑制,表达量降低;MiFRO2、MiFRO5、MiFRO7受ABA胁迫,其表达量增加;MiFRO1、MiFRO5受PEG胁迫,其表达量增加,MiFRO2、MiFRO6和MiFRO7受低温(4℃)抑制,其表达量降低,但MiFROs对热胁迫(45℃)不敏感。本研究为明确杧果铁的吸收与转运机制提供基因资源,并为解析热带作物果树铁素营养与高效利用奠定理论基础。

重组鼠过氧化物还原酶-5体内抗胰腺癌作用研究

目的:探讨鼠源重组过氧化物还原酶-5(mPRDX5)在小鼠体内是否具有抗肿瘤活性,从而进一步确证PRDX5的抗肿瘤活性和作用机制。方法:通过体外异源表达和纯化获得高纯度的mPRDX5。小鼠左侧腋背部皮下接种胰腺癌Pan02细胞建立荷瘤小鼠模型。小鼠随机分为PBS(溶剂对照)组、GEM(吉西他滨)50.0 mg/kg组和mPRDX510.0 mg/kg组,每组10只,检测小鼠肿瘤相关指标。结果:与PBS组比较,GEM组荷瘤小鼠体质量降低明显,mPRDX5组小鼠体质量有一定程度的增加。PBS组肿瘤生长良好,根据肿瘤体积计算,与PBS组相比,GEM组、mPRDX510.0 mg/kg组在D7肿瘤生长抑制率分别为87.07%和52.82%;按瘤重计算,与PBS组相比,GEM组、mPRDX510.0 mg/kg组在D7肿瘤生长抑制率分别为95.39%和48.33%。对PBS组和mPRDX5组小鼠肿瘤组织中的巨噬细胞极化状态进行分析,发现相较于PBS组,mPRDX5组小鼠肿瘤组织中表达CD86的M1型巨噬细胞显著增加,而表达CD206的M2型巨噬细胞显著减少。结论:mPRDX5在小鼠体内具有显著的抗胰腺癌活性,且活性的发挥是通过促进肿瘤微环境中的巨噬细胞向M1型极化实现。

亚甲基四氢叶酸还原酶纯合突变的颅内静脉窦血栓一例并文献复习

目的总结亚甲基四氢叶酸还原酶(methylenetetrahydrofolate reductase,MTHFR)纯合突变致同型半胱氨酸(homocystine,Hcy)升高、诱发颅内静脉窦血栓形成(cerebral venous sinus thrombosis,CVST)的临床特点和诊疗过程。方法选取2023年1月3日解放军总医院第八医学中心的CVST患者1例,回顾性分析患者的临床、实验室资料,并复习既往相关文献。结果患者男,18岁,因“头痛伴恶心呕吐2 d”就诊,临床表现为头部持续胀痛,伴恶心呕吐,Hcy异常升高,影像学示上矢状窦、右侧横窦、乙状窦血栓形成,基因测序结果为MTHFR纯合突变。既往文献显示,MTHFR纯合突变与CVST无直接因果关系,但可导致Hcy水平升高,并间接增加CVST的风险。结论应重视CVST患者的Hcy检测,如发现Hcy无明显诱因的异常升高,应进一步完善CVST相关遗传因素的基因检测,尽早针对病因进行治疗。

亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性对脑卒中合并H型高血压病人治疗效果的影响

目的:探讨亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因C677T位点多样性对脑卒中合并H型高血压病人治疗效果的影响。方法:纳入2020年9月—12月承德医学院附属医院收治的120例脑卒中合并H型高血压病人,所有病人均给予高血压常规治疗及脑卒中二级预防治疗,在此基础上给予叶酸、维生素B 6和甲钴胺片联合治疗。比较不同MTHFR C677T位点基因型病人临床特征、治疗后血清同型半胱氨酸(Hcy)水平变化及疗效,分析MTHFR C677T位点T等位基因对病人的影响。结果:120例病人中MTHFR C677T位点CC、CT及TT基因型病人分别为27例(22.50%)、56例(46.67%)和37例(30.83%),TT基因型病人入院时美国国立卫生院卒中量表(NIHSS)评分、大脑中动脉(MCA)狭窄占比均高于CC基因型和CT基因型(P<0.05)。治疗3个月后,不同MTHFR C677T位点基因型病人血清Hcy水平均较治疗前降低,TT基因型病人Hcy水平下降程度低于CC基因型和CT基因型(P<0.05)。TT基因型病人脑卒中治疗总有效率为72.97%,低于CC基因型病人的92.59%(P<0.05)。携带MTHFR C677T位点T等位基因与血清Hcy水平升高密切相关(P<0.05)。结论:MTHFR基因C677T位点多态性与脑卒中合并H型高血压病人血清Hcy水平密切相关,可对脑卒中症状的改善和MCA狭窄造成影响。

亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性与阿尔茨海默病的相关性临床研究

目的探讨阿尔茨海默病(AD)进程中,亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)C677T多态性与疾病的相关性,以及是否受APOE基因影响。方法共纳入74例AD患者、85例遗忘型轻度认知障碍患者(aMCI)和81例健康对照者(HC),检测3组血清同型半胱氨酸(Hcy)、叶酸和维生素B12水平,以及MTHFR C677T及APOE基因型,通过Logistic回归分析比较MTHFR C677T不同等位基因和基因型分别与aMCI和AD风险之间的关联,以及在不同APOEε4亚组中的表现。结果AD组和aMCI组的血清Hcy水平均较对照组显著升高(P<0.001,P<0.001),而aMCI组血清叶酸水平较HC组明显降低(P=0.017)。与MTHFR CC、CT基因型者相比,TT基因型者的血清叶酸水平明显降低(P=0.038),血清Hcy水平明显升高(P=0.002)。回归分析结果显示:在APOEε4非携带者亚组中,MTHFR TT基因型可能增加aMCI患病风险(OR=3.670,95%CI=1.077-12.509,P=0.038),在APOEε4携带者中则无相应表现。结论MTHFR C677T多态性可导致血清Hcy水平增高和叶酸水平降低。在APOEε4非携带者中,MTHFR TT基因型可能增加aMCI的患病风险。

HMG-CoA还原酶ScrFI基因多态性对高胆固醇血症和AI的影响:一个中老年人群的横断面研究

目的:探讨3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(HMG-CoA还原酶)的基因多态性对高胆固醇血症和动脉粥样硬化指数(AI)的影响。方法:检测南京市常住汉族174名中老年人血总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C),计算AI;使用聚合酶链反应-限制性内切酶片段长度多态性(PCR-RFLP)技术检测HMG-CoA还原酶ScrFI基因多态性。结果:高胆固醇血症患者87例(高胆固醇组),男21例,女性66,平均年龄(63.59±8.37)岁;胆固醇正常87例(正常组),男21例,女66例,平均年龄(62.92±7.60)岁。高胆固醇组AA基因型频率为25.10%,Aa基因型频率为55.31%,aa基因型频率为19.59%;正常组AA基因型频率为18.39%,Aa基因型频率为52.87%,aa基因型频率为28.74%;高胆固醇组的a等位基因频率为55.17%,高于正常组的47.13%,但差异无统计学意义(P>0.05),AA基因型人群的血HDL-C水平显著高于Aa和aa基因型人群(P<0.05);胆固醇正常组AA基因型人群的AI显著低于aa型基因人群(P<0.05);两组人群的AI随突变型杂合子和突变型纯合子的发生逐渐升高,但差异无统计学意义(P>0.05)。结论:HMG-CoA还原酶ScrFI基因多态性可能是高胆固醇血症发生的遗传易感因素之一;HMG-CoA还原酶ScrFI基因突变可能会影响HMG-COA还原酶的活性,降低对胆固醇的抑制作用,增加总胆固醇和LDL-C的合成,较暴露于同样环境中的基因非突变型人群发生高胆固醇血症和动脉粥样硬化的风险可能会增高。

醛糖还原酶AKR1B1调控甲型流感病毒复制机制的初步研究

醛糖还原酶AKR1B1属于醛酮还原酶家族,是一种NADPH依赖性酶,可催化还原亲水性和疏水性醛。本实验室前期实验发现AKR1B1可以抑制流感病毒复制。为了探究醛糖还原酶AKR1B1调控流感病毒复制的具体机制,本研究通过siRNA干扰下调A549细胞中AKR1B1基因的表达后,经荧光定量RT-PCR(RT-qPCR)检测细胞内AKR1B1 m RNA的转录水平;通过western blot检测siRNA干扰后细胞内AKR1B1蛋白的表达水平;采用噬斑滴定法检测过表达及干扰AKR1B1后对流感病毒滴度的影响;通过western blot检测干扰AKR1B1表达后对细胞内病毒蛋白表达量的影响及甲型流感病毒A/WSN/33(H1N1)(简写为WSN)感染过程中对内源AKR1B1蛋白表达量的影响;采用激光共聚焦试验检测干扰AKR1B1表达对流感病毒NP蛋白核转运的影响;利用双荧光素酶报告系统检测过表达AKR1B1对流感病毒聚合酶活性的影响。RT-qPCR检测结果显示si_AKR1B1_671和si_AKR1B1_721均能极显著下调A549细胞中AKR1B1基因mRNA的转录水平,与对照组相比分别下降95.62%和85.10%(P<0.001),且不影响细胞活力;western blot检测结果显示si_AKR1B1_671能极显著降低细胞中AKR1B1蛋白的表达量(P<0.001),干扰AKR1B1能够增加细胞内病毒蛋白HA、PB2、NP、M1和NS1的表达量;噬斑滴定结果显示,与对照组相比,干扰AKR1B1表达能显著增加流感病毒WSN的病毒滴度,于感染后24 h和48 h病毒滴度分别上升了4.39倍(P<0.01)和5.53倍(P<0.001);与对照组相比,过表达AKR1B1后,流感病毒滴度于感染后24 h和48 h分别下降了62.59%(P<0.01)和82.78%(P<0.001);激光共聚焦试验结果显示,干扰AKR1B1表达不影响流感病毒的入核和出核阶段;Western blot检测结果显示,在流感病毒WSN感染过程中,细胞内源AKR1B1蛋白的表达量较为稳定,不受病毒感染的影响;双荧光素酶报告试验结果显示,与对照组相比,过表达AKR1B1后流感病毒的聚合酶活性下降了26.24%(P<0.001)。上述结果首次表明,醛糖还原酶AKR1B1通过抑制流感病毒聚合酶活性抑制流感病毒复制,干扰AKR1B1蛋白表达对流感病毒NP蛋白的入核和出核均无影响,并且流感病毒感染不影响细胞内源性AKR1B1的表达。本研究初步探究了宿主因子AKR1B1参与流感病毒复制的分子机制,为进一步了解流感病毒的复制调控提供了实验数据。

设计改造羧酸还原酶合成医药中间体(S)-2-氨基丁醇

(S)-2-氨基丁醇同时具有羟基及氨基官能团,是多种重要药物分子的关键手性中间体,生物合成(S)-2-氨基丁醇尚缺少有效的酶元件。以塞格尼氏菌(Segniliparus rugosus)来源的羧酸还原酶SrCAR为研究对象,通过对实验室已有SrCAR突变文库进行筛选测试,结合活性位点共进化分析,同时利用组合活性中心饱和突变策略(Combinatorial active-site saturation test,CAST)构建新的突变体文库,经测试最终获得优势突变体XH7(G430V/E533F/A627N)。该突变体催化底物N-Boc-(S)-2-氨基丁酸到醛产物的活性(kcat/Km)较野生型SrCAR提高2.1倍,热熔值(Tm)提升2.3℃。进一步通过引入荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)来源的醇脱氢酶PfADH,可还原N-Boc-(S)-2-氨基丁醛到醇产物。XH7和PfADH的双酶共表达体系反应5 h即可将20 mmol/L底物实现几乎完全转化,转化率达到99%,并经脱Boc保护与分离纯化获得终产物(S)-2-氨基丁醇,得率为60%。通过分子动力学模拟解析最优突变体活性及热稳定性提高的分子机制,为SrCAR酶设计改造提供新的研究思路,拓展酶法合成(S)-2氨基丁醇的生物酶工具箱,可为类似高附加值医药中间体的生物合成提供理论和实践指导。

木犀草素抑制丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶及其抗艰难梭菌作用研究

目的考察木犀草素对丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶(PFOR酶)的抑制作用及其抗艰难梭菌活性。方法将艰难梭菌PFOR编码序列克隆至表达载体pET-2a,转染至感受态大肠杆菌,异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(Isopropylβ-D-Thiogalactoside,IPTG)诱导表达后进行粗酶液制备。40μmol·L^(-1)待测化合物与PFOR酶在厌氧25℃条件反应8 h后,测定待测化合物对PFOR酶的抑制率。通过对菌液OD_(600)的考察,测定PFOR酶强抑制剂对艰难梭菌细菌(ATCC BAA 1382和ATCC BAA 1870)的最小抑菌浓度(MIC)。借助分子对接技术考察PFOR-抑制剂间可能的相互作用机制。结果在所测化合物中,黄酮木犀草素对PFOR的抑制活性最强,单点抑制率约为33%,与阳性抑制剂硝唑尼特的抑制率(40%)相当。分子对接发现木犀草素可与PFOR结构域中的Asp428、Val431、Gly429、Asp456、Lys458、Lys459等形成氢键。木犀草素对艰难梭菌的MIC约为32μg·mL^(-1)。结论木犀草素具有较好的抗艰难梭菌活性,PFOR酶可能是其抗菌作用靶点。

抗合成酶抗体综合征合并抗3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶还原酶蛋白抗体阳性坏死性肌病1例

目的总结抗合成酶抗体综合征(ASS)合并免疫介导坏死性肌病的疾病特点及治疗经验。方法回顾性分析2022年1月南京医科大学附属宿迁第一人民医院收治的1例ASS合并抗3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶还原酶蛋白(HMGCR)抗体阳性坏死性肌病病人,总结此类病人的临床特点。结果病人主诉咳嗽1周,查肌炎抗体谱:抗组氨酰tRNA合成酶(Jo-1)抗体(+++)、抗SSA/Ro52抗体(+++)、抗HMGCR抗体(+++),诊断:抗合成酶抗体综合征、抗HMGCR抗体阳性坏死性肌病、间质性肺病、低蛋白血症。该病人通过糖皮质激素、免疫抑制剂及丙种球蛋白等治疗后症状缓解。结论不同类型的特发性炎性肌病(IIM)临床表现差异较大,各亚型之间也存在重叠表现,其预后及治疗各不相同。如有两种及以上肌炎的合并,则进展快,预后差,需早期完善肌炎抗体谱检查,明确分型,精准治疗。

新型醛糖还原酶抑制1-乙酰基-1H-吲哚-3-乙酸酯的合成及其抑制活性

醛糖还原酶抑制剂(ARIs)抑制多元醇途径的醛糖还原酶是治疗糖尿病并发症的重要策略。以2-氯苯甲酸为起始原料,在碱性条件下经铜催化,与甘氨酸反应生成氯代邻羧基苯基甘氨酸,再与乙酸酐反应,生成N-乙酰基邻羧基苯甲酸。然后在吡啶催化下合环,生成1-乙酰基-^(1)H-吲哚-3-乙酸酯(AIA),总收率为79.0%,纯度为99.0%。通过^(1)H NMR、^(13)C NMR和MS(ESI)对其结构进行表征,并对该化合物的的醛糖还原酶抑制活性进行测定,IC 50=9.4×10^(-2)μM。