罗田甜柿Ty1-copia类逆转座子RNaseH-LTR序列的分离和特性分析

逆转座子序列信息的获得,对了解其在基因组中的行为及系统学研究有重要价值。本试验从罗田甜柿(Diospyros kaki Thunb.‘Luotian-tianshi’)基因组中分离出31个RNaseH-LTR(long terminal repeat,长末端重复)序列,并利用逆转座子间扩增多态性(inter-retrotransposon amplified polymorphism,IRAP)技术对部分序列相应的逆转座子家族在柿属植物中的转座活性及分布情况进行初步探讨。序列分析结果表明,至少有10个Ty1-copia类逆转座子家族得到扩增;其家族间普遍表现高度异质,碱基替换、插入或缺失突变,以及翻译成氨基酸后发生不同程度的终止密码子突变、氨基酸取代和移框突变等,是产生高异质性的原因;此外,其家族内部某些序列间的相似性极高,可能是寄主基因组与逆转座子间互惠关系的体现。应用部分逆转座子引物的IRAP分析结果表明,相应的逆转座子家族在柿属植物中普遍存在,其分布广泛,拷贝数高,转座活性强,具有进一步开发为多种逆转座子分子标记的潜力。

黄瓜属Ty1-copia类逆转座子逆转录酶序列的克隆及分析

根据Tyl-copia类逆转座子逆转录酶的保守区设计简并引物，通过PCR扩增，从黄瓜属野生种酸黄瓜（Cucumishystrix Chakr．）和栽培黄瓜（CucumissativusL．）中均扩增出260bp左右的目标条带。扩增产物经纯化后克隆于pGEM-T Easy质粒载体，选择阳性克隆，再经菌落PCR鉴定，然后进行测序及序列分析，获得了21条来源于酸黄瓜和栽培黄瓜的逆转录酶序列，通过核苷酸聚类分为5个家族。这些核苷酸序列具有较高的异质性，主要表现为缺失突变，序列长度变化范围为255～272bp，同源性范围为27．0％～98．1％。翻译成氨基酸后，有4条序列出现终止密码子突变，6条序列表现出移框突变。将这些逆转录酶的氨基酸序列与已登录的不同物种同一类型逆转录酶的氨基酸序列进行聚类分析，表明它们可能有共同的起源。

辣椒Ty1-copia类逆转座子逆转录酶序列的克隆及分析

以辣椒属5个栽培种叶片为试材,利用Ty1-copia类逆转座子逆转录酶的保守序列设计简并引物,PCR扩增后均获得了260bp左右的目的条带。对C.annuum的扩增产物进行纯化、克隆和测序,经Mega4和DNAstar软件分析后,获得25条逆转录酶序列,核苷酸序列长度变化范围为225～272bp,这些序列存在高度的异质性,主要表现为缺失突变,同源性范围为23.1%～93.2%,核苷酸聚类分为7个组。翻译成氨基酸后,有9条序列存在1～3个不同程度的终止密码子突变,4条序列存在移框突变。将这25条逆转录酶的氨基酸序列与已发表的不同物种同一类型逆转座子的逆转酶序列进行聚类分析,表明辣椒的Ty1-copia型逆转座子与烟草、矮牵牛、马铃薯有很近的关系。

不结球白菜Ty1-copia类逆转座子序列的克隆及表达

参照Tyl-copia类逆转座子逆转录酶的保守区设计简并引物，分别从10个不结球白菜（Brassica campestris ssp．chinensis）品种的全基因组中均扩增出260bp左右的目标条带。将目的条带回收、克隆和测序后进行分析，DNAstar分析发现，这些序列存在高度的异质性，28个核苷酸序列变化范围为224～278bp，同源性范围为16．7％～83．0％。28条序列通过核苷酸聚类分为8个家族。推导氨基酸序列有移框突变、终止子突变或二者兼有；与已登录的不同物种同一类型逆转录酶氨基酸系统进化树分析表明，不结球白菜Tyl-copia类逆转座子与芥菜型油菜、拟南芥、芜菁、甜菜可能有共同的起源。半定量和实时定量PCR检测表明，水杨酸（salicylicacid）和Peronospora parasitica均能激活不结球白菜Tyl-copia类逆转座子，逆转座子在不结球白菜叶片中的表达特征说明它可能参与寄主对病原菌的抗性。

逆转座子对真核生物基因组及宿主基因表达的影响

逆转座子广泛存在于真核生物基因组中,由于其自身结构及转座的特殊性,它们对真核生物的基因及基因组的大小、结构、功能和进化都有重要影响,尤其是在基因表达调控上,逆转座子插入能够改变宿主基因(即被插入基因)转录的时间和空间模式,造成选择性拼接、形成多种转录本等多种效应。同时,逆转座子活动所造成的稳定变异为选择新的、有突破性的优良性状提供了丰富的素材,显示出其在动植物品种改良中的巨大应用潜力,用逆转座子作基因标签进行基因功能研究、开发一些新型分子标记等都已得到广泛的应用。因此,关于真核生物中的逆转座子及其对宿主基因表达影响的研究具有十分重要的理论意义和巨大的应用前景,是目前国际上生命科学领域研究的热点课题之一,本文就该领域近年来的研究进展作一概述。

不同年龄小鼠染色体DNA与4.5sRNA逆转座子同源序列杂交的变化

目的 研究不同年龄小鼠脑基因组 DNA中 4.5s RNA逆转座子同源序列含量的变化。方法 用生物素化补骨脂素标记的 p SVLuc-4 .5s质粒 DNA(携带 4.5s RNA逆转座子序列 )作为探针 ,提取不同年龄的小鼠脑组织染色体 DNA与探针进行斑点杂交。结果 随着小鼠年龄的增加 ,同源序列的拷贝数减少。结论 4.5s RNA逆转座子以及小鼠基因组中的大量短分散重复序列在个体发育过程中是处于动态变化 ,与衰老过程密切相关。

水稻gypsy类逆转座子对不同胁迫条件的响应

LTR类逆转座子是水稻基因组中数量最多、分布最广的转座元件,其中Ty3–gypsy类所占比例较大。根据Ty3–gypsy类逆转座子逆转录酶的保守区域,采用简并引物,通过RT–PCR,对5种胁迫处理(稻瘟菌、水杨酸、2,4–D、高盐及组织培养)后的云南地方水稻品种月亮谷的cDNA进行扩增,并测序获得了一批转录片段,分析不同胁迫条件诱导激活的Ty3–gypsy类逆转座子的特点。结果表明:5种胁迫处理都能诱导月亮谷中Ty3 gypsy类逆转座子的表达;对不同胁迫响应的逆转座子序列大部分同源性较高,且呈交叉分布,仅有少部分具有胁迫响应的特异性,说明很多Ty3–gypsy类逆转座子能对不同胁迫进行响应。

硝普钠(SNP)和茉莉酸甲酯(MeJA)诱导的白桦Ty1-copia类逆转座子的克隆及分析

利用Tvl—copia类逆转座子逆转录酶（RT）的保守区域设计引物，优化了扩增条件后利用RT—PCR从白桦愈伤组织中得到了1条逆转录酶序列。利用硝普钠（SNP）和茉莉酸甲酯（MeJA）诱导后分别扩增克隆了11条和9条逆转录酶序列。这2l条逆转录酶序列（命名Bprtl-21）变化范围为205—290bp，一致性为71．93％，异质性为1．1％。50．9％，翻译成氨基酸的异质性为0～57．1％。经SNP和MeJA处理的样品中，获得的逆转录酶序列基本是分别聚类．初步证明不同的Tvl-copia类逆转座子能够分别响应不同的信号而被转录激活。分析所获得的21逆转录酶序列和苹果中19务逆转录转座子序列（DQ410748-DQ410766）进化关系发现．逆转录酶基本各自聚类。但是Bprt9、Bprtll和OQ4m750进化关系比较接近，Bprt15、Bprt19、DQ410751和DQ410753聚为一类，证明逆转座子存在水平传递。

植物逆转座子及其在基因功能和基因组分析中的应用

植物逆转座子及其在基因功能和基因组分析中的应用路铁刚孙敬三（中国科学院植物研究所，北京１０００９３）ＰｌａｎｔＲｅｔｒｏｔｒａｎｓｐｏｓｏｎｓａｎｄｔｈｅＰｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｏｆＴｈｅｉｒＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｉｎＧｅｎｅＦｕｎｃｔｉｏｎａｌａｎｄ...

水稻逆转座子的研究现状

逆转座子是水稻转座因子的一个主要组成部分。本文介绍了水稻活性逆转座子的发现、分离以及到目前为止发现的活性最高的水稻逆转座子Tos17的结构及其在遗传分析中的应用。

梨Ty1-copia类逆转座子逆转录酶序列的克隆及分析

根据Ty1-copia类逆转座子逆转录酶的保守区设计简并引物,从10份梨属(Pyrus)材料中扩增该逆转座子片段。扩增产物经纯化后克隆于pMD18-T质粒载体,选择阳性克隆,再经菌落PCR鉴定、测序及序列分析,获得了14条梨Ty1-copia类逆转座子逆转录酶序列。这些核苷酸序列长度为250～267 bp,具有较高的异质性,主要表现为缺失突变,通过核苷酸聚类可将14条序列分为4个家族。对这些片段的氨基酸序列进行分析,结果显示有2个序列发生了终止密码子突变。该研究获得的梨属植物Ty1-copia类逆转座子逆转录酶氨基酸序列与已报道的其他生物的相应序列有较高的一致性。

黑皮冬瓜LINE逆转座子RT序列的克隆与特征分析

根据LINE逆转座子逆转录酶保守序列设计简并引物,PCR扩增黑皮冬瓜“B98K”基因组DNA,获得580 bp左右目的条带。将PCR产物回收、克隆并测序,获得23条逆转酶序列,利用生物信息学软件分析其长度变异、碱基变化、相似性及系统进化关系。结果表明：这些序列长度在557~593 bp区间变异,同源比对核苷酸序列相似性为39.0%~99.3%,存在高度异质性,主要表现为缺失突变、移码突变与终止密码子突变,核苷酸序列聚类分析分为4个家族,家族1与家族2分别包含15和5个成员,占总序列数的65.22%和21.74%。对推导的氨基酸序列分析发现,第12位氨基酸残基处存在一保守的苯丙氨酸（Phe）,多处位置存在半保守氨基酸残基;氨基酸序列相似性在20.0%~99.5%之间;其中8条序列可能具有转录活性,8条与15条序列分别发生移码与终止密码子突变。与已知物种构建系统发育进化树,发现冬瓜LINE逆转座子RT序列较保守,且与拟南芥、李、油菜等有较近的亲缘关系。研究结果为后续利用分子标记研究冬瓜种质遗传变异及基因组进化奠定基础。

在水稻突变体中分离逆转座子初报

利用水稻双子房突变体为材料,设计简并引物,扩增类copia逆转座子中最保守的RT区域,得到了3个克隆片段。序列测定表明,其中1个克隆片段中含有终止码,另外2个克隆片段分别命名为PR1和PR4,均为连续的编码区。与已知的其他逆转座子序列的比较及聚类分析表明,PR1和其他序列差异很大,自成一类;PR4与Rrt21关系最近,相同率高达95.1%,属于同一个家族。同26个水稻品种的杂交结果表明,PR1的拷贝数变化不大,而PR4则存在着广泛的多态性,暗示着可能有转座功能。

小鼠4.5SRNA逆转座子cDNA的克隆及其表达载体的构建

利用ＲＴ＿ＰＣＲ方法，从小鼠肝脏组织总ＲＮＡ中扩增出４．５ＳＲＮＡ的ｃＤＮＡ．此ｃＤＮＡ被克隆到ｐＧＥＭ３Ｚｆ（＋）质粒，酶切鉴定并测序．然后将该序列插入以虫荧光素酶基因作为报导基因的表达载体ｐＳＶｌｕｃ２０的ＰｖｕⅡ位点，构建了含４．５ＳＲＮＡ逆转座子的表达载体ｐＳＶｌｕｃ２０＿４．５Ｓ．并对４．

基于逆转座子的植物分子标记技术及其应用

逆转座子特异的结构和功能使其作为一种有效的遗传工具应用于许多方面。本文就植物逆座子的组成、类别、以及其作为分子标记体系应用在遗传多样性、种系发生和基因作图等的新进展作一综述。

逆转座子样元件Tca1用于白色念珠菌的分类鉴定

已分离到一中等重复序列以及具有逆转座子样结构的元件Tcal(Transposon Candida albicans)。Tcal两端存在两个完全相同同向排列的序列LTR(Long Terminal Repeat)388bp,中间被一5.5kbDNA片段隔开。以alpha及Tcal为探针对40多种来自美国和中国的临床分离到的致病菌株进行杂交分析,根据杂交图谱,这些白色念株菌可被分成若干组,令人感兴趣的是来自同一地区菌种的遗传相关性比来自不同地区的大。比较URA3等基因的杂交结果,支持这种分析。尚未观察到alpha重复序列与其他酵母菌染色体DNA杂交的杂交条带,认为Tcal元件也许与C. albicans的遗传进化及其致病性有某种内在联系。

瓠瓜LINE逆转座子RT序列的克隆与特征分析

以瓠瓜[Lagenaria siceraria（Molina）Standl．]品种‘大籽葫芦’（‘Dazihulu’）和‘杂交瓠瓜’（‘Hybridbottlegourd’）为供试材料，对其基因组总DNA中的LINE逆转座子RT序列进行扩增，并对30个克隆产物的核苷酸序列及其编码的氨基酸序列进行比对、同源性分析和系统进化分析。结果表明：瓠瓜品种‘大籽葫芦’与‘杂交瓠瓜’的基因组总DNA均包含长度约580bp的RT序列片段。从2个瓠瓜品种中获得的30条LINE逆转座子RT核苷酸序列（编号为LsRT1至LsRT30）长度为564～599bp，碱基A、T、G和C的数量分别为143—193、157～205、104～139和83～134，AT／GC比为1．29～1．76，表现出高度异质性。缺失突变和终止密码子突变是造成瓠瓜LINE逆转座子RT核苷酸序列长度差异的主要因素。30条瓠瓜LINE逆转座子RT核苷酸序列的相似性为47．1％～99．5％，其编码的氨基酸序列相似性为26．7％～100．0％。根据核苷酸替代值，30条瓠瓜LINE逆转座子RT核苷酸序列可分为4个家族（family），分别包含14、8、1和7条序列。氨基酸序列分析结果显示：瓠瓜LINE逆转座子RT氨基酸序列包含20个保守氨基酸残基和多个半保守氨基酸残基；有14条氨基酸序列具有终止密码子突变。Family1、Family2和Family4是可能具有转座活性的逆转座子家族，分别包含8、3和5条无终止密码子的RT氨基酸序列。根据瓠瓜与其他15种植物的LINE逆转座子RT氨基酸序列构建的系统进化树，瓠瓜与葡萄（Vitis vinifera Linn．）和黄瓜（Cucumis sativus Linn．）等种类的LINE逆转座子RT氨基酸序列有较高同源性。研究结果表明：瓠瓜LINE逆转座子是一类较古老元件，LINE逆转座子可在瓠瓜与其他种类的基因组间横向传递。

节瓜Ty1-copia类逆转座子逆转录酶序列的克隆及比对

对8个节瓜（Benincasa hispida var.chieh-qua How）品系基因组DNA中的Ty1-copia类逆转座子逆转录酶核苷酸序列进行扩增,并对品系A39FA的29个克隆产物的核苷酸序列及翻译的氨基酸序列的系统进化和同源性进行了分析,还对29条氨基酸序列进行了比对。扩增结果表明：8个节瓜品系的基因组DNA中均包含长度约260 bp的逆转录酶核苷酸片段;从品系A39FA中获得的29条Ty1-copia类逆转座子逆转录酶核苷酸序列（CqRt1至CqRt29）的长度为247~267 bp,同源率为46.2%~98.1%,而它们的氨基酸序列同源率为26.7%~98.8%。序列分析结果表明：节瓜Ty1-copia类逆转座子逆转录酶核苷酸序列中碱基A、T、G和C的数量分别为65~96、47~92、45~74和32~49,所有序列均富含碱基A和T,AT/GC比为1.35~2.33;缺失突变是造成节瓜Ty1-copia类逆转座子逆转录酶核苷酸序列长度差异的主要因素,在序列长度和碱基组成方面的明显差异表明节瓜Ty1-copia类逆转座子逆转录酶核苷酸序列具有高度异质性。翻译后的氨基酸序列中有21条序列存在终止密码子突变、12条序列存在移框突变,表明Ty1-copia类逆转座子是节瓜基因组内序列重组的热点。通过聚类分析可将29个逆转录酶核苷酸序列分为5个家族（Family）,分别包括16、4、4、4和1条序列,其中Family 1可能是具有转座活性的逆转座子家族,但存在转录活性的逆转录酶序列仅占全部序列数量的20.69%。将每一家族中的1~2条序列与其他15种植物的Ty1-copia类逆转座子逆转录酶的氨基酸序列进行比对,显示出较高的同源性。研究结果表明：节瓜与其他植物的Ty1-copia类逆转座子可能有相同起源,而且Ty1-copia类逆转座子可在不同类群间横向传递。

瓠瓜Ty1-copia型逆转座子RT基因的分离与序列分析

以3个瓠瓜栽培种为供试材料,利用Ty1-copia逆转座子逆转录酶保守序列设计简并引物,PCR扩增获得260bp左右序列条带,回收产物克隆至T载体进行测序,利用生物信息学软件分析获得的25条逆转录酶序列。结果表明,这些序列长度变化范围为218~267bp,经DNAStar软件比对同源性在26.1%~99.6%之间,存在高度异质性,主要表现为缺失突变,核苷酸序列聚类分析分为6个家族,家族1与家族3分别占总序列数的24.0%与36.0%。翻译成氨基酸序列后,分别有2条与11条序列发生移码与终止密码子突变。与已发表物种的相应序列构建系统发育进化树,发现瓠瓜Ty1-copia型逆转座子RT序列具有一定保守性,同时也与杨树、草莓、马铃薯等有很近的亲缘关系。本研究为后续利用逆转座子开发分子标记研究瓠瓜遗传变异及进化途径奠定基础。

逆转座子与生物遗传多样性

生物为了适应环境变化 ,需要遗传物质发生变化来为进化提供材料 ,在进化过程中遗传物质的变化方式主要包括突变和基因重排。对一个种群或个体来讲 ,在不同的环境或一定生活周期内的不同阶段 ,基因组存在着基因的差次表达 ,这种调控在核酸分子水平上主要是通过突变和基因重排来实现 ,由此使得基因组成为一个动态变化的体系 ,使种群或个体的遗传多样性发生相应的变化。分子生物学中最惊人的发现之一是在基因组内存在着通过DNA转录为RNA后 ,再经逆转录成为cDNA并插入到基因组的新位点上的因子 ,被称为逆转座子。按照其结构特点以及所编码反转录蛋白因子的不同 ,可分为反转录转位因子 ,反转录子 ,反转录病毒 ,能编码反转录所需蛋白的因子 ,不能编码反转录所需蛋白的因子。逆转座子在转位过程中须以RNA作为中间体 ,RNA较易变异 ,且RNA聚合酶和逆转录酶均无校对功能 ,这就使得逆转座子具有高度变异性。逆转座子可通过遗传变异、基因重排或对基因表达的影响 ,导致生物遗传多样性的形成。逆转座子除了能够促进基因的流动性增加遗传多样性外 ,它们散布在基因组中 ,还能够成为进化的种子。