γ-逆转录病毒载体包装及浓缩方法对比研究

为选择合适的包装条件与安全高效的浓缩方法生产用于CAR-T制备的γ-逆转录病毒载体,使用两种包装条件γ-逆转录病毒表达载体(pMIG与pMIGⅡ)和包装质粒总量(20μg与40μg)分别生产逆转录病毒载体,利用流式细胞术检测不同条件下生产的病毒滴度;使用超速离心与超滤离心两种浓缩方法得到逆转录病毒浓缩液,运用流式细胞术,检测两种病毒浓缩液滴度及其对T细胞的转导效率,并监测CAR-T细胞增殖与存活率。数据显示,pMIGⅡ载体包装病毒滴度较高(p<0.05),20μg与40μg质粒总量对病毒滴度无显著影响(p>0.05),超滤离心法与超速离心法浓缩后逆转录病毒滴度无显著差异(p>0.05)。研究表明,pMIGⅡ载体与20μg质粒总量更适合包装γ-逆转录病毒,超滤离心法可用于实验室小规模浓缩逆转录病毒,满足CAR-T研究的需要。

携带绿色荧光蛋白基因的逆转录病毒载体的构建及其介导的T细胞基因转移研究

为了构建含绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein,GFP)基因的逆转录病毒载体和研究逆转录病毒对T细胞的感染能力,利用亚克隆技术将磷酸甘油酸激酶启动子(phosphoglyceratekinasepromoter,PGK)基因和GFP全长cDNA插入逆转录病毒载体pLXSN,采用磷酸钙沉淀法将重组载体转染PA317包装细胞,G418筛选出抗性克隆,收集滴度最高的病毒上清感染NIH3T3和T细胞,在倒置荧光显微镜下观察GFP表达情况。结果表明;重组逆转录病毒载体转染PA317包装细胞后,可在荧光显微镜下观察到GFP的表达。G418筛选后,含GFP的逆转录病毒可感染原代培养的T细胞。结论:逆转录病毒载体能够快速、稳定地将外源基因转移至T细胞,可作为介导T细胞基因转移的重要工具。

人PD-L1(B7-H1)基因克隆及其逆转录病毒载体的构建和稳定表达

目的 :克隆人PD L1(B7 H1)基因 ,并构建含有该目的基因的重组逆转录病毒载体 ,获得稳定表达PD L1基因的L92 9细胞。方法 :从人心脏cDNA文库中扩增出PD L1基因 ,通过双酶切装入逆转录病毒载体 pGEZ Term中 ,脂质体法共转染包装细胞 2 93T ,用含有完整病毒颗粒的 2 93T细胞的培养上清感染L92 9细胞 ,72h后 ,加入Zeocin进行筛选 ,挑选出能稳定表达PD L1蛋白的L92 9细胞株。结果 :构建了用于表达的含PD L1基因的重组逆转录病毒载体 ;经转染包装细胞 2 93T后 ,包装出具有感染能力的重组PD L1逆转录病毒 ;经RT PCR、流式细胞仪表型检测表明 ,筛选出的L92 9转基因细胞能稳定表达人PD L1蛋白。结论 :构建了含人PD L1基因重组逆转录病毒载体和稳定表达人PD L1蛋白的细胞株 ,为该基因功能的后续研究和单克隆抗体的研制奠定了基础。

白细胞介素-18逆转录病毒载体的构建及抗乙型肝炎病毒的研究

研究鼠白细胞介素 18(IL 18)基因的转移、表达及其抗乙型肝炎病毒 (HBV)的作用。以逆转录聚合酶链反应 (RT PCR)技术从受植物凝血素(PHA)和脂多糖 (LPS)刺激BALB/c小鼠脾脏细胞中扩增出IL 18的cDNA ,并构建表达IL 18基因的重组逆转录病毒载体pLXSN IL 18,转染PA317细胞 ,以逆转录巢式RT PCR方法 ,验证细胞培养液上清分泌的假病毒颗粒中IL 18的表达 ,将假病毒颗粒感染 2 .2 .15细胞 ,酶联免疫吸附法(ELISA)检测其上清HBsAg和HBeAg,定量检测HBVDNA。成功克隆出 5 80bp的小鼠IL 18全基因并构建逆转录病毒载体 ,在转染PA317细胞的上清中检测出含IL 18假病毒颗粒 ,上清感染 2 .2 .15细胞后第 3、5、7、14天 ,HBsAg、HBeAg逐渐下降 ,到14天时HBsAg已变为阴性 ,对HBVDNA有明显抑制作用。IL 18能成功地在逆转录病毒载体中表达 ,并有抑制HBsAg。

逆转录病毒载体介导的口蹄疫病毒衣壳前体基因和绿色荧光蛋白基因在BHK-21细胞中的表达

为建立逆转录病毒载体介导的口蹄疫病毒衣壳前体蛋白哺乳动物细胞表达体系,将口蹄疫病毒(FMDV)衣壳前体基因(P1)和绿色荧光蛋白基因(EGFP)依次插入逆转录病毒载体pBABEpuro构建重组逆转录病毒载体pBABEpuro-P1-2A-EGFP。将重组逆转录病毒载体和pVSV-G质粒载体共转染GP2-293包装细胞,用产生的重组逆转录病毒感染幼仓鼠肾细胞(BHK-21)。荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达,用嘌呤霉素筛选抗性细胞,间接免疫荧光方法检测细胞中FMDV衣壳前体蛋白的表达。结果表明,重组逆转录病毒载体pBABEpuro-P1-2A-EGFP构建正确,绿色荧光蛋白和FMDV衣壳前体蛋白在细胞中能稳定表达。FMDV衣壳前体蛋白基因细胞表达体系的成功建立为进一步开展口蹄疫亚单位疫苗的研制奠定了基础。

增强型绿色荧光蛋白逆转录病毒载体的构建和表达

逆转录病毒载体被广泛用作对造血细胞进行基因转移的工具 ,转导方法的改进有赖于应用可快速分析并被高效选择的基因标志。为此 ,我们克隆了增强型绿色荧光蛋白 (EGFP)基因 ,并构建可表达EGFP的逆转录病毒载体LGSN ,通过脂质体转染和交互感染方法建立高滴度的逆转录产病毒细胞 ,用以分析对造血细胞标记EGFP基因的可行性。流式细胞术和荧光显微镜检测发现 ,EGFP病毒转录的GP +envAm12细胞和K5 62细胞均可发出稳定的绿色荧光信号 ,阳性率可分别达 97%和 86% ;聚合酶链反应分析显示LGSN转导细胞内有原病毒的整合。上述结果提示 ,作为新一代选择性标志 ,EGFP是适于研究对造血细胞基因转移与表达的报告基因 。

含CD基因的人大肠癌特异性逆转录病毒载体的构建

含ＣＤ基因的人大肠癌特异性逆转录病毒载体的构建崔龙，曹广文，王元和，屠岳，孟荣贵，高军，仇小芳，吴宗娣，谢苏庆关键词大肠癌；胞嘧啶脱氨酶基因；逆转录病毒载体；癌胚抗原；转录调控序列胞嘧啶脱氨酶（ＣＤ）是真菌及某些大肠杆菌等ＤＮＡ嘧啶补救合成途径中的关...

绿色荧光蛋白逆转录病毒载体的构建及其表达

目的 实现绿色荧光蛋白 (GFP)报告基因在组织工程化细胞中的高效、稳定、长久表达。方法 构建重组逆转录病毒表达载体RV GFP ,通过PT6 7包装细胞克隆 ,经G418筛选、扩增 ,获得大量含GFP基因的病毒液 ,并直接感染靶细胞。结果 转染细胞于 48h后 ,在荧光显微镜蓝光激发波长下 ,可发出明亮的绿色荧光 ,转染率达 2 0 %～5 0 %。感染靶细胞内GFP的有效表达可维持 2个月。结论 构建的重组逆转录病毒GFP载体 ,可作为组织工程化细胞标记 ,用于细胞动态研究 ,其方法简便、灵敏。

核骨架基质结合区(S/MAR)提高逆转录病毒载体介导egfp在NIH3T3细胞中的表达

为减轻逆转录病毒介导的外源基因的沉默 ,进一步提高逆转录病毒MFG载体介导的转移基因的表达 ,将人 β INF基因上游 80 0bp的核骨架基质结合区 (S MAR)分别反向和正向克隆至MFG载体 3′LTR上游 ,以egfp为报告基因观察S MAR对egfp基因表达水平以及对病毒滴度的影响 .结果显示 :反向和正向的S MAR在瞬时表达的情况都不能提高egfp的表达 ,但在稳定整合的情况下反向S MAR可明显提高egfp在NIH3T3细胞内的表达 ,而正向的S MAR作用不明显 ,另外反向S MAR可明显提高MFG逆转录病毒载体的滴度约 5倍 ;因此改造后的MFG逆转录病毒载体将能更好地用来介导外源治疗基因的表达 .同时还观察到 ,同一个载体骨架在稳定表达的情况下 ,磷酸钙介导较逆转录病毒载体介导的表达水平高 .

人G-CSF基因的克隆及其重组逆转录病毒载体的构建与初步应用

利用RT-PCR方法克隆到包括有全部编码序列和部分5',3'端非编码序列的人G-CSF cDNA,并通过核苷酸测序得到证实。将其定向克隆至逆转录病毒载体pLXSN、构建成人G-CSF的重组逆转录病毒表达载体pLGSN。体外经CRE和CRIP细胞的两欹包装，病毒滴度达到了临床应用的水平(1.1×10^6CFU／m1)。hG-CSF逆转录病毒感染NIH3T3小鼠成纤维细胞后．分泌G-CSF达168U／m1．Southern分析表明hG-CSF基因己整合至NIH3T3-G-CSF细胞的基因组中，Northern和Western分析分别从mRNA和蛋白质水平证实了人G-CSF在ENIH3T3-G-CSF细胞的表达。NIH3T3-G-CSF细胞植入同系小鼠体内．能从血清中检测到持续表达的G-CSF活性。本研究为开展人G-CSF基因治疗奠定了基础。

携带FMDV前导蛋白基因逆转录病毒载体的构建及其在牛肾细胞中的表达

以口蹄疫病毒株OA/58RNA为模板,反转录并扩增目的cDNA。通过分子克隆技术将前导蛋白编码序列Lab与逆转录病毒载体pBPSTR1连接,将构建正确的重组载体命名为pBPSTR1-Lab。通过分别利用不同浓度的嘌呤霉素和四环素来确定最佳筛选浓度和最佳调控浓度,结果显示嘌呤霉素的最佳筛选浓度为3μg/mL,四环素的最佳调控浓度为1μg/mL。利用pBPSTR1-Lab和包装质粒pVSV-G双质粒瞬时转染Gp2-293包装细胞来获得重组逆转录病毒。利用重组逆转录病毒来感染牛肾细胞,并连续筛选12天来获得阳性克隆。通过除去四环素来诱导目的基因在牛肾细胞中表达,发现牛肾细胞病变死亡。经过PCR和蛋白质免疫印迹证实稳定表达前导蛋白的牛肾细胞系已经建立,为今后研究前导蛋白致病机理提供了平台。

survivin基因RNAi逆转录病毒载体设计与构建方法实验研究

目的 设计和构建survivin基因的表达si RNA逆转录病毒重组载体,探讨胶质瘤分子病因及用于基因治疗的可行性。方法 利用在线软件si Direct设计干扰survivin基因靶序列,合成回文DNA序列退火后克隆至线性化p SUPER质粒载体,重组质粒载体双酶切电泳鉴定和测序分析,再转染phoenix细胞产生病毒转染低分化SHG4 4 - 9胶质瘤细胞株。利用NIH3T3细胞测定病毒滴度。Western blot测定转染后SHG4 4 - 9细胞survivin表达量。结果 p SU PER表达si RNA重组质粒载体经双酶切电泳鉴定和DNA测序分析,证实插入6 0 bp序列与原序列一致,位置正确。测定p SUPER.retro- S1、p SU PER.retro- S2病毒滴度值分别为5 .5×10 5CFU/ m l和5 .75×10 5CFU/ ml,干扰效率分别为70 .5 %和接近10 0 .0 %。结论 survivin基因的表达si RNA逆转录病毒重组载体的构建成功,不但为研究胶质瘤分子病因和基因治疗提供了有用工具,而且也为研究高表达survivin的其它肿瘤构建了新的平台。

新型假型逆转录病毒载体的构建

目的 将疱疹性口炎病毒壳G糖蛋白(VSV-G)用于构建新型假型逆转录病毒载体(VSV-G/MuLV)。方法 利用三质粒系统一过性转染293T/17细胞,通过磷酸钙共沉淀法产生VSV-G/MuLV;一过性转染后的病毒上清转导包装细胞系293/GPC以产生VSV-G/MuLV生产细胞系。G418筛选未成功转导的细胞,经筛选后的293/GPG细胞生产VSV-G/MuLV;用病毒上清转染NIH3T3细胞,并采用G418克隆筛选法测定病毒滴度。结果 感染后的NIH3T3细胞在G418的筛选培养下,有大量克隆形成。经计数和计算,VSV-G/MuLV病毒上清滴度为6×106。结论 成功构建了VSV-G/MuLV;该型病毒转染效率高,可直接转导大多数细胞,在有效监控条件下,VSV-G/MuLV作为载体可用于基因治疗。

反义HLA-A2和GDNF共表达逆转录病毒载体的构建和鉴定

为构建GDNF和反义HLA -A2共表达的逆转录病毒载体,将人GDNF酶切片段(XhoI/SalI)克隆于逆转录病毒载体pLNCX2 的XhoI位点,再将HLA A2cDNA片段反向克隆于上述重组载体的HindIII/SalI位点,对其作酶切鉴定和测序后转染PA317包装细胞系进行病毒的包装。收获重组病毒感染的NIH3T3并进行病毒滴度的测定,GDNF及HLA- A2表达的RT -PCR检测,进一步感染人胚肺成纤维细胞,观察GDNF分泌情况。结果表明:GDNF和反义HLA -A2两片段的序列和插入方向完全正确,包装后获得的重组病毒的平均滴度为5×105 CFU/ml。RT PCR显示:在小鼠源性的PA317细胞中有人GDNF和HLA A2的表达,ELISA法测得病毒感染人胚肺成纤维细胞上清液中GDNF含量为450pg/ml。通过本实验,我们获得能共表达GDNF和反义HLA -A2的重组逆转录病毒,其转染的人成纤维细胞具有合成GDNF的能力。

雄激素受体反义RNA逆转录病毒载体的构建及其鉴定

目的 构建雄激素受体 (AR)反义RNA逆转录病毒载体pL AR SN并进行包装和鉴定。方法 PCR扩增ARcDNA片段并将之反向插入到逆转录病毒载体pLXSN ,用脂质体法转染PA31 7细胞 ,提取转染细胞基因组DNA和培养上清中重组逆转录病毒RNA ,用PCR和RT PCR法进行鉴定 ,NIH 3T3细胞测定病毒滴度。结果 限制性内切酶分析证明pL AR SN含有反向插入的ARcDNA目的片段 ;培养上清中病毒滴度为 2 .34× 1 0 5 CFU/ml,PCR和RT PCR分别从转染细胞基因组DNA和培养上清中的重组逆转录病毒RNA中扩增出了插入的目的片段。结论 成功构建了AR反义RNA逆转录病毒载体并包装出了高滴度的重组逆转录病毒。

逆转录病毒载体介导IL-2基因转染人肝细胞的建立及其部分生物学性状

目的 建立ｈＩＬ－２基因修饰的人肝细胞株并探讨对其生物学活性的影响。 方法应用重组逆转录病毒载体ｐＬＮＣＩＬ－２，将ｈＩＬ－２基因导入人肝细胞系Ｌ－０２，观察其形态及克隆形成率的变化，检测细胞培养上清中ｈＩＬ－２的含量，以及进行转染细胞基因组ＤＮＡ ＮｅｏＲ基因片段的ＰＣＲ扩增。结果Ｌ－０２／ＩＬ－２细胞的增殖速度和克隆形成率低于Ｌ－０２／Ｎｅｏ细胞和Ｌ－０２细胞。Ｌ－０２／ＩＬ－２细胞的培养液中ｈＩＬ－２的含量达３２ ０００ ｐｇ／１０６ｃｅｌｌｓ·ｄ，并可持续表达１０ ｗｋ以上。从Ｌ－０２／ＩＬ－２细胞和Ｌ－０２／Ｎｅｏ细胞基因组ＤＮＡ中，均扩增到ＮｅｏＲ基因片段（７９０ ｂｐ）。结论应用重组逆转录病毒载体成功地建立了Ｌ－０２／ＩＬ－２细胞株，为进一步进行肝细胞移植动物实验奠定了基础。

重组猪瘟病毒E2基因逆转录病毒载体的构建及其表达活性

从实验感染兔脾组织中提取总RNA,应用RT-PCR得到了CSFV C-株结构蛋白E2基因,定向克隆于逆转录病毒载体pBABEpuro,经PCR、酶切和序列分析鉴定,获取阳性重组质粒。将该重组质粒与水疱性口炎病毒载体pVSV-G共转染GP2-293细胞,收获假型病毒,并在Polybrene的介导下感染PK15细胞,嘌呤霉素筛选表达猪瘟E2基因的细胞株。通过细胞传代并结合PCR、免疫荧光及ELISA检测表明,所筛的细胞细胞系能稳定表达猪瘟E2基因,而且表达产物具有良好的生物学活性。

PDGF-A基因逆转录病毒载体的构建及其在猪骨髓间充质干细胞中表达的研究

目的克隆血小板衍生生长因子A链(platelet-derived growth factor A chain,PDGF-A)基因,以逆转录病毒载体pLXSN为骨架携带PDGF-A基因转染猪骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells,bMSCs),为应用PDGF-A基因修饰bMSCs进行创面修复奠定基础。方法采用RT-PCR二步分离法,以人肝癌细胞总RNA为模板,扩增PDGF-A基因的全长cDNA编码序列,构建PDGF-A基因的逆转录病毒载体pLXSN/PDGF-A,并将其导入病毒包装细胞PA317中,经G418筛选并扩增,以病毒液感染NIH3T3细胞,选出抗性克隆,测其病毒滴度,将高滴度病毒液感染bMSCs。采用RT-PCR、Southern blot和ELISA法,分别检测PDGF-A基因转染bMSCs的效率及PDGF-A在bMSCs中的表达水平;光镜、MTT法、成骨与成脂诱导分别检测bMSCs转染PDGF-A基因后的生长状态、增殖情况及干细胞特性。结果经测序验证,克隆到PDGF-A基因的全长cDNA序列与GenBank所报告的该基因序列完全一致。成功构建了PDGF-A链基因的逆转录病毒载体pLXSN/PDGF-A,并实现了PDGF-A基因在bMSCs的稳定表达。bMSCs转染PDGF-A后的生长状态、增殖情况良好,且仍具干细胞特性。结论成功地将PDGF-A基因克隆到pLXSN载体中,并实现了PDGF-A基因在bMSCs中的稳定表达。bMSCs转染PDGF-A后仍具干细胞特性。