端粒及端粒酶逆转录酶基因与慢性阻塞性肺疾病相关性的研究进展

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是一种多因素疾病,其主要危险因素是烟雾暴露和衰老。既往研究证明,端粒过度缩短作为COPD患者加速衰老的标志,在COPD的发生、发展中发挥重要作用。在参与COPD发病的氧化应激、炎症反应过程中均能发现端粒的缩短。端粒酶逆转录酶是决定端粒长度的关键因素,其基因突变、缺失及单核苷酸多态性也被证明与COPD的不良临床结局密切相关。本文通过对端粒及端粒酶逆转录酶基因与COPD相关性的研究进展进行综述,旨在为临床提供依据。

拉米夫定治疗中病毒核酸无应答患者体内乙型肝炎病毒逆转录酶基因变异分析

目的:了解拉米夫定病毒核酸无应答与HBV逆转录酶基因变异之间的关系. 方法:采用PCR产物直接测序方法对3例病毒核酸无应答患者体内HBV RT区基因序列治疗前后的变异情况进行分析. 结果:治疗前后6份标本核苷酸变异率为0.63-1.52%,氨基酸变异率为0.38-1.90%,其中出现rtY203H、rtS256C、rtL269Ⅰ变异的频率较高,此外尚有1例出现rtL180M变异. 结论:拉米夫定治疗中病毒核酸无应答可能与HBV RT区基因变异有关.

人端粒酶逆转录酶基因沉默对肺腺癌细胞侵袭、增殖、凋亡的影响

目的:探讨靶向人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的小干扰RNA(siRNA)转染对肺腺癌细胞株A549生物学行为的影响。方法:构建靶向hTERT的siRNA表达质粒转染A549细胞,通过Western blot检测蛋白的表达水平,确定有效后,通过Transwell小室检测细胞体外侵袭能力,MTT法检测细胞增殖活性,流式细胞术测定转染后肿瘤细胞的细胞周期和凋亡率。结果:成功构建靶向hTERT的siRNA表达质粒。实验组siRNA转染后的细胞侵袭能力较对照组减弱(P<0.01),生长抑制率明显高于阴性对照组(P<0.01),且表现出时间依赖性。流式细胞术测定显示,实验组siRNA转染48h后,肿瘤细胞凋亡率显著增加(P<0.01)。结论:靶向hTERT的siRNA转染后可以显著降低A549细胞侵袭能力,抑制增殖,诱导细胞凋亡的发生。

人类端粒酶逆转录酶基因转染对足叶乙甙诱导Raji细胞凋亡的影响

探讨人类端粒酶逆转录酶 (hTERT)基因转入Raji细胞后足叶乙甙 (VP 16 )对细胞凋亡的影响。采用脂质体介导的转染方法将重组的hTERT基因转入Raji细胞 ,G4 18筛选 ;采用间接免疫荧光标记法及端粒酶聚合酶链反应 酶联免疫测定法检测hTERT蛋白表达水平和端粒酶活性的变化 ;姬姆萨染色及流式细胞仪观测细胞凋亡。结果发现 :转染hTERT入Raji细胞后 ,其表达hTERT的蛋白及端粒酶活性显著增加 (P <0.0 5 )。 10 μmol/LVP 16作用转染hTERT的Raji细胞 4 8h、72h对细胞生长抑制作用不如转染空载体组及未转染组明显 (P <0 .0 5 )。 10 μmol/LVP 16作用转染hTERT的Raji细胞 72h ,光镜下仅可见到很少量的细胞出现凋亡 ,流式细胞仪测定的细胞凋亡率 (4.34±1.0 3) %显著降低 ,分别与转染空载体组 (33.2 1± 3.12 ) %及未转染组 (31.6 3± 3.0 6 ) %比较 ,P <0.0 5。表明端粒酶活性过表达可使Raji细胞对VP

乙型肝炎病毒逆转录酶基因突变的临床意义

目的 分析服用核苷酸类似物的乙肝患者逆转录酶（RT）基因突变模式及其与生化指标的相关性,探讨该基因突变的临床意义。方法 采用半巢式PCR对634例来自武汉地区的乙肝病毒感染者血浆HBV进行扩增后,Sanger测序法进行基因序列分析; 将RT基因突变组与野生组和各表型突变组中患者的谷氨酸氨基转移酶（ALT）、乙肝病毒e抗原（HBeAg）和HBV DNA阳性率作比较。结果 在测序成功的622例患者中,144例（23.15%）发生RT基因突变。他们在11个位点（rtM204,rtL180,rtA181,rtN236,rtV173,rtL80,rtM250,rtS202,rtV207,rtV214和rtV84）出现碱基突变。在突变组中,患者的ALT,HBeAg和HBV DNA阳性率显著高于非突变组（P〈0.05）。表型分析显示：拉米夫定（LAM）耐药最常检测到,占52.78%,其次为阿德福伟（ADV）耐药占27.78%和恩替卡韦（ETV）耐药占6.94%,多重耐药LAM＋ADV于18例患者中检出12.5%。多重耐药组患者ALT,HBeAg和HBV DNA阳性率高于其他耐药组（P〈0.05）; ADV耐药组患者ALT,HBeAg和HBV DNA阳性率高于LAM,ETV耐药组。结论 HBV RT区域的突变形式与血清学指标ALT,HBeAg和HBV DNA阳性状态有显著关联,该基因的突变形式可用作患者临床表现的指示指标。

用两步MS-PCR结合ELISA检测HIV-1逆转录酶基因的耐药性突变

高效抗逆转录病毒治疗法(HAART)的推广使用有效地抑制了HIV-1病毒的传播和艾滋病(AIDS)的发病率、死亡率。近年来,HIV-1逆转录酶基因突变所导致的耐药性已成为HAART治疗失败的主要原因,耐药性突变的检测对于指导病人用药以及新药开发具有重要意义。发展了一种检测HIV-1逆转录酶基因耐药性突变的新方法。采用两步MS-PCR方法检测HIV-1B亚型野生型和耐药突变型逆转录酶基因突变,检测点包括M41L、K70R、K103N、Y181C和T215,并在两步MS-PCR基础上,设计比野生型引物长的突变型引物,结合微孔板杂交ELISA呈色技术检测各点突变。结果显示,简化的两步MS-PCR能保持灵敏度和特异性高的优点,ELISA的阳性结果与阴性结果的比值(P/N)达到要求,两步MS-PCR结合ELISA方法灵敏度高,操作简单、结果直观、成本低、相对耗时短且能进行高通量检测,使其无论在HIV-1耐药性突变及其它的点突变检测中都具有较好的临床应用前景。

蝎毒对人肝癌细胞Bel-7404凋亡及端粒酶逆转录酶基因的作用

目的观察蝎毒对人肝癌Bel-7404细胞增殖的影响及对端粒酶逆转录酶基因(hTERTmRNA)活性的影响。方法以人肝癌细胞株Bel-7404为研究对象,以不同浓度的蝎毒处理体外培养的人肝癌Bel-7404细胞72 h,以噻唑蓝(MTT)法测定细胞增殖抑制,采用RT-PCR法检测细胞hTERTmRNA的表达情况。结果MTT结果显示蝎毒抑制Bel-7404细胞增殖、诱导细胞凋亡且抑制有浓度依赖性。同时,蝎毒可抑制hTERTmRNA的表达。结论抑制端粒酶逆转录酶基因(hTERTmRNA)表达而抑制端粒酶的活性、诱导细胞凋亡,可能是蝎毒的抗癌细胞机制之一。

端粒酶逆转录酶基因hTERT在肝细胞癌中的表达及端粒酶反义基因对人肝癌细胞HepG2细胞凋亡的影响

目的:研究肝细胞癌(HCC)中端粒酶逆转录酶基因hTERT表达,探讨其在HCC发生、发展及预后复发中的意义.探讨抗端粒酶在肝细胞癌治疗中的意义.方法:采用免疫组化法检测42例HCC组织中hTERT的表达,并对hTERT与临床病理特征的关系进行分析.将反义hTR真核表达载体经脂质体介导转染人肝癌细胞系HepG2,体外培养及接种裸鼠观察其基因转染细胞的细胞周期、超微结构变化及致瘤性.结果:HCC中hTERT基因阳性率分别为71.4%(30/42);hTERT与在正常肝脏组织中阳性表达率0%相比,有显著性差异(P<0.01).hTERT在Ⅰ,Ⅱ和Ⅲ级HCC中的表达率分别为40.0%(4/10),70.0%(14/20),100%(12/12).Ⅰ与Ⅲ级、Ⅱ与Ⅲ级比较差异显著(P<0.05).hTERT阳性表达率与患者复发有显著相关性(P<0.05).形态学观察,转染后HepG2细胞出现典型的凋亡现象.FCM检测发现G1期前出现凋亡峰.在裸鼠皮下的致瘤性明显降低.荷瘤鼠存活时间延长.结论:hTERT表达异常可能与肝脏肿瘤的发生、发展有关.检测hTERT表达可作为预测肝脏肿瘤预后复发的潜在指标.提示HCC是由多基因参与的疾病.转染端粒酶反义RNA能抑制肝癌HepG2细胞的恶性表型,促进其凋亡.

RNA干扰人端粒酶逆转录酶基因对膀胱尿路上皮癌BIU-87细胞株端粒酶活性抑制的研究

目的:探讨RNA干扰技术使人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因沉默,对膀胱尿路上皮癌BIU-87细胞株端粒酶活性的抑制作用。方法:针对hTERT基因设计构建多种siRNA表达载体,并转染至膀胱肿瘤BIU-87细胞,通过实时荧光定量、单四唑(MTT)检测端粒酶活性,观察siRNA表达载体对hTERT基因表达的影响。结果:实时荧光定量和MTT检测证明,所构建的载体能导致不同程度的hTERT基因沉默,并成功地抑制BIU-87细胞的生长。结论:RNA干扰膀胱尿路上皮癌细胞(BIU-87)端粒酶hTERT基因,能影响端粒酶基因的表达,为进一步研究端粒酶活性在膀胱尿路上皮癌中的作用奠定了基础。

重组腺相关病毒介导人端粒酶逆转录酶基因转染对人髓核细胞功能的影响

目的:研究重组腺相关病毒介导人端粒酶逆转录酶基因(recombinant adenoassociated virus vector-me-diated human telomerase reverse transcriptase,rAAV-hTERT)转染对体外培养人髓核细胞功能的影响。方法:利用机械与酶消化的方法获得均一性的人椎间盘髓核细胞,将构建好的rAAV-hTERT转染P2代体外单层培养的髓核细胞。用重组腺相关病毒-增强型绿色荧光蛋白(recombinant adenoassociated virus vector-mediatedenhanced green fluorescent protein,rAAV-EGFP)作为标记基因观察细胞转染效率,按感染复数(multiplicity ofinfection,MOI)103、104、105病毒基因组拷贝数/细胞(vector genomes/cell,v.g/cell)设组,流式细胞仪检测,筛选病毒转染的最佳MOI;设立rAAV-hTERT转染组、AAV空病毒转染组及空白细胞对照组,用反转录聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chain reareaction,RT-PCR)及免疫印迹(Western-blot)方法检测rAAV-hTERT转染后hTERT基因在髓核细胞内的表达,实时定量聚合酶链反应(real-time quantitative PCR)及酶联免疫法(enzyme linked immunosorbent,ELISA)检测髓核细胞合成Ⅱ型胶原及蛋白多糖能力的变化。结果:rAAV-EGFP转染细胞后第7天时,MOI为105v.g/cell组转染效率可达73.9%,明显高于MOI 103、104v.g/cell组(P<0.05);rAAV-hTERT转染组在转染后的第7、60、90、120天均可检测到hTERT基因的表达,而其他两组则无表达;转染rAAV-hTERT后120d之前,rAAV-hTERT转染组分泌蛋白多糖及Ⅱ型胶原较其他两组均明显增高(P<0.05),而两对照组之间则始终无明显差异(P>0.05)。结论:rAAV-hTERT能成功转染人椎间盘髓核细胞并正确表达,rAAV-hTERT转染能有效延长髓核细胞分泌Ⅱ型胶原及蛋白多糖功能。

端粒酶逆转录酶基因在口腔癌前病变及鳞癌的表达

目的 观察端粒酶催化蛋白基因 (h TRT)在口腔癌前病变及鳞癌中的表达 ,探讨其与口腔鳞癌(OSCC)发生发展及临床病理特征之间的关系。 方法 用原位杂交技术检测 5 4例标本 ,其中正常口腔粘膜 6例、上皮非典型增生 15例、口腔粘膜鳞癌 33例。 结果 正常口腔粘膜组织中 h TRT的 m RNA表达较弱 ,阳性信号仅局限于上皮基底层及副基底层间 ,阳性率 16 .6 7% (1/ 6 ) ;上皮非典型增生中 h TRT的 m RNA阳性表达见于多层上皮细胞 ,并随细胞异形性增高而表达增强 ,阳性率 6 0 % (9/ 15 ) ;口腔粘膜鳞癌组织中 h TRT的 m RNA有较强阳性表达 ,阳性率 87.88% (2 9/ 33) ;OSCC组织中 h TRT m RNA的表达与肿瘤临床病理分化无关 ,与淋巴结转移密切相关。 结论 端粒酶 h TRT基因的表达在

运用siRNA抑制K562细胞中端粒酶逆转录酶基因表达的研究

目的 建立利用小分子干扰RNA(siRNA)技术抑制白血病细胞系K562细胞中端粒酶活性的方法,为肿瘤的基因治疗提供理论依据。方法 设计端粒酶逆转录酶(hTERT)基因特异性siRNA,用体外转录方法合成hTERT基因的siRNA并转染K562细胞,培养48小时后,收集细胞,应用实时荧光定量RT PCR和westernblot方法检测转染细胞中hTERT基因mRNA水平和蛋白表达量的变化,并运用TRAPELISA方法检测细胞内端粒酶活性的变化。结果 转染siRNA后,与对照组相比,实验组hTERTmRNA水平和蛋白表达量明显降低,抑制率分别为75%和60%,同时TRAPELISA方法检测发现实验组端粒酶活性仅为对照组活性的45%。结论 hTERTsiRNA能特异性的抑制hTERT基因的表达,降低端粒酶活性,因此运用siRNA来抑制hTERT的表达可达到降低端粒酶活性的效果。

人类端粒酶逆转录酶基因反义核苷酸对白血病细胞端粒酶活性的影响

为了探讨人类端粒酶逆转录酶 (hTERT)基因反义寡核苷酸 (ASODN)对原代培养的急性髓性白血病(AML)和慢性髓性白血病 (CML)细胞端粒酶活性的影响 ,采用间接免疫荧光标记方法 ,通过流式细胞术检测hTERT基因ASODN作用于AML和CML细胞后hTERT蛋白表达含量的变化 ,采用端粒酶聚合酶链反应 酶联免疫测定 (PCR ELISA)法检测白血病细胞端粒酶活性的改变。结果显示 :hTERTASODN作用于AML和CML细胞2 4 ,48和 72小时后 ,hTERT蛋白表达水平不断降低 ;同时 ,AML和CML细胞端粒酶活性均逐渐受到抑制。结论 :hTERT基因ASODN可以通过特异性地抑制AML和CML细胞hTERT蛋白的表达 。

肺癌中端粒酶逆转录酶基因与雌、孕激素受体的表达及意义

目的:检测端粒酶逆转录酶基因(hTERT)、雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)在肺癌和肺良性病变中的 表达,探讨hTERT、ER、PR在肺癌发生、发展中的作用,在肺癌中他们的相关性以及与肺癌的组织分化程度、病理分型、 TNM分期、淋巴结转移的关系。方法:采用免疫组织化学方法(sp法)检测61例肺癌组织和15例肺良性病变组织中 hTERT、ER、PR的表达,并结合临床病理资料进行统计学分析。结果:肺癌组织中hTERT、ER、PR阳性表达率分别为 65．6％(40/61)、59．0％(36/61)、65．6％(40/61),肺部良性病变组织中hTERT、ER、PR阳性表达率分别为20．0％(3/ 15)、6．6％(1/15)、13．3％(2/15)。肺癌组织hTERT、ER、PR表达显著高于肺部良性病变组织;肺癌组织不同的病理类 型之间、TNM分期之间以及不同分化程度之间hTERT、ER、PR的阳性率未发现明显差异,但hTERT在肺癌淋巴结转移 组表达显著高于非淋巴结转移组;hTERT、ER、PR在肺癌组织中的表达之间无明显相关性;ER与PR在肺癌组织中的表 达有相关关系。结论:hTERT、ER、PR参与各型、各期和不同分化程度肺癌的发生、发展;hTERT在肺癌组织高表达和在 肺良性病变组织低表达的特性,有望使hTERT成为肺癌诊断的一种标志物;hTERT与ER、PR表达无明显相关性,提示 肺癌是由多基因参与的疾病;ER与PR协同表达可能二者互为因果,相互促进参与肺癌的发生、发展。

E.tenella端粒酶逆转录酶基因3′端序列的克隆及分析

为了获得E.tenellaTERT全长cDNA序列,本试验根据已报道的其他,原虫TERT氨基酸序列,利用CODEHOP方法设计简并引物,同时利用Trizol法提取总RNA并反转录为cDNA,然后采用3-′RACE方法克隆获得E.tenellaTERT 3′cDNA序列,并采用生物信息学技术进行序列分析。结果表明,该序列具有TERT蛋白家族特征性基序,证明成功克隆了E.tenellaTERT 3′cDNA序列。

外源端粒酶逆转录酶基因对老年大鼠供肝缺血再灌注损伤的影响

目的探讨外源端粒酶逆转录酶基因对老年大鼠供肝缺血再灌注损伤的影响。方法 SD大鼠分为端粒酶催化亚基（h TERT）干预组（n=25）、空转载体组（n=5）、生理盐水组（n=25）3组,取肝前2 d自颈背给予h TERT干预组供者静脉注射1 ml 3×10^9pfu/ml携带h TERT的病毒悬液,给予空转载体组供者静脉注射1 ml 3×10^9pfu/ml空病毒悬液,给予生理盐水组供者静脉注射1 ml生理盐水。结果再灌注后3、6、12 h,1、2 d h TERT组血清谷氨酸转氨酶（ALT）水平均显著低于空转载体组和生理盐水组（P〈0.05）,凋亡阳性细胞均显著少于空转载体组和生理盐水组（P〈0.05）,凋亡指数也均显著低于空转载体组和生理盐水组（P〈0.05）;转染1 d后h TERT组肝细胞端粒酶活性显著高于阴性对照组和阳性对照组（P〈0.05）。结论外源端粒酶逆转录酶基因能够有效防护老年大鼠供肝缺血再灌注损伤。

恶性肿瘤端粒酶逆转录酶基因的表达及调控研究进展

人端粒酶是一个核糖核蛋白 ,在大多数恶性肿瘤和永生化细胞中广泛表达。人端粒酶逆转录酶是端粒酶的关键催化亚单位 ,对端粒酶活性起重要的调控作用。端粒酶逆转录酶的表达水平与端粒酶活性密切相关 ,且端粒酶逆转录酶基因表达的调控方式是多因子 。

人类端粒酶逆转录酶基因的反义寡核苷酸对HeLa细胞的端粒酶活性的研究

目的:研究人类端粒酶逆转录酶RNA(hTR)的反义寡核苷酸对HeLa细胞端粒酶活性的影响。方法:采用PCRELISA法检测HeLa细胞在反义寡核甘酸处理前后端粒酶活性的变化。结果:经反义寡核苷酸处理后,HeLa细胞的生长受到抑制,端粒酶活性明显降低。结论:hTR的反义寡核苷酸显著抑制肿瘤细胞的端粒酶活性,为恶性肿瘤治疗提供了一条新的有效的途径。

胃复方对人胃癌BGC-823细胞移植瘤裸鼠作用及其对c-Myc、人端粒酶逆转录酶基因表达的影响

目的:观察胃复方对人胃癌BGC-823裸鼠的抑瘤作用及c-Myc、人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因表达的影响,评估胃复方作用及其可能的作用机制。方法:建立人胃癌BGC-823裸鼠模型;将成功建立的裸鼠胃癌皮下移植瘤模型的40只荷瘤鼠随机分为5组(n=8):模型对照组、胃复方低剂量组、胃复方高剂量组、氟尿嘧啶组、氟尿嘧啶联合中药组,连续给药4周。每7天记录肿瘤长径、短径,计算瘤体体积并绘制肿瘤生长曲线图;给药4周后处死所有荷瘤鼠,剥离皮下移植瘤,称瘤重、计算抑瘤率;免疫组织化学法检测瘤体组织c-Myc、hTERT蛋白表达。结果:1)胃复方对人胃癌BGC-823裸鼠移植瘤具有明显抑制作用,各剂量间有量效关系。其中胃复方低剂量组、胃复方高剂量组、氟尿嘧啶组、氟尿嘧啶联合中药组的抑瘤率分别为21.06%、45.89%、30.65%、59.42%。氟尿嘧啶联合中药组效果最好。2)瘤重显示与模型组比较,各药物组瘤重均有不同程度的减轻,差异有统计学意义(P<0.05);其中氟尿嘧啶联合中药组降低明显。3)肿瘤生长曲线图显示与模型组比较,各药物组瘤体积均有一定程度缩小,差异有统计学意义(P<0.05)。4)与模型组比较,药物组均能下调c-Myc、hTERT蛋白表达量,差异有统计学意义(P<0.05),其中氟尿嘧啶联合中药组下降最明显。结论:胃复方能够抑制人胃癌BGC-823细胞BALB/c-nu裸鼠皮下移植瘤生长,可能与下调c-Myc、hTERT蛋白表达有关,并且与氟尿嘧啶联合用药有增效作用。

转移人端粒酶逆转录酶基因的实验研究

目的 转移人端粒酶逆转录酶基因 (hTERT基因 ) ,建立其转移体系。方法 用脂质体转染的方法将逆转录病毒载体PLNC hTERT转入 ψ 2细胞 ,用产病毒的 ψ 2细胞克隆培养上清重复感染PA317细胞 ,建立产毒PA317/hTERT细胞 ;通过感染内皮细胞检测基因转移效果。结果 ψ 2细胞培养上清重复感染 ,使PA317细胞所产病毒滴度提高 2 0倍 ,得到高滴度的PA317/hTERT包装细胞系。用该细胞系产生的病毒上清感染内皮细胞成功。