长江上游鱼类环境DNA通用引物的选择与验证

为了选择出适合使用eDNA技术对长江上游鱼类多样性进行研究的通用引物,本研究选择10对扩增序列位于12S rRNA、16S rRNA、Cytb和COⅠ基因片段的常用引物,分别为Mifish-U、AcMDB07、Teleo、12SPv、Fish16S1、Ve16S1、PSI、G、VeCB1、FishCB,对长江上游常见的32种鱼类和3种其他水域鱼类肌肉组织提取的DNA扩增。结果显示,有6对引物均能扩增出全部35种鱼类,但引物Mifish-U的扩增效果最好。进一步使用引物Mifish-U对长江上游屏山县、涪陵区和巫山县3个采样点的水样eDNA进行高通量测序,共检测到80种鱼类,包括本研究使用的32种长江上游鱼类,其辨别度较高。使用引物Mifish-U对室内养殖3种鱼类的水样eDNA进行高通量测序后定性定量分析,结果显示黄颡鱼和鲤的生物量与序列数相关性显著,引物Mifish-U进行eDNA定量分析的潜力较大。研究表明,引物Mifish-U更适合作为eDNA研究长江上游鱼类多样性的通用引物。本研究可为利用eDNA技术监测长江上游鱼类多样性的引物选择提供参考。

基因Ⅰ、Ⅳ型戊型肝炎病毒高灵敏度通用引物的设计和初步应用

设计针对国内流行的戊型肝炎病毒(HEV)基因Ⅰ、Ⅳ型,在这两型序列的保守区域设计了一套RT-PCR引物--E引物,并将E引物与目前较常用的3对通用引物(Meng、ConORF1和ConORF2引物)比较了检测基因Ⅰ、Ⅳ型HEV的灵敏度.对基因Ⅰ型HEV,E引物能检出的稀释度为105,参考引物能检出的稀释度为102～104;对基因Ⅳ型HEV,E引物能检出的稀释度为102,参考引物能检出的稀释度为101～102.在17份HEV-IgM阳性血清中,E引物检出5份,检出率为29.4%;参考引物只能检出1份或2份,检出率最高为11.8%.E引物在33份HEV-IgM阳性的隐性感染血清中检出6份,阳性率18.2%;在79份HEV-IgM阳性的临床肝炎血清中检出36份,阳性率45.6%.以上结果初步表明,对于在国内流行的基因Ⅰ、Ⅳ型HEV,E引物的检测灵敏度要高于目前常用的通用引物.

通用引物PCR方法在地表水病原菌检测中的应用

为了探索通用引物PCR方法在地表水病原细菌检测中的应用价值,利用16S rRNA基因的高度保守性,设计并合成细菌的通用引物,采用合成的引物扩增参考菌株及西安市区不同地表水样,并对PCR产物分别进行序列测定及序列同源性分析,同时检测水样中的细菌总数和粪大肠杆菌浓度.结果显示,通用引物扩增4种参考菌株,320 bp处均可得到清晰的电泳条带,其特异性通过序列测定及同源性分析得到进一步验证;通用引物PCR可检出250 ng/L的埃希氏大肠杆菌标准菌株DNA,其PCR检测的灵敏度可达0.275 CFU/mL;用通用引物对西安市区不同地表水样进行PCR扩增,其中河、兴庆湖、大唐芙蓉园北湖、北石桥污水处理厂出水样品320 bp处都得到了清晰的电泳条带,而黑河水样没有条带;与之相对应的粪大肠杆菌群检测结果显示,只有北石桥污水处理厂出水和兴庆湖水样有粪大肠杆菌检出.

通用引物多重PCR技术检测3种病原微生物

为寻找快速且准确的病原微生物检测方法,在普通多重PCR（polymerase chain reaction）技术的基础上研究一种新的通用引物多重PCR（universal primers-multiplex PCR,UP-M-PCR）技术。利用该技术对食品中主要的3种致病菌——大肠杆菌、单增李斯特菌和沙门氏菌进行同时检测,经过单重PCR验证、二重以及三重UP-PCR反应条件和体系优化。结果表明,该方法的最低检测限为0.5pg目标DNA,复合引物和通用引物的加入量分别为2nmol/L和300nmol/L。此方法检测灵敏度高、病原菌检测限低,可在实践中应用。

采用通用引物PCR配合SSCP和RFLP技术检测鱼病病原菌

采用通用引物PCR(UPPCR)、PCR RFLP、PCR SSCP技术 ,研究快速鉴别鱼病病原菌的分子生物学诊断技术。结果发现 ,采用细菌 16SrRNA基因保守区特异性引物 ,以嗜水气单胞菌、鲁克氏耶尔森菌、鳗弧菌、柱状曲挠杆菌、乙型链球菌、荧光假单胞菌等部分常见鱼病病原菌为对象 ,可以建立一种UPPCR技术。该技术能在保证实验条件不变的基础上 ,检出上述所有细菌 ,并还可检出大肠杆菌和双歧杆菌等非鱼病病原菌。并且认为 ,该法与SSCP配合即采用UPPCR SSCP技术能较好地鉴别被检菌而用于鱼病病原菌的快速诊断。

用通用引物扩增细胞色素b基因进行牦牛肉的鉴定

本研究的目的是建立牦牛和黄牛肉的基因水平鉴定方法。从牦牛、黄牛和四川几个地方黑山羊品种的肉中提取基因组DNA,采用一对通用引物扩增细胞色素b基因中一段长度为421bp的序列,并进行了克隆测序。结果显示,通用引物能很好地扩增不同动物细胞色素b基因,扩增片段序列在牦牛与黄牛之间存在差异较大,能用于这两种肉的鉴定;而在金堂黑山羊、白玉黑山羊和美姑黑山羊之间差异非常小。本研究建立了PCR-RFLP方法鉴定牦牛和黄牛肉,这对于动物保护以及来源不明的肉类产品的区分具有实际应用价值。

双翅目昆虫线粒体基因组结构特点及其测序通用引物的设计和应用

研究双翅目昆虫线粒体基因组的结构特点,并设计其测序的通用引物,为今后双翅目昆虫线粒体基因组的研究提供参考和依据。利用比较基因组学和生物信息学方法,分析了已经完全测序的26个双翅目昆虫线粒体基因组的结构特点、碱基组成和保守区,并据此设计了双翅目昆虫基因组测序的通用引物。结果表明:双翅目昆虫线粒体基因组长14503～19517bp,其结构保守,含有37个编码基因,包括13个蛋白质编码基因,22个tRNA编码基因和2个rRNA编码基因,此外还包含一段长度差异很大的非编码区(AT富含区)。基因组内基因排列次序稳定,除个别基因外,其余都与黑腹果蝇Drosophila melanogaster基因排列次序一致。基因组的碱基组成不均衡,AT含量在72.59%～85.15%之间,碱基使用存在偏向性,偏好使用AC碱基。全基因组的核苷酸和氨基酸序列保守,共鉴定了11个保守区。在保守区内共设计了26对双翅目线粒体基因组测序通用引物,扩增的目标片段都在1200bp以内。将该套通用引物用于葱蝇Delia antiqua线粒体全基因组测序,结果证明其高效、合用。

免疫捕捉-通用引物PCR检测食品中沙门氏菌

利用免疫吸附富集结合经典PCR技术建立免疫捕捉通用引物PCR(IC-UPPCR)检测食品中沙门氏菌。采用细菌16SrRNA基因保守区设计特异性引物,建立通用引物PCR技术是可行的,该IC-UPPCR检测沙门氏菌的灵敏度最低,能检测到2×102CFU/ml,检测沙门氏菌属和非沙门氏菌属标准株的特异性为100%,无假阳性和假阴性出现。结果表明该方法具有简单、快速、特异性好和敏感性高等特点,并可满足大批样品沙门氏菌筛选检测的要求,适用于食品卫生监管、商品检验检疫以及临床诊断等领域。

应用通用引物PCR检测诊断细菌和真菌性中枢神经系统感染的价值

目的了解细菌和真菌性中枢神经系统(CNS)感染病原谱,并探讨通用引物聚合酶链反应(PCR)检测技术的病原学诊断价值。方法收集某院2009年1月—2015年3月疑似或确诊CNS细菌或真菌性感染患者资料,分析其脑脊液培养病原菌种类,采用细菌16S rRNA和真菌28S rRNA通用引物对患者脑脊液DNA进行PCR扩增和序列测定,并与同期脑脊液培养及鉴定结果进行比较。结果共收集确诊或疑似CNS细菌或真菌感染者400例,其中脑脊液培养阳性132例。共分离病原菌150株,其中革兰阳性菌48株,革兰阴性菌90株,真菌12株;居前3位的细菌为鲍曼不动杆菌(32株)、凝固酶阴性葡萄球菌(16株)和肺炎克雷伯菌(13株);最常见真菌为新生隐球菌(8株)。选取88份感染患者脑脊液标本和20例非感染患者脑脊液进行PCR扩增,PCR扩增法灵敏度(35.23%,31/88)高于培养法(28.41%,25/88)(χ2=4.17,P<0.05)。PCR扩增和培养法阴性预测值分别为25.97%、24.10%,两种方法的特异度、阳性预测值均为100.00%。PCR扩增测序与培养结果符合率为84.00%(21/25);PCR检测平均报告时间(48 h)较培养结果报告时间(细菌平均约72 h,真菌平均约96 h)更快速。结论 CNS感染病原分布广泛,以革兰阴性菌为主;通用引物PCR检测具有快速、灵敏、准确等特点,具有良好的临床推广和应用价值。

应用通用引物建立巢式逆转录聚合酶链反应检测肠道病毒(英文)

目的设计通用引物建立巢式逆转录聚合酶链反应(RT-n-PCR),以达到广泛。特异及快速诊断肠道病毒(Enterovirus,EV)感染。方法在EV基因组5'端非编码区(5'-UTR)设计二对通用第物,建立RT-n-PCR检测方法,对3种EV和3种非EV标准株以及165例可疑EV感染的327份临床标本进行检测。结果EV标准株均在电泳中检测到一清晰312bp扩增条带,而非EV标准株则无扩增条带;共有104份标本检测到相应大小扩增条带,阳性率31.8%;147例病例同时检测了粪便和咽拭子,粪便阳性49例,咽拭子阳性44例,其中粪便和咽拭子同时阳性35例,粪便和咽拭子EV阳性比较无显著性差异(P>0.05)。病例总阳性数64例,阳性率38.8%。结论RT-n-PCR可以准确地检测出肠道病毒,特异性强,用时少,同时检测多份标本可以提高EV阳性率。

家兔皮肤真菌通用引物PCR检测和培养鉴定的比较研究

本研究比较了家兔皮肤真菌通用引物PCR检测方法与培养鉴定方法的敏感性,探讨了通用引物PCR检测方法的特异性及其在皮肤真菌诊断中的意义。根据皮肤真菌特异性rDNA序列设计通用引物,对已知分离株及不同微生物进行特异性检测,应用该引物对40份兔患部病料进行PCR检测并克隆测序;同时,采用培养鉴定对40份病料进行表型分析。PCR检测结果显示,家兔四种常见病原性皮肤真菌可扩增出400～500 bp之间的条带,其它微生物和兔体细胞均为阴性,说明该方法具有特异性;33份临床病料检测为阳性,扩增条带均为460 bp,经测序为须癣毛癣菌。培养法的阳性为26份,检测结果与前者一致。与传统的培养鉴定方法相比,本研究建立的通用引物PCR检测方法,操作简便、特异性高,可用于大规模的家兔皮肤真菌病检测和流行病学调查,并具有重要的公共卫生意义。

通用引物PCR检测临床常见致病菌的实验研究

通用引物可一次性扩增18种临床常见致病菌和耐药菌株的DNA,扩增片段长度在220bp左右,18种特异性探针分别与18种标准菌株的PCR扩增产物杂交结果显示探针都具有高度特异性;5种37例经法国梅里埃API细菌鉴定系统确定的临床分离菌株进行杂交鉴定,鉴定结果与分离株一致,表明设计的探针具有高度特异性及准确性。80例临床标本分别用法国梅里埃API细菌鉴定系统及PCR杂交法进行检测,阳性率分别为(52.5%)和(67.5%),表明PCR结合寡核苷酸杂交法比传统的生物学培养法更为灵敏,值得推广。

应用荧光标记通用引物检测鲤鱼(Cyprinus Carpio)微卫星基因型

应用荧光标记通用引物检测微卫星是一种省成本、省时间、高效精确的基因型检测方法。本文介绍了该方法的基本原理和操作流程,并首次应用此方法检测鲤微卫星标记的基因型。结果显示,除位点HLJ179未检测到有效数据外,其它14个位点都采集到相应的基因型。该方法在鲤微卫星基因分型上的成功应用,为今后鲤大规模连锁分析提供了一种更经济有效的检测方法。

通用引物PCR法在人乳头瘤病毒基因检测中的应用

目的建立通用引物PCR法检测人乳头瘤病毒(HPV)基因,探讨其在临床辅助诊断中的应用价值。方法收集400份标本,其中男性119份,女性281份。标本均使用通用引物对MY11/09扩增HPV L1基因片段。同时扩增β球蛋白(β-globin)基因作为内对照。结果400份标本中,72份标本HPV L1基因阳性,阳性率为20.5%。20～岁组男女HPV的检出率最高。患有性病(淋病、尖锐湿疣)、不孕症、宫颈炎、非淋菌性阴道炎等疾病的女性,HPV L1基因的检出率分别为75.0%、25.0%2、1.4%、19.1%。男性性病(淋病、尖锐湿疣)、前列腺炎、非淋菌性尿道炎、不育症患者的HPV L1基因检出率分别为66.7%、16.7%、13.6%、5.7%。结论HPV L1基因的检出率较高。通用引物PCR法在临床检验中具有较高的敏感性和特异性。

结合通用引物快速简便鉴定阳性克隆的PCR方法

通用引物与载体多克隆位点两端序列互补,将目的片段构建入载体pGEM-T Easy中,利用载体通用引物M13F和M13R结合片段特异引物进行菌液PCR反应。用PCR产物电泳结果来筛选阳性克隆并鉴定目的片段插入方向,同时能有效对短插入片段重组子进行筛选与鉴定。最终以DNA测序结果来验证,与测序结果一致,显示通用引物PCR方法对阳性克隆的筛选和鉴定优于传统酶切和普通PCR鉴定方法,能够弥补传统方法的不足,且简便快速,可作为筛选和鉴定阳性克隆的有效手段。

通用引物扩增甲型流感病毒基因组及其高通量测序

为探索使用高通量测序方法测定甲型流感病毒的基因组,设计了一对通用引物进行甲型流感病毒全基因组的RT-PCR扩增,并分析了该方法的敏感性。结果显示,该方法能够扩增的甲型流感病毒多种亚型的全部8个节段的基因,其扩增敏感性为100 pg RNA。

一种用于微阵列分析的通用引物U_2联合标记方法(英文)

目的报告一种新的用于微阵列研究的荧光标记技术:通用引物U2联合标记技术(UPL);比较UPL与随机引物等其他标记方法的效率和可重复性。方法分别用4种标记方法标记流感病毒RNA样品,与流感病毒寡核苷酸检测芯片杂交后,用Spss10.0软件对杂交结果进行分析。结果UPL方法在标记物杂交的荧光强度、信噪比、探针真阳性率和可重复性等方面均高于随机引物逆转录掺入标记法,而与其他两种RD标记方法相当,但标记过程相对更加简单。结论UPL方法是一种新颖而有效的标记方法,在微阵列技术研究方面具有广泛的应用价值。

细菌通用引物在奶牛乳房炎病原菌检测中的作用研究

为了建立PCR直接检测奶牛乳房炎致病菌的方法,探索通用引物在奶牛乳房炎致病菌检测中的应用价值。利用16S rRNA基因的高度保守性,设计并合成细菌的通用引物,采用合成的引物扩增标准菌株及患有奶牛乳房炎的奶样。结果表明,通用引物扩增7 种标准菌株,370 bp处均可得到清晰的电泳条带;通用引物PCR 可检出250 ng/L的金黄色葡萄球菌标准菌株DNA;对患有奶牛乳房炎的奶样进行扩增,370 bp处也得到了清晰的电泳条带。建立在16S rRNA基础上的通用引物在奶牛乳房炎的检测中,初步显示具有特异、快速等优点,为进一步判断细菌的种类奠定了基础。

通用引物PCR法在人乳头瘤病毒基因检测中的应用

目的建立通用引物PCR法检测人乳头瘤病毒(HPV)基因的方法,探讨其在临床辅助诊断中的应用。方法收集787份标本,其中来自男性160份,女性标本627份。标本均使用通用引物对MY11/09扩增HPVL1基因片段。同时扩增β球蛋白(β-globin)基因作为内对照。结果787份标本中,191份标本HPVL1基因阳性,阳性率为24.3%。男性20～岁组HPV的检出率最高,女性30～岁组HPV的检出率最高,但均无年龄上的显著性差异。患有性病(淋病、尖锐湿疣)、不孕症、宫颈炎、非淋菌性阴道炎等疾病的女性,HPVL1基因的检出率分别为83.3%、20.9%、22.7%、28.0%。男性性病(淋病、尖锐湿疣)、前列腺炎、非淋菌性尿道炎、不育症患者的HPVL1基因检出率分别为42.9%、18.9%、12.5%、7.8%。结论HPVL1基因的检出率较高。通用引物PCR法在临床检验中具有较高的敏感性和特异性。

通用引物SPF1/GP6++与SPF1/GP6+聚合酶链式反应检测多型别人乳头瘤病毒敏感度的比较

目的对比通用引物SPF1/GP6++与SPF1/GP6+PCR两种方法检测人乳头瘤病毒(HPV)的敏感度和感染型别范围。方法以包含HPV16全长DNA序列的质粒为模板,应用HPV L1基因型别特异性引物进行PCR扩增,获得15种型别HPV模拟靶基因序列并克隆入p EASY-T1载体,将梯度稀释的重组质粒掺入50 ng正常人基因组DNA,模拟各型别HPV感染的待测样本,对比SPF1/GP6+和SPF1/GP6++两组通用引物的检测敏感度。进一步在68例人宫颈癌组织DNA样本中进行对比验证。结果与SPF1/GP6+PCR比较,SPF1/GP6++PCR对HPV11,31,34,39,51,52,53,56,58,61和66型别的检测敏感度提高了1到2个数量级,对于HPV16,18,33和35常见感染型别的检测敏感度相似。应用SPF1/GP6++PCR检测宫颈癌组织HPV感染的总阳性率为98.5%(67/68),检测到11例双重感染和2例三重感染;而应用SPF1/GP6+PCR检测的总阳性率为95.6%(65/68),仅检测到7例双重感染。结论在SPF1/GP6+PCR基础上建立了SPF1/GP6++PCR方法,并证实SPF1/GP6++PCR具有更高的检测敏感度和更广的HPV型别检测范围。