香蕉遗传转化体系优化

香蕉(Musa spp.)高度不育和多倍体特性严重阻碍常规育种方法的应用,而香蕉遗传转化技术存在基因型依赖性强、转化效率偏低等问题。以贡蕉(Musa acuminata cv.Mas)多芽体为起始转化材料,利用根癌农杆菌介导β-葡萄糖苷酸酶基因(GUS)介导转化,通过研究外植体转化状态、不同转化载体及乙酰丁香酮(acetosyringone,AS)孵育时间、农杆菌菌液浓度、预培养时间、不同农杆菌菌株和共培养方式对香蕉遗传转化过程的影响,优化遗传转化条件,以期获得高效的香蕉遗传转化体系。结果表明,以贡蕉多芽体薄切片为外植体,黑暗条件下预培养1 d,使用以p CAMBIA1304构建的植物表达载体EHA105农杆菌制备侵染液时,AS孵育0~4 h,侵染液农杆菌OD600为0.4~0.6,侵染后将多芽体切片放置在固体MS培养基(添加200μmol/L AS)上进行共培养,再生植株转化效率较好。通过优化遗传转化体系的条件,提高香蕉遗传转化率,为解决产业发展关键技术难题及精准定向分子育种提供技术支撑,为香蕉产业的健康可持续发展提供重要保障。

褐角苔遗传转化体系的建立

本研究旨在筛选适用于农杆菌(Agrobacterium)介导的角苔植物遗传转化体系,为今后研究早期陆生植物的进化提供理论基础。实验使用携带p CAMBIA1305.2质粒的农杆菌AGL1菌株对褐角苔(Folioceros fuciformis)外植体进行侵染,将潮霉素作为筛选标记,通过比较外植体预培养时间、菌液OD值、菌液添加量、乙酰丁香酮(AS)浓度和共培养时间来构建该物种的遗传转化体系。结果表明,褐角苔抗性植株筛选所用潮霉素的最适浓度为15 mg/L,预培养4 d的外植体侵染后状态最好。最佳侵染条件为共培养基中添加80μL OD600为0.8的农杆菌菌液,AS浓度为100μmol/L,共培养时间为3 d。通过潮霉素筛选、PCR、实时荧光定量PCR(RT-q PCR)和β-葡萄糖苷酸酶(GUS)染色鉴定获得转基因植株褐角苔。研究结果可为后续角苔植物基因功能的研究提供技术支持。

‘窄冠白杨1号’遗传转化体系建立与抗虫基因转化

‘窄冠白杨1号’(Populus leucopyramidalis 1)是一种冠形窄、耐盐碱的优良白杨派无性系。由于缺乏其遗传转化体系,因此无法通过基因工程手段对其进行遗传改良。该研究以‘窄冠白杨1号’为材料,建立了农杆菌介导的遗传转化体系,并获得了较高的遗传转化效率。首先将组培苗继代培养不同时间段(35、45、55、65 d),分别取其3种组织(叶片、叶柄、茎段)以对比分化能力的强弱,确定了继代45 d后的叶片具有最强的分化能力,其增殖倍数为8.77。随后,使用继代45 d后的叶片作为遗传转化的材料,研究不同侵染条件对转化率的影响,设立了菌液浓度、侵染时间和共培养时间各3个梯度的正交试验,对这3个因素进行最佳水平筛选,通过PCR检测和GUS染色鉴定转基因株系。结果表明‘窄冠白杨1号’遗传转化体系的最佳组合为:菌液浓度OD600=0.4,侵染时间15 min,共培养时间2 d,在该组合下转化率最高可达54.23%。最后,利用该遗传转化体系获得了转BtCry3Aa抗虫基因‘窄冠白杨1号’株系,证明该体系可以做为‘窄冠白杨1号’遗传改良的有效方法。

白花玉石籽石榴遗传转化体系的建立

【目的】为更好地研究石榴的基因功能,以白花玉石籽石榴为试材,构建出一种农杆菌介导的石榴遗传转化体系。【方法】在已有的石榴组织培养体系的基础上,通过筛选不同外植体和优化激素组合,获得石榴最佳再分化途径;探究农杆菌介导法中抗生素浓度、预培养时间、菌液浓度、侵染时间和抑菌剂浸洗时间对白花玉石籽石榴遗传转化效率的影响。【结果】终质量浓度为0.22 mg·L^(-1)6-BA和0.60 mg·L^(-1) IBA的WPM培养基能显著提高石榴外植体的再分化率,其中嫩茎分化率达96.30%±5.20%;50 mg·L^(-1)卡那霉素和200 mg·L^(-1)特美汀是筛选抗性芽的最佳质量浓度;白花玉石籽石榴遗传转化的最适组合为:预培养3 d、菌液OD600=0.8、侵染10 min、200 mg·L^(-1)特美汀浸洗15 min。最后,通过检测GFP荧光,验证上述遗传转化体系所获得的植株,阳性率为26.00%。【结论】成功建立了农杆菌介导的白花玉石籽石榴嫩茎遗传转化体系,为石榴基因功能验证提供有力的技术支持。

冰草种间杂种蒙农杂种组织培养再生和遗传转化体系的建立

以冰草属(AgropyronGaertn.)中的1个优质种间杂种——“蒙农杂种”冰草(A.cristatumA.desertorumcv.‘Mengnong’)为材料,以幼穗为外植体,建立了组织培养再生与遗传转化体系。试验中所用诱导愈伤组织的培养基为改良MS+2,4-D2.0～3.0mg·L-1,愈伤组织诱导率平均为83.4%;分化培养基为MS(无附加成分),分化率达59.6%;在1/2MS培养基上生根后得到完整小植株。在此基础上,以抗除草剂基因bar为目标基因,用基因枪法转化幼穗诱导的愈伤组织,并对再生植株进行PCR和Southern鉴定,以及在含除草剂(0.5mg·L-1的Glufosinate)培养基中可正常生长的结果表明,外源基因已整合到受体基因组DNA中,转化率为1.1%。

农杆菌介导的马铃薯试管薯遗传转化体系的优化及反义class Ⅰ patatin基因的导入(英文)

用两个马铃薯栽培品种“鄂马铃薯 3号”和“甘农薯 2号”的试管薯为供体材料 ,建立了一种农杆菌介导的简单、快速和高效的遗传转化系统。在含有 75mg L卡那霉素的选择培养基上 ,2～ 3周可产生抗性芽 ,4～ 5周获得完整的转基因植株。筛选出了试管薯遗传转化的优化条件 ,特别是在再生培养基中加入 2mg L玉米素 ,两个品种的转化频率分别高达 4 5 .5 %和 4 3.9%。周期短 (4～ 5周 )、一步培养和转化频率高 ,使该转化体系能够广泛用于马铃薯转基因的研究。用含有反义classⅠpatatin基因的表达载体pBSAP转化两个品种 ,共获得 12 0株卡那霉素抗性植株。PCR、PCR Southern和Northern杂交分析证明 ,此反义基因已整合到马铃薯基因组中并在转基因植株中正常转录。反义基因的表达导致部分转基因植株的试管结薯株率和单株结薯数降低。结果表明 ,该classⅠpatatin基因可能参与了块茎形成的调控。

农杆菌介导的假俭草遗传转化体系的建立

以假俭草优良种质‘E126’为受体材料,以HPT基因为报告基因,通过农杆菌介导法转入ZjDREB1基因。研究了转化体系中筛选剂和抑菌素对胚性愈伤组织生长和绿苗分化的影响,以及菌液浓度、侵染时间和共培养时间对转化效率的影响。结果表明,愈伤筛选和再生苗筛选的最佳潮霉素浓度均为30 mg/L,头孢霉素作为抑菌素的最佳浓度为400 mg/L;菌液OD600值为0.3,侵染30 min,共培养3 d为最优转化条件。经PCR检测,初步获得10株转基因植株。

农杆菌介导的花生遗传转化体系的优化

以花生胚小叶及其诱导形成的愈伤组织为转化受体,采用农杆菌介导法,通过评估外植体GUS基因瞬时表达率,优化花生遗传转化条件。结果表明,侵染液中添加表面活性剂2-氮吗啉乙烷磺酸(MES)150mg/L或烟草提取物0.5ml/30ml有利于提高胚小叶外植体GUS瞬时表达率;采用针刺法辅助农杆菌介导转化,其胚小叶外植体多点GUS瞬时表达率(29.1%)明显高于未针刺的对照(12.1%);利用愈伤组织作为转化受体,其多点GUS瞬时表达率高达70.1%。利用此优化体系进行花生遗传转化,获得的抗性苗2011年经嫁接、移栽于试验田,PCR检测获得了T0代转基因植株,2012年部分T1代植株也检测出目的条带。

芥菜农杆菌高效遗传转化体系初步建立

采用农杆菌导入法,探讨了影响芥菜农杆菌遗传转化效率的因素,优化了参数,初步建立了以MS+6 BA(2 0mg/L)+NAA(0 2mg/L)为分化培养基,预培养时间3或4d,共培养时间4d,农杆菌浓度D600nm为0 5,浸菌时间10min,筛选压Kan为25mg/L的遗传转化体系.

农杆菌介导高羊茅遗传转化体系的建立

为建立农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导高羊茅(Festuca arundinaceaSchreb.)遗传转化体系,以草坪型高羊茅品种凌志的胚性愈伤组织为受体材料,通过gus基因瞬时表达检测,研究了多种因素对农杆菌介导转化的影响。结果表明,农杆菌介导高羊茅胚性愈伤组织转化的适宜条件为:愈伤组织在含BAP和NAA各0.5mg/L的培养基上预培养3d;菌液浓度OD600值0.7,感染时间15min;农杆菌预培养基和悬浮培养基以及共培养基中添加100μmol/L的乙酰丁香酮;共培养温度23℃,共培养时间3d,共培养基pH值5.2。不同浓度潮霉素筛选效果试验表明,采用低浓度(50mg/L)潮霉素连续筛选,再生获得的转基因植株数最多,因此是最为可取的筛选方式。

地被菊‘中国红’再生及遗传转化体系的建立

为建立地被菊‘中国红’的再生和遗传转化体系,以其无菌苗叶片为外植体,通过添加不同浓度的生长调节剂,研究其对诱导愈伤组织、不定芽的影响,并利用根瘤农杆菌介导法对地被菊‘中国红’叶片进行遗传转化,研究影响菊花转化的若干因素,建立一套高效的遗传转化体系。结果表明:地被菊‘中国红’在MS+2.0mg·L-16-BA+0.2mg·L-1NAA的培养基上获得了最高的不定芽分化率(89.6%);地被菊‘中国红’的最适生根培养基为1/2MS+0.3mg·L-1NAA,生根率达100%;其叶片外植体的遗传转化条件:OD600=0.6、农杆菌侵染时间为7min、共培养48h、延迟培养2d、卡那霉素筛选浓度为15mg·L-1、头孢霉素抑菌浓度为300mg·L-1。本研究为进一步开展菊花的基因工程育种奠定基础。

多年生黑麦草多基因遗传转化体系的建立与优化

以多年生黑麦草品种玲珑的愈伤组织为受体材料,建立了适用于农杆菌介导的转基因组织培养体系,并对耐盐相关基因SOS1、SOS2、SOS3、CBL10和BAR基因进行转化。结果表明,以成熟种子作为外植体诱导胚性愈伤的最佳培养基为MS+7mg/L 2,4-D+500mg/L水解酪蛋白,最佳分化培养基为2.0mg/L 6-BA+0.2mg/L 2,4-D;愈伤筛选和再生苗筛选的最佳除草剂浓度为5mg/L PPT;筛选出的最佳侵染时间为20min,共培养时间为2d,建立了多年生黑麦草有效的遗传转化体系。

胡萝卜再生体系及高效遗传转化体系的建立

胡萝卜是一种重要的世界性蔬菜 ,其丰富的营养成分、高β-胡萝卜素及鲜食特性 ,使之成为植物反应器的理想作物。本研究以栽培品种“新黑田五寸人参”为材料 ,研究了胡萝卜组织培养及遗传转化体系。得到了如下结论 ,愈伤诱导培养基及继代培养基为 B5附加 0 .5 mg/ L 2 ,4-D和 0 .5 mg/ L 6 -BA,最适于转化的外植体为弱光下萌发的 7～ 10天龄无菌苗之下胚轴 ,最适卡那霉素浓度为 10 0 mg/ L,添加低浓度的乙酰丁香酮 ( 2 5 μM)有利转化 ,抗性植株再生时 。

农杆菌介导的优良玉米自交系遗传转化体系的建立

以杂交育种中广泛使用的优良玉米自交系340、4112为材料 ,用带有质粒pGBIL04(actin.Bt.35S .bar)的根癌农杆菌LBA4404转化其幼胚及其初始愈伤组织 ,经PPT抗性筛选后分化再生植株。PCR分子检测初步证明Bt基因已整合到再生植株基因组中 ,转化率为1.68 %～4.44%。本实验利用转化受体的抗性筛选频率对转化体系进行了优化 ,结果表明 :比较适宜的感染液浓度为OD600=0.5;预培养有利于幼胚转化 ,预培养时间以刚刚诱导出新鲜稳定的初始愈伤为宜 ;

农杆菌介导优良玉米自交系Ⅱ型胚性愈伤组织遗传转化体系的建立

以玉米自交系8902、340、4112未成熟幼胚为材料,诱导、继代筛选出良好的Ⅱ型胚性愈伤组织,用农杆菌(EHA105和LBA4404)介导法转化其愈伤组织。利用本室构建的植物双元表达载体中携带的GUS报告基因对农杆菌转化系统的条件进行了研究,如农杆菌的侵染浓度、菌种类型、侵染时间、As(乙酰丁香酮)浓度及基因型等,建立了农杆菌介导优良玉米自交系Ⅱ型胚性愈伤组织高效遗传转化体系。

农杆菌介导的河北杨遗传转化体系的建立

以兼具生态和能源植物功能的木本模式植物——杨树(河北杨)为材料,研究了携带促生长基因(35S-DAS5)的根癌农杆菌载体介导的河北杨遗传转化若干因素对转化效果的影响。结果显示,较适宜的转化系统为预培养2-4 d,农杆菌菌液(OD600值为0.4)侵染20 min,共培养4 d,在含30 mg/L卡那霉素(Km)的培养基上诱导不定芽,生根培养基中Km的适宜浓度为10 mg/L。

蝴蝶兰的组织培养和遗传转化体系的研究进展

蝴蝶兰是观赏价值和经济价值很高的著名盆栽植物,用种子、茎尖、茎段、根尖、叶、花梗等外植体进行组织培养均获得了成功。不同外植体、不同培养基和不同激素种类及配比、不同浓度的6-BA和NAA组合对蝴蝶兰原球茎诱导率有显著影响。在兰花的转基因研究中,以基因枪法成功转化的报道最多,其次是农杆菌介导法,其它转化方法还有PEG法、电激法、花粉管通道法等。但仍需进一步探索和完善蝴蝶兰遗传转化体系,为以后目的外源基因的转入奠定基础,同时对于蝴蝶兰转基因技术的研究以及生物技术在兰花上的应用也具有重要的现实意义。

农杆菌介导苎麻叶片遗传转化体系的研究

研究建立了苎麻叶片外植体再生体系,确定了对苎麻转化体和非转化体进行筛选的Kan浓度为25mg/L。通过比较不同的条件对通过农杆菌介导苎麻叶片遗传转化的影响,建立了农杆菌介导苎麻叶片遗传转化的体系。

胡萝卜组织培养和高效遗传转化体系的建立

为了建立高效的胡萝卜遗传转化体系,本实验选用3个胡萝卜(Daucuscarotavar.sativa)栽培品种:‘金笋五寸’、‘Carol’和‘改良黑田七寸’,以它们的下胚轴和子叶为外植体,首先建立了高频愈伤诱导体系。在此基础上,以Carol的下胚轴和愈伤组织为受体材料,利用根癌农杆菌LBA4404介导转化质粒pBI121。经X-Gluc染色,证明GUS基因瞬间表达成功,经PCR方法鉴定,证明GUS基因已整合到胡萝卜的染色体中,从而建立了高效的胡萝卜遗传转化体系。

农杆菌介导的冷诱导基因水稻遗传转化体系的建立

利用农杆菌介导技术,以Bar基因为筛选标记,用高山离子芥的冷诱导基因Cbcor15a侵染水稻品种日本晴的愈伤组织,经分化诱导后获得了再生植株。经Cef和PPT筛选,共获得转化Cbcor15a基因的日本晴再生苗9株;经PCR检测和Basta涂抹实验,结果证明有6株再生苗呈阳性。本遗传转化体系的建立可为利用转Cbcor15a基因选育具有耐冷性的水稻新品种提供参考。