DNA守护者及表观遗传载体的更新机制

据2013年5月23日Qian MX[Cell,2013,153（5）：1012-1024]报道,中国科学院微生物研究所刘翠华副研究员与北京师范大学邱小波教授研究团队的一项合作研究发现,在精子发生和体细胞DNA损伤修复过程中,组蛋白均会降解,修正了科学界关于体细胞组蛋白不降解的理论。

梅PGIP基因超表达载体的构建及遗传转化

运用已克隆的梅PGIP基因构建植物超表达载体,将PGIP插入带有启动子super-promoter和终止子nos的中间载体P-Super1300+中,酶切鉴定表明,目的基因已正确地插入载体中.用根癌农杆菌介导法将其转入烟草中,共获得25株潮霉素抗性苗,对其中的13株进行PCR检测,有12株扩增出了目的条带;进一步对其中的7株进行Southern杂交检测和RT-PCR检测,发现7个株系均有杂交带出现,且均发生了基因转录,说明已成功获得了能够表达PGIP基因的转基因烟草.

微生物所等合作发现DNA守护者及表观遗传载体的更新机制

人类DNA长达1．8米，通常缠绕在组蛋白上形成核小体，核小体经进一步折叠将DNA包装在小小的细胞核中。组蛋白起着DNA守护者的作用，决定着DNA上哪些基因可以表达。中科院微生物所刘翠华副研究员与北京师范大学邱小波教授研究团队合作，发现任精子发生和体细胞DNA损伤修复过程中，组蛋白均会降解，修正了科学界关于体细胞组蛋白不降解的理论。

微生物所合作发现DNA守护者及表观遗传载体的更新机制

中国科学院微生物研究所刘翠华副研究员与北京师范大学邱小波教授研究团队的一项合作研究发现，在精子发生和体细胞DNA损伤修复过程中，组蛋白均会降解，修正了科学界关于体细胞组蛋白不降解的理论。

新型噬菌体展示载体pCANTAB5S的构建

目的 进一步改造噬菌体展示载体 ,使之能更有效地展示各种外源随机多肽文库。方法 以 pCANTAB5X IFN α2b重组质粒为模板 ,在上游引物中引入XbaⅠ、SacⅠ酶切位点 ,在下游引物中引入SacⅠ、StuⅠ、SalⅠ酶切位点 ,将用该引物扩增的IFN α2b衔接片段PCR产物克隆到pMD18 T中 ,再将该片段用XbaⅠ和SalⅠ酶切并将之插入pCANTAB5L的XbaⅠ和SalⅠ位点中 ,经SacⅠ酶切 ,线性载体片段自连 ,构成新型噬菌体展示载体 pCANTAB5S。 结果 限制酶切位点SacⅠ被引入到噬菌体展示载体 ,并校正了pCANTAB5L载体StuⅠ、SalⅠ等位点的读框。结论 成功构建了含读框正确的SacⅠ等多个克隆位点的新型噬菌体展示载体pCANTAB5S ,可用于各种外源随机多肽文库的有效展示。

人胃癌细胞端粒酶RNA组分hTR基因片段的克隆及其正反义真核表达载体的构建

目的克隆人胃癌细胞端粒酶RNA组分(hTR)基因片段并构建其正义和反义真核表达载体,为以端粒酶为靶目标的肿瘤基因治疗奠定基础。方法采用RT-PCR方法从人胃癌细胞株MKN-45中扩增出人hTR部分cDNA序列。将该片段插入pEF6/V5-His-TOPO载体后构建人端粒酶RNA组分(hTR)基因正义真核表达载体(pEF-hTR)。随后采用EcoRV和SpeⅠ从pEF-hTR上切下该目的基因片段并反向插入pBluescriptⅡKS载体上的EcoRV/SpeⅠ酶切位点上。最后采用KpnⅠ和NotⅠ从pBluescriptⅡKS载体上切下该目的基因片段并正向插入pEF-hTR的KpnⅠ/NotⅠ酶切位点上从而构建出人端粒酶RNA组分(hTR)基因反义真核表达载体(pEF-ahTR)。对所构建的载体均进行酶切鉴定和测序确认。结果所克隆的基因片段其碱基序列与文献报道完全一致,且插入载体的方向完全正确。结论本实验已成功克隆了人端粒酶RNA组分(hTR)基因的部分序列并成功构建其正义、反义真核表达载体,从而为研究反义抑制人胃癌细胞端粒酶活性对胃癌细胞生物学行为的影响奠定了基础。

HCVC基因腺病毒表达载体骨架质粒pAd.HCV-C的构建、鉴定及表达

目的构建能表达HVC基因的腺病毒表达载体的重组骨架质粒,为进一步包装能高效表达HCVC基因的腺病毒载体做准备。方法用分别含有BgⅡ及HindⅢ酶切位点的HCVC区基因上、下游引物,以含有HCV H株基因序列的质粒pBRTM/HCV1-3011为模板,通过PCR扩增获得HCVC区基因片段,基因片段回收后,以BglⅡ及HindⅢ双酶切,定向插入到腺病毒骨架质粒pAd,CMV-Link.1中CMV启动子下游BglⅡ与HindⅢ位点之间,获得重组表达质粒pAd.HCV-C通过BglⅡ/HindⅢ双酶切、PCR及插入片段序列测定对质粒进行了鉴定,以抗HCVC单克隆抗体为一抗,利用间接免疫荧光法检测了pAd.HCV-C在人肝癌细胞7721中的瞬时表达。结果酶切、PCR及测序鉴定证实,pAd,HCV-C插入片段为HCVC区基因片段,免疫荧光法检测表明其可以在7721细胞中瞬时表达。结论构建的质粒pAd.HCV-C可以在7721细胞中瞬时表达HCVC区基因,为包装表达HCVC基因的腺病毒载体奠定了基础。

G250基因siRNA表达载体的构建与鉴定

目的构建肾癌相关抗原G250小分子干扰RNA(siRNA)表达载体,通过抑制G250基因的表达,探索肾癌基因治疗的新途径。方法根据基因库上的肾癌相关抗原G250 mRNA序列,设计并合成两端含有酶切位点的75个碱基的寡核苷酸链。寡核苷酸链退火后用T4DNA连接酶连接至线性化的质粒pRNAT-U6.1/Neo中,构建成重组质粒(命名为pshRNA-G250 a,pshRNA-G250b),进行酶切及序列鉴定。结果pshRNA-G250表达载体克隆构建成功,插入片段测序结果与合成的siRNA序列一致。结论成功构建pshRNA-G250表达载体,为进一步的研究及探索肾癌基因治疗奠定了基础。

人源抗菌肽LL-37表达载体的构建及其在毕赤酵母中的表达

目的:构建人源抗菌肽LL-37的表达载体pPIC9-LL-37,将其转化毕赤酵母GS115,诱导LL-37表达。方法:根据抗菌肽LL-37氨基酸序列及毕赤酵母偏爱密码子,应用互补延伸PCR技术扩增抗菌肽LL-37基因,定向克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9上,转化E.coli DH5a.构建重组分泌型酵母表达载体pPIC9-LL-37.PCR鉴定并测序;原生质球法转化毕赤酵母GS115.PCR扩增鉴定:甲醇诱导LL-37表达,筛选最高表达株.检测表达产物对大肠杆菌的抑菌活性,并对其进行聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western印迹分析。结果:pPIC9-LL-37载体构建成功:转化毕赤酵母后PCR鉴定出LL-37基因:0.5%甲醇能诱导LL-37高表达,筛选出最高表达株,发酵上清约含LL-37 0.5μg/ml,对E.coli具有较强的抑菌活性,电泳及Western印迹分析证实表达产物为LL-37。结论:成功构建pPIC9-LL-37载体.转化毕赤酵母后.经甲醇诱导能高表达分泌LL-37,表达的LL-37蛋白具有较强的抑菌活性。

pRNAT-U6.1/Neo系统在E2F-3基因RNA干扰载体构建中的应用

目的:构建针对E2F-3基因的siRNA表达载体。方法:化学合成3对编码短发夹RNA序列的、靶向E2F-3基因的寡核苷酸链,各64个碱基,退火、克隆到经BamHI、HindⅢ双酶切的pRNAT-U6.1/Neo载体上,重组构建RNAi质粒。通过双酶切、PCR鉴定及基因片段序列分析验证构建效果。结果:重组构建的pRNAT-U6.1/Neo载体经PCR分析及插入基因片段序列分析,结果表明64个碱基成功插入到预计位点,并且序列完全一致,插入序列无点突变位点。结论:载体的成功构建为进一步研究E2F-3基因在膀胱肿瘤中的作用奠定了基础,为进一步以其为靶点进行膀胱癌细胞系体外实验创造了条件。

新型基因载体巯基烷基化壳聚糖的制备及体外性质的初步研究

目的制备巯基烷基化壳聚糖(TACS)载基因纳米粒,并对其体外相关性质进行初步研究。方法复凝聚法制备TACS/pDNA复合纳米粒子,并用透射电镜对其的形态和粒径进行观察和表征;凝胶阻滞分析观察其对基因的保护情况;以Lipofectamine 2000转染试剂作为阳性对照,检测其对人胚胎肾细胞(HEK293)的转染活性;四噻氮唑盐(MTT)比色法测定其对细胞活性的影响。结果TACS/pDNA复合纳米粒子形态不很均一,粒径在390nm左右;凝胶阻滞分析证明了载体能有效地包裹和保护基因不受DNaseⅠ酶的消化;体外基因转染实验证实了TACS纳米粒子能够有效地转染HEK293,其转染效率远高于壳聚糖纳米粒子,略低于脂质体;MTT测定其对细胞活力影响甚微,对细胞的毒性明显低于脂质体。结论TACS有望成为一种有价值的新型基因载体。

融合表达Ag85B-ESAT6的结核分枝杆菌真核表达载体的构建及其免疫原性

目的 :构建融合表达结核分枝杆菌 (Mycobacteriumtuberculosis,MTB)分泌蛋白Ag85B ESAT6真核表达载体 ,研究该重组载体在体外的表达和在小鼠体内诱生体液免疫应答的能力 .方法 :设计含不同酶切位点的Ag85B和ESAT6引物 ,采用PCR的方法从MTB毒株H37Rv DNA中分别扩增出相应大小的DNA片段 ,将片段分别与pGEM T easy载体连接后测序 .将测序正确的Ag85B和ESAT6按照不同的酶切位点克隆入真核表达载体pcDNA3,挑选出阳性克隆 ,分别命名为AZ pcD NA3 EF 和EZ pcDNA3 AF,将重组质粒电转CHO细胞 ,RT PCR检测融合蛋白mRNA的表达 ,间接免疫荧光测定CHO细胞内融合蛋白的表达 ;用重组质粒免疫BALB/c小鼠 ,ELISA测定特异性抗体的滴度 .结果 :PCR获得的Ag85B和ESAT6序列与GenBank报道的一致 .RT PCR可检测融合基因转录出mR NA ,转染重组质粒的CHO细胞内有较强的免疫荧光 ,AZ pcD NA3 EF 质粒免疫小鼠血清特异性抗体滴度为 1∶1 0 0 0 ,EZ pcD NA3 AF 质粒免疫小鼠血清特异性抗体滴度为 1∶1 5 0 0 .结论 :Ag85B和ESAT6融合基因真核表达载体构建成功 。

携带标记基因的慢病毒载体转染人脐带华通胶间充质干细胞的实验研究

目的探讨含有增强型绿色荧光蛋白标记基因的慢病毒（Lentivirus—EGFP）体外转染人脐带华通胶间充质干细胞（HUWMSCs）的最佳方案及其对细胞增殖活性的影响。方法设计A、B、C、D共4种转染方案，分别以1、10、100的感染复数（MOI）转染体外培养的HUWMSCs，荧光显微镜及流式细胞仪检测各组荧光表达强度及转染效率，MTT法检测细胞增殖倍数。结果转染4d后所有实验组转染率在10．6％～87．3％，并与MOI值存在量效关系，聚凝胺（5mg／L）可显著增加病毒转染效率（P〈O．05）。MTT实验结果显示，与对照组比较，不同转染方案细胞增殖存在显著差异（P〈0．001）。A方案MOI=10组及B方案MOI=10组细胞增殖情况较其他组好。结论B方案MOI=10实验组为最佳转染方案。Lentivirus—EGFP能高效转染HUWMSCs且在2周内稳定表达转染基因，是一种安全、有效的基因转移载体。

Vasostatin基因重组腺病毒载体的构建及其对胰腺癌生长的抑制作用

目的 以复制缺陷型腺病毒为载体 ,构建vasostatin基因重组腺病毒 ,并观察其对胰腺癌裸鼠移植瘤生长的抑制作用。方法 以人肌肉cDNA文库为模板应用PCR的方法扩增出vasostatin的DNA片断 ,定向插入腺病毒穿梭质粒 pshuttle CMV经酶切、测序鉴定正确后 ,电穿孔法将重组穿梭质粒转化E .coliBJ5 183 AdEasy 1感受态细菌 ,行细菌内同源重组。将抗性筛选和酶切鉴定正确的重组质粒 pAd CMV vasostatin转染 2 93细胞进行包装。病毒扩增纯化后 ,病毒感染人胰腺癌细胞 ,RT PCR和Western印迹法检测vasostatin的表达状况。复制人胰腺癌裸鼠移植瘤模型 ,瘤内注射 10 7pfupAd CMV vasostatin、10 8pfupAd CMV LacZ及PBS ,观察移植瘤的生长曲线及瘤重。 结果 PCR产物电泳后可见长度为 5 6 0bp左右的目的条带 ;酶切及测序鉴定表明穿梭质粒 pshuttle CMV中插入了vasostatin的DNA片断 ;卡那霉素抗性筛选及PacI酶切鉴定证实腺病毒重组质粒 pAd CMV vasostatin构建成功 ;转染 2 93细胞 7天后观察到细胞病理学效应出现。PCR鉴定表明重组腺病毒中含有vasostatin片断。RT PCR和Western印迹法证实vasostatinmRNA及蛋白的表达。治疗后 3周 pAd CMV vasostatin组移植瘤的体积及瘤重均显著小于 pAd CMV LacZ组及PBS组。

日本血吸虫谷胱甘肽转移酶基因在真核表达载体中的亚克隆

目的 将日本血吸虫谷胱甘肽转移酶(GST)基因片段克隆到真核表达载体pBKCMV中,以便对其进行核酸疫苗的研究。方法 特定寡核苷酸引物的设计和合成,TRIZOL试剂提取日本血吸虫成虫RNA,RTPCR法扩增GST基因编码序列,将扩增产物连接pGEMT克隆载体,再亚克隆到真核表达载体pBKCMV中。结果 RTPCR法特异性扩增出SjGST编码基因片段,其大小约为670bp,经双酶切、PCR鉴定表明所构建的质粒pGEMTGST和pBKCMVGST中含有目的基因。结论 pBKCMVGST重组质粒的成功构建,为进一步表达GST及其在血吸虫病免疫诊断、免疫预防中的作用研究提供了条件。

利用pcDNA3．1／TOPO~TA克隆构建ANNEXIN A2基因的真核表达载体

目的克隆人类ANNEXIN A2基因,构建其正义真核表达质粒。方法采用逆转录聚合酶链式反应技术,从人类正常肺组织中扩增出人类ANNEXIN A2基因的完整编码区全长序列,通过DNA重组技术将该基因重组于pcDNA3．1／TOPO(?)TA真核表达载体上,构建出人类ANNEXIN A2基因正义表达质粒。通过DNA 测序方法对重组表达质粒进行鉴定。结果通过测序分析证实,构建的重组表达质粒目的基因片段为人类 ANNEXIN A2基因的完整编码区1 032 bp。结论构建真核表达载体的方法快速简便,适于进一步研究基因的细胞生物学作用。

逆转MDR-1小干扰RNA的慢病毒载体系统的构建和鉴定

目的构建并鉴定表达MDR-1小干扰RNA的慢病毒载体系统并检测其对于喉癌多药耐药细胞系(LSC-1/TAX)多药耐药表型的逆转效果。方法根据MDR-1基因序列,设计3条寡聚核苷酸序列,合成互补DNA链,插入慢病毒表达质粒pLVTHM中,与pCMV-dR8.74和pMD2G共转染293T细胞,包装产生病毒颗粒。以RT-PCR、realtimePCR及Westernblot方法检测三条siRNA在人喉癌耐药细胞系(LSC-1/TAX)中的干扰效率,并采用MTT方法检测干扰前后化疗药物的敏感性。结果通过酶切和测序证实慢病毒载体构建正确,产生能够表达GFP和siRNA的慢病毒颗粒,浓缩滴度为>1×108TU/ml。三条siRNA均可以感染LSC-1/TAX细胞系,其中第三条siRNA敲减效果最佳。结论成功建立逆转MDR-1小干扰RNA的慢病毒载体系统,为逆转喉癌多药耐药表型的实验奠定了基础。

TAT短肽修饰的聚乙烯亚胺-β-环糊精基因载体

目的:将HIV-1的转录反式激活蛋白(trans-activator of transcription protein,TAT)中的片段短肽(RKKRRQRRR)偶联于聚乙烯亚胺-β-环糊精(polyethylenimine-β-cyclodextrin,PEI-β-CyD)聚合物,构建出低毒性、高转染率的新型基因载体。方法:β-环糊精(β-CyD)和低分子量树枝状聚乙烯亚胺(PEI600)通过羰基二咪唑(1,1’-carbonyldiim idazole,CDI)聚合形成骨架结构,通过琥珀酰亚胺-3-(2-嘧啶二硫)丙酸酯[N-succinimidy-3-(2-pyridyldithio)propionate,SPDP]将TAT短肽偶联于PEI-β-CyD,构成新的聚合物TAT-PEI-β-CyD。采用1H-NMR和FT-IR对聚合物进行化学结构表征;凝胶电泳阻滞实验、粒径测定和透射电镜观察TAT-PEI-β-CyD对DNA的浓缩能力,以及浓缩质粒DNA后颗粒形态和粒径大小;MTT法测定载体在A293和B16细胞上的毒性,并对A293和B16细胞进行体外细胞转染实验,以PEI25kDa作为对照。结果:1H-NMR和FT-IR结果显示,TAT短肽已成功偶联到PEI-β-CyD。凝胶电泳阻滞试验显示,TAT-PEI-β-CyD在N/P为4∶1时可以完全阻滞DNA的迁移。粒径测定结果和透射电镜图像表明,TAT-PEI-β-CyD/pDNA(N/P=30∶1)复合物粒径在100nm左右。细胞毒性实验表明,在B16和A293两种不同细胞中,聚合物毒性低于PEI25kDa。体外转染结果表明,在N/P为30∶1时,聚合物在A293、B16和B16BL6细胞中的基因转染效率最高;TAT短肽的偶联能提高PEI-β-CyD在B16、B16BL6细胞上的基因转染效率。结论:实验成功构建了TAT短肽修饰的PEI-β-CyD新型基因载体。该载体毒性低,基因转染效率高。

腺病毒载体研究进展与展望

基因治疗自1990年第一个基因治疗方案在美国被批准进入临床试验以来,一直在稳步发展.据不完全统计,目前在全世界范围内已有918个基因治疗方案进入临床试验,特别是在疑难疾病的治疗方面显示出巨大的应用潜力.