应用酵母双杂交系统筛选橡胶延长因子REF的互作蛋白

利用酵母双杂交系统,以橡胶树(Hevea brasiliensis)橡胶延长因子基因REF的开放阅读框(ORF)构建无自激活性的诱饵表达载体pBD-GAL4-REF,并筛选以pAD-GAL4-2.1载体构建的橡胶树胶乳cDNA文库,对阳性克隆的cDNA插入片段进行测序及生物学功能分析。通过酵母双杂交筛选,共获得5种可能与REF互作的候选蛋白质,它们分别为与诱饵蛋白REF高度同源的REF家族成员、小橡胶粒子蛋白(SRPP)、翻译控制肿瘤蛋白(TCTP)、激发子响应蛋白和泛素耦联酶E2,这表明橡胶延长因子REF除了与自身高度同源蛋白质可能存在相互作用之外,还可能与TCTP和激发子响应蛋白等其它蛋白质发生相互作用。这些结果有助于揭示橡胶粒子的生物学功能。

利用酵母双杂交系统筛选花生AhCaM相互作用蛋白

CaM是目前已知的胞内Ca2+受体蛋白中最重要的一种,参与多种生理活动的调节。为深入研究CaM蛋白的作用机制,探索其在花生钙信号途径中的作用靶点,用花生CaM基因构建了既无自激活性又无毒性的p GBKT7-AhCaM诱饵表达载体;同时从花生叶片组织中提取总RNA,分离得到mRNA,利用SMART技术合成并纯化双链cDNA后建立花生叶片cDNA文库;通过共转化法筛选与CaM相互作用的蛋白,并对阳性克隆分析和鉴定,筛选到5个与Ah CaM互作的蛋白,其中NAD激酶是已知能与钙调素互作的蛋白;而泛素能与AhCaM互作,说明AhCaM在花生发育及抗逆方面起作用。通过分析这些靶蛋白的已知功能,为研究AhCaM的未知生物学功能提供了重要信息。

用酵母双杂交系统筛选泛素/核糖体蛋白S27a

背景与目的:蛋白激酶CK2是一种真核细胞中普遍存在的信使非依赖性丝/苏氨酸蛋白激酶,在细胞增殖和分化、信号的传导和加工等方面起重要作用。CK2在多种白血病细胞中的活性比相应的正常组织高2～8倍,且CK2的变化与肿瘤的生长情况相关。为研究其在白血病细胞中的作用机制,本研究拟利用酵母双杂交系统从自行构建的HL鄄60细胞cDNA文库中筛选出与蛋白激酶CK2α'亚基相互作用的蛋白。方法:通过PCR扩增已构建成功的重组质粒pTHCK2A',获得人CK2α'亚基编码区cDNA;将PstⅠ/NdeⅠ双酶切的PCR产物连接到同样酶切的“诱饵”载体pGBKT7,构建酵母双杂交穿梭表达质粒(BD质粒),经DNA测序确证及转染感受态酵母菌AH109以排除自主激活。从体外培养的HL鄄60细胞中提取总RNA,以酵母穿梭表达质粒pGADT7鄄Rec为载体,采用CLONTECHSMART(switchingmechanismat5'endofRNAtranscript)技术,在酵母细胞中构建HL鄄60细胞的酵母双杂交cDNA文库,文库质粒为AD质粒。将上述构建成功的BD质粒、AD质粒共转染感受态酵母菌AH109,进行酵母双杂交实验。以筛选真阳性克隆(即与人蛋白激酶CK2α'相互作用的蛋白)。结果:经过酵母双杂交实验,筛选出6种与蛋白激酶CK2α'相互作用蛋白,核酸序列分析及同源性检索表明,其中1个与泛素/核糖体蛋白S27a有高度?

应用酵母双杂交系统筛选新基因AngRem104相关蛋白

目的 :应用酵母双杂交系统筛选与新基因AngRem10 4相互作用的蛋白 ,为该基因的功能研究提供线索。方法 :构建AngRem10 4的真核表达载体AngRem10 4 pGBKT7/c myc,转化酵母菌AH10 9,Westernblot证实蛋白表达 ,进行毒性和自激活检验 ,与转化了成人肾脏cDNA文库的酵母菌Y187接合 ,筛选与AngRem10 4相互作用的蛋白。结果 :AngRem10 4蛋白能在酵母中正常表达 ,对酵母细胞无毒性 ,不存在自激活现象。筛选出的蛋白包括真核翻译延伸因子 1α1、糖皮质激素受体AF 1特异延伸因子、β2 微球蛋白、巴戴 -比德尔综合征 2蛋白及 4个与细胞代谢有关的蛋白。结论 :AngRem10 4可能影响细胞内某些转录因子活性和细胞代谢 ,并与某些免疫相关疾病和遗传病发病有关。酵母双杂交结果为AngRem10

采用酵母双杂交系统筛选GmDREB5的互作蛋白

以无自激活活性的GmDREB5蛋白73～226位氨基酸区段为诱饵，采用酵母双杂交系统筛选干旱处理5h大豆cDNA文库。结果发现：一个互作蛋白含有保守的TPR（Tetratricopeptide repeat）结构域，与拟南芥的TPR蛋白仅有14％的相似性，说明其可能是一类新的大豆TPR蛋白，将其定名为GmTPR1；表达特性分析表明，GmTPR1基因受干旱、低温、高盐、ABA的诱导；证明GmTPR1不仅参与植物对非生物胁迫的响应，同时参与对GmDREB5蛋白水平的调控。

应用酵母双杂交系统筛选与新基因nelin相互作用的蛋白质

目的 通过筛选能够与新基因nelin的心肌特异表达产物相互作用的蛋白质从而揭示nelin的生物功能。方法 构建表达nelin阅读框全长的诱饵质粒并利用酵母双杂交系统筛选人心脏cDNA文库, 以寻找与nelin蛋白发生相互作用的蛋白质。并利用生物信息学方法对筛选得到的蛋白质进行功能结构域分析。结果 筛选得到3 个蛋白质分别为肌联蛋白 (Titin ) N2B亚型, 细丝蛋白 (Filamin ) C亚型即γ Filamin和α胰蛋白酶抑制物重链前体 (inter alphatrypsin inhibitor heavy chain precursor, ITIH)。对这3种蛋白的C末端结构域进行分析发现Titin和Filamin均含有免疫球蛋白样结构域 (Ig- like domain)。结论 实验结果揭示了新基因nelin很可能表达一个细胞骨架相关蛋白, 它可通过其蛋白质的C末端同Titin和Filamin的免疫球蛋白样结构域发生相互作用而参与细胞骨架网络的形成。

酵母双杂交系统在植物病毒学上的应用

酵母双杂交系统是研究蛋白质间相互作用的一种有效方法,具有操作简便、灵敏度高的特点.该技术主要在植物病毒学的如下领域得到应用:(1)病毒粒体的分子结构和装配;(2)病毒的核酸复制以及基因表达调控;(3)病毒介体传播的分子机制;(4)病毒运动模式;(5)病毒致病机制;(6)病毒编码蛋白的联系图谱.

用酵母双杂交系统研究载脂蛋白AI(apoAI)和清道夫受体BI(SR-BI)间的相互作用

目的:利用酵母双杂交系统验证在胆固醇逆转运过程中起关键作用的大鼠载脂蛋白AI(apoAI)和清道夫受体BI- (SR -BI)间存在着相互作用,为初步筛选具有降脂活性组分提供1对新的靶点。方法:首先分别克隆了Wistar大鼠的apoAI和SR -BI基因的cDNA ,并构建了酵母表达载体,利用共转化技术观察到apoAI和SR -BI间存在着相互作用,并在酵母交配实验中证实了这个结果。结果:经共转化后的实验组与阳性对照组可在SD/ -Leu/- Trp/- His/- Ade/X -α- Gal平板上生长且菌斑呈蓝色,经测定α、β半乳糖苷酶活力可知酶活分别为8～1 2U和1 0～40U。酵母交配后的二倍体实验组、阳性对照组可在SD/- Leu/- Trp/ -His/- Ade/X -α- Gal平板上生长且菌斑呈蓝色。结论:apoAI和SR BI间的确存在相互作用。

酵母双杂交系统的原理及应用

0引言 蛋白质和蛋白质的相互作用是很多生命现象的基础.随着分子生物学技术的发展,特别是人类基因组计划的完成,使人类对基因的结构和功能的认识不断加深,但基因编码的蛋白质的功能研究尚是一个难题.酵母双杂交(yeast two hybrid)技术是利用酵母遗传学方法分析蛋白质之间的相互作用,该方法建立以来,经过不断的完善和发展,不但可以检测已知蛋白质之间的相互作用,更重要的在于发现新的与已知蛋白相互作用的未知蛋白.

应用酵母双杂交系统发现hALR与Na^+,K^+-ATPase间的相互作用

目的 :采用酵母双杂交系统寻找与人肝再生增强因子 (hALR)相互作用的蛋白质 ,探讨ALR的作用机理。方法 :构建hALR诱饵质粒pGBKT7-hALR ,醋酸锂法转化AH10 9酵母菌 ,转化菌在SD/ -Trp -His培养基上培养及滤纸法 β一半乳糖苷酶活性检测排除自身激活作用后 ,与人肝cDNA文库质粒预转化的酵母菌Y187进行接合试验 ,接合产物在QDO培养基上筛选 ,阳性克隆进一步在含X -α -Gal的QDO平板上鉴定 ,X -α -Gal活性呈阳性的克隆 ,进行PCR及酶切鉴定排除完全相同克隆 ,进一步进行回交试验排除假阳性 ,对阳性克隆进行序列测定和生物信息学分析。结果 :得到数个阳性克隆 ,序列分析结果表明其中 1个阳性克隆是Na+ ,K+ -ATPaseβ亚基部分基因 ,长669bp ,3′端非编码区 2 2 4bp ,编码区长 44 5bp ,编码Na+ ,K+ -ATPaseβ亚基C端的 147个氨基酸残基。 结论 :应用酵母双杂交系统筛选出Na+ ,K+ -ATPase与hALR具有相互作用。

酵母双杂交系统在植物病毒学中的应用

酵母双杂交系统应用有效的酵母遗传学方法分析蛋白质间相互作用,已成为鉴定蛋白质相互作用强有力的方法之一。文章从植物病毒编码的蛋白质间、植物病毒蛋白与植物蛋白间、植物病毒蛋白与介体蛋白间等3个方面阐述了酵母双杂交系统在植物病毒学中的应用现状,并对其应用前景进行了展望。

基于膜上的酵母双杂交系统及其在药物开发中的应用

蛋白质是生命活动的基础.生物体内的蛋白质之间都存在着复杂的相互关系.由于蛋白质中的膜蛋白在各种各样重要细胞过程中起着关键的作用,如光合作用、呼吸作用、信号传导、免疫反应和营养物质的吸收等,因此越来越受到研究者们的重视.对膜蛋白的研究也越来越多.但因为膜蛋白具有疏水性,所以常常用传统的生物化学和遗传学方法,难以对膜蛋白之间以及膜蛋白与胞质蛋白之间的关系进行分析和鉴定.而传统的酵母双杂交系统又因其局限性,不能广泛地用于研究膜蛋白的相互作用.对研究膜蛋白之间及膜蛋白与胞质蛋白之间关系的一种有效方法—基于膜上的酵母双杂交系统,以及该方法在药物开发设计领域中的运用进行了介绍和综述.

酵母双杂交系统筛选HBV PreS1相互作用蛋白

目的利用Sos招募系统(SRS),构建含HBV PreS1基因的酵母双杂交诱饵载体,筛选人肝细胞与HBV PreS1蛋白相互作用的蛋白,进一步探讨HBV侵入肝细胞的机制。方法以HBV ayw亚型全长质粒PCP10为模板,PCR扩增HBV PreS1基因,克隆到酵母表达载体pSos中,构建诱饵质粒pSos-PreS1,将其转化cdc25酵母感受态细胞,提取酵母蛋白质进行Western blot分析,证实其在酵母细胞中的表达;将pSos-PreS1分别与pMyr Lamin C、pMyr SB共转化酵母,证实诱饵蛋白无自激活作用。将pSos-PreS1与人肝cDNA文库共转化cdc25酵母感受态细胞,通过营养及温度选择性培养筛选阳性菌落,扩增阳性菌落目的基因并测序。结果成功构建了HBV PreS1基因酵母双杂交诱饵载体pSos-PreS1,筛选得到5个准阳性克隆,序列分析表明其分别与人类钾通道调制因子1(KCMF1)、细胞色素C、VitD结合蛋白、人源去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)和人白蛋白具有高度同源性。结论利用SRS筛选出5个可能与HBV PreS1蛋白相互作用的蛋白,为进一步了解HBV侵入肝细胞的机制奠定了基础。

应用酵母双杂交系统初步筛选IBDV VP2结合蛋白

用RT-PCR扩增VP2 cDNA并克隆入诱饵载体pSos,与鸡法氏囊cDNA文库中分离的质粒DNA共转化cdc25H,筛选阳性酵母克隆;用酵母质粒DNA转化大肠杆菌,提取质粒再分别与诱饵载体pSosVP2共转化酵母细胞,利用酵母双杂交系统对阳性克隆进行验证。对阳性克隆的插入片段进行序列分析,根据生物信息学分析结果初步确定IBDV VP2结合蛋白编码基因。结果显示,经酵母双杂交共筛选出48个候选阳性克隆,分别转化酵母菌,经酵母双杂交验证后,获得阳性克隆19个。进一步的序列分析显示,在19个插入序列中,共编码8种不同的多肽,分别是Ras超家族中的RRAS2、Rit1和N-Ras,肿瘤相关蛋白TCTP和PARP14,抗病毒Mx蛋白,LAMB3蛋白以及蛋白激酶PRKX。VP2候选结合蛋白的获得为IBDV受体、诱导细胞凋亡或逃逸宿主抗病毒机制等研究奠定了基础。

酵母双杂交系统及其应用

酵母双杂交系统（ｙｅａｓｔ ｔｗｏ－ｈｙｂｒｉｄ ｓｙｓｔｅｍ）是直接于细胞内研究蛋白质间相互作用的一种灵敏度很高，且非常有效的遗传学方法，在不同研究领域中广泛应用，并不断完善及改进，发展出单杂交系统（ｏｎｅ－ｈｙｂｉｄ ｓｙｓｔｅｍ） 和三杂交系统 （ｔｈｒｅｅ－ｈｙｂｒｉｄ ｓｙｓｔｅｍ）等一系列相关的技术，克服了原系统的局限。本文对双杂交系统的原理、发展概况、应用、存在问题和前景等进行了综述。

酵母双杂交系统测定抗雌激素物质

建立了用酵母双杂交系统筛选具有抗雌激素作用物质的生物测试法 ,并对 6种工业用酚类物质 ( 4 n 壬基酚 ,2 sec 丁基酚 ,2 羟基联苯 ,3 叔丁基酚 ,2 叔丁基酚和 4 乙基 2 ,6 二叔丁基酚 )及氯化三苯基锡的抗雌激素作用进行了测试。结果表明 :氯化三苯基锡显示出极强的抗雌激素作用 ,强度超过了抗乳癌剂三苯氧胺及其代谢产物 4 羟基三苯氧胺。可以推测出有机锡造成软体动物的雄性化作用可能是由其抗雌激素作用引起的。 6种酚类物质中 ,除 4 乙基 2 ,6 二叔丁基酚外 ,其他 5种显示出弱抗雌激素作用。值得注意的是 :当 4 壬基酚显示出雌激素促进作用时 ,4 n 壬基酚却显示出抗雌激素作用。

COX-2诱饵载体的构建及其在酵母双杂交系统中自激活作用的检测

目的构建环氧化酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)的诱饵载体,为应用酵母双杂交系统(yeast two-hybrid system)筛选与COX-2相互作用的蛋白建立实验基础。方法 PCR扩增COX-2基因编码区全长,引入酶切位点EcoRⅠ、BamHⅠ,将COX-2基因克隆至载体pGBKT7中,将构建好的诱饵载体pGBKT7-COX-2转化到酵母细胞Y190中,检测pGBKT7-COX-2在Mathmaker GAL4Two-Hybrid System3中有无自激活作用。结果 成功扩增了COX-2基因编码区全长,并克隆入pGBKT7中,测序结果正确,并成功转化到酵母细胞Y190中,检测无自激活作用。结论 成功构建了COX-2的酵母诱饵载体,为进一步运用酵母双杂交技术筛选与之相互作用的蛋白奠定了基础。

酵母双杂交系统用于WSSV粘附蛋白VP37相关蛋白基因的研究

为研究WSSV的粘附蛋白VP37相关蛋白的基因,应用酵母双杂交系统Ⅲ筛选中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)鳃细胞全长cDNA文库。构建VP37 基因的重组载体PGBKT7 VP37,把它转化酵母Y187后与含文库质粒的酵母AH109配合,在营养缺陷培养基上进行双杂交筛选。经过PCR鉴定确定了1个阳性克隆。测定该段cDNA序列并进行生物信息学分析,结果显示,此cD NA片段编码的蛋白与蛋白酶的同源性较高,该蛋白在WSSV识别并结合宿主的过程中所起的作用还有待于进一步研究。成功筛选了VP37相关蛋白的cDNA片段,为研究WSSV入侵以及感染致病的机制等方面提供了新线索。

用酵母双杂交系统发现HaNPV衣壳蛋白与棉铃虫肌动蛋白间的相互作用

成功的构建了棉铃虫细胞 (Hz- AM1)的 c DNA文库 (Ha- c DNA) ,然后以棉铃虫核型多角体病毒衣壳蛋白 VP39(Ha NPV- VP39)作为诱饵蛋白 ,通过酵母双杂交系统 (yeast two- hybrid system ) ,在棉铃虫细胞 c DNA文库中钓到了 VP39的相互作用因子基因 .通过 DNA测序和氨基酸序列分析表明 ,该基因为棉铃虫的肌动蛋白(actin)基因 .本实验从一个侧面反映了 VP39蛋白与棉铃虫肌动蛋白间的相互作用 .