应用创造酶切位点法检测单碱基突变

应用引物错配技术结合单碱基突变位点而配合成一个酶切位点,使之成为可用PCR-RFLP方法分析的突变位点,是对单碱基突变位点进行基因型鉴定的有效而简捷的手段。本文以鸡胞外脂肪酸结合蛋白(Extracelluarfattyacidbindingprotein,EX-FABP)基因单碱基突变的基因型检测为例,探讨了应用创造酶切位点PCR(CreatedRe strictionSitePCR,CRS-PCR)检测单碱基突变基因型的思路、方法和策略。

鼻咽癌中EB病毒LMP1基因N端XhoⅠ酶切位点的丢失

背景与目的;众所周知,EB病毒LMP1基因在鼻咽癌变过程起着一定的作用。本研究通过检测广东地区鼻咽癌组织EB病毒LMP1基因N-末端区Xho Ⅰ酶切位点的丢失,探讨LMP1基因变异在鼻咽癌发生发展中的作用。方法:收集中山大学肿瘤防治中心鼻咽癌患者鼻咽新鲜活检标本63例。收集EB病毒健康携带者外周血单个核细胞(PBMCs)10例作为对照。采用QIAamp DNA Mini Kit和QIAampDNA Blood Mini Kit分别抽取组织和外周血单个核细胞的DNA,应用巢式PCR扩增EB病毒LMP1基因的N-末端区,并用Xho Ⅰ对扩增产物进行酶切。采用四色荧光 末端终止法对扩增产物进行序列分析。结果:10例健康携带者外周血单个核细胞的EB病毒LMP1基因N-末端区均未见Xho Ⅰ酶切位点的丢失。63例鼻咽癌组织中有50例(79.37％)出现Xho Ⅰ酶切位点的丢失(Xho Ⅰ-loss),还有4例(6.34％)为Xho Ⅰ酶切位点部分丢失,只有9例(14.29％)未见Xho Ⅰ酶切位点的丢失(wt-Xho Ⅰ)。除了Xho Ⅰ酶切位点的丢失(nt:169423～169428;GAGCTC→GA T CTC)外,还发现四个错义点突变。结论:本研究所检测的广东地区EB病毒健康携带者外周血单个核细胞所携带的EB病毒LMP1基因为wt-Xho Ⅰ,而在鼻咽癌组织中主要为Xho-Ⅰ-loss。因此,我们认为EB病毒LMP1基因N-末端区Xho Ⅰ酶切位点的丢失和其?

双创造酶切位点聚合酶链反应-限制性片段长度多态性检测MGMT基因多态性的应用

目的建立简便易行、经济适用的MGMT基因4个单核苷酸多态性位点的检测方法。方法应用碱基错配创造酶切位点原理设计引物,通过聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术判断MGMT基因四个SNP位点多态性。结果设计一对引物PCR扩增含MGMT84多态位点的DNA片段,另一对引物PCR扩增含MGMT基因143、160、178三个多态位点的DNA片段,使用4种限制性内切酶分别酶切判断4个位点多态性,PCR和酶切效果均较好。结论应用创造酶切位点PCR-RFLP原理建立的MGMT四个多态位点的检测方法具备简便、经济、快速的特点。

BamHI酶切位点变异区域性分布在HCV1b型5'非编码区的研究

目的研究丙型肝炎病毒(HCV)1b型5'非编码区BamHⅠ酶切位点变异的区域性分布。方法对来自中国4个不同地区的64例HCV1b基因型血清样品进行5'-NCR扩增后,分别用MboⅠ、BamHⅠ限制性内切酶酶切分析,比较不同地区变异株分布的差异。结果测序证实中国HCV1b基因型在117位有BamHⅠ酶切位点。64例血清样品中,BamHⅠ单切点变异株,华南7例(28%),东北1例(10%),华北1例(11.1%),西南0例;MboⅠ及BamHⅠ切点均无的变异株,西南8例(40%),华南2例(4%),东北1例(10%),华北0例。结论证实HCV1b型BamHⅠ变异具有区域性分布特点,华南地区和西南地区变异较多,华北和东北变异较少。而这一变异是否与干扰素治疗耐药有关,尚有待于进一步研究。

2型糖尿病与脂蛋白脂酶基因HindⅢ酶切位点的多态性

为探讨 2型糖尿病与脂蛋白脂酶基因HindⅢ多态性是否有关联。采用限制性片段长度多态性分析方法 ,对中国成都地区 2 4 8名 (健康成人 1 35名 ,2型糖尿病患者 1 1 3名 )汉族人的脂蛋白脂酶基因内含子 8HindⅢ酶切位点多态性及其与血脂、载脂蛋白水平的关联进行了研究。结果显示 ,2型糖尿病组血清TG、TC、apoB1 0 0、apoCⅡ、apoCⅢ、apoE水平及TG HDL C比值较对照组显著升高 (P <0 0 0 1 ) ,同时HDL C、apoAⅠ水平显著降低 (P <0 0 0 1 )。 2型糖尿病组H +H +基因型和H +等位基因频率较对照组显著升高 (分别为 0 6 37vs0 31 8,P <0 0 1和 0 770vs 0 5 4 8,P <0 0 1 )。结果提示 ,2型糖尿病与脂蛋白脂酶基因HindⅢ酶切位点多态性有一定关联。

利用PCR-RFLP分析eNOS基因exon7BanⅡ酶切位点的遗传多态性

目的 :探讨内皮型一氧化氮合酶基因多态性与妊高征的相关性。方法 :应用PCR -RFLP技术检测了 12例正常女性的内皮型一氧化氮合酶基因第 7外显子。结果 :发现 12例正常女性中有 4例的基因型是eNOS/GG ,有 8例的基因型是eNOS/GT ,未检测到eNOS/TT型的个体。等位基因A1(eNOS/G)的频率为 66 7% ,等位基因A2 (eNOS/T)的频率为 33 3%。结论 :广东女性人群存在内皮型一氧化氮合酶第 7外显子BanⅡ酶切位点遗传多态性。

吉林省地区朝鲜族和汉族健康人群LPL基因HindⅢ酶切位点多态性分布的研究

目的分析我国吉林省地区朝鲜族和汉族健康人群脂蛋白酯酶(lipoprotein lipase,LPL)基因HindⅢ酶切位点多态性的分布。方法应用聚合酶链反应(polimerase chain reaction,PCR)等技术检测66例朝鲜族和90例汉族LPL基因多态性,并将其基因型和等位基因在两族人群中的分布进行统计学分析。结果朝鲜族人群LPL基因P+P+基因型,P+P-基因型和P-P-基因型频率分别为57.58%,33.33%和9.09%;汉族人群分别为73.33%,24.44%和2.22%,两组基因型的分布差异具有显著性(P=0.049)。朝鲜族人群P+等位基因和P-等位基因频率分别为74.24%和25.76%;汉族人群分别为85.56%和14.44%,两组等位基因的分布差异具有显著性(P=0.012)。结论 LPL基因HindⅢ酶切位点多态性在中国吉林省地区朝鲜族和汉族人群中的分布差异有显著性。

中国人单胺氧化酶A基因的EcoRV酶切位点多态性与帕金森病的相关性

目的 :探讨多巴胺代谢酶—单胺氧化酶 A基因EcoRV酶切位点多态性与帕金森病 (Parkinsondisease,PD)遗传易感性的关系。 方法 :选择PD病人 2 87例 (包括发病年龄小于等于 5 0岁的早发型PD和发病年龄大于5 0岁的晚发型PD)和正常对照 16 4例 ,利用PCR RFLP技术分析了单胺氧化酶 A(MAO A)EcoRV酶切位点多态性在PD病人与正常对照之间分布频率的差异。结果 :MAO A基因EcoRV酶切位点在总体对照组和总体PD病人之间的分布没有显著差异 ;根据发病年龄分组后 ,不管是早发PD病人还是晚发PD病人 ,与对照组相比等位基因和基因型频率均无显著性差别。按性别分组后发现 ,男性PD和对照组的基因型频率或是等位基因频率存在显著性差异。 结论 :研究结果支持MAO A基因多态性与PD相关的假说 ,而且表明此关系与PD发病年龄和性别有关。

汉坦病毒基因组G1区部分酶切位点的研究

用分型RT -PCR方法对 34份武汉地区肾综合征出血热患者外周血标本扩增 ,扩增的目的片段为汉坦病毒M片段G1基因部分序列 ,应用HincⅡ和SacI两种限制性内切酶消化扩增产物 ,可将汉坦病毒区分为HTN型和SEO型 ,结果与分型PCR有很高的一致性 。

利用错配碱基产生酶切位点快速检测禽类Mx蛋白基因单核苷酸改变

该方法针对无合适酶切位点的检测位点设计引物,应用于禽类Mx蛋白基因631位氨基酸位点的突变检测,利用错配碱基产生内切酶识别的酶切位点检测SNP,尝试一种操作简便结果可靠的检测单核苷酸多态性并能快速判定631位点氨基酸的方法。实验结果表明,利用这种方法产生的酶切位点能有效地对631位氨基酸位点进行分型,可以快速检测SNP。

脂蛋白脂酶基因PvuⅡ酶切位点多态性与胰岛素抵抗关系的研究

目的旨在探讨脂蛋白脂酶基因第6内含子PvuⅡ酶切位点多态性与胰岛素抵抗、2型糖尿病的发生之间是否有关联。方法随机选取163例2型糖尿病患者作为病例组,106例正常人作为正常对照组,对第6号内含子PvuⅡ酶切位点进行多态性分析。结果病例组中P+P+组高密度脂蛋白胆固醇水平明显低于P-P-组,而血清三酰甘油、胰岛素抵抗指数指标水平高于P-P-组。结论PvuⅡ酶切位点多态性与2型糖尿病中胰岛素抵抗有关。

创造酶切位点PCR-RFLP检测PON2(rs12026)基因多态性

目的:建立简便易用的PON2基因单核苷酸多态(rs12026)的检测方法。方法:应用创造酶切位点原理设计引物,通过PCR-RFLP技术判断PON2基因SNP位点多态性。结果:设计一对特异引物并PCR扩增含PON2多态位点的DNA片段,根据限制性内切酶BsmAI酶切结果判断PON2位点多态性,PCR和酶切效果均较好。结论:应用创造酶切位点PCR-RFLP原理建立的PON2多态位点的检测方法具备简便、经济、快速的特点。

维生素D受体基因FokI酶切位点与胃癌的影响因素研究

目的探讨维生素D受体基因Fok I酶切位点多态性与胃癌的影响因素。方法随机选取2013年5月—2015年5月该院就诊的维吾尔族胃癌患者143例(A组)及维吾尔族健康对照者147例(B组),采用多聚酶链反应-限制性酶切片段长度多态性(Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism,PCR-RFLP)方法测定维生素D受体基因Fok I酶切位点多态性,进行两组间比较。结果单因素Logistic回归分析显示:胃癌患者的f等位基因频率高于对照组(58.0%vs 47.3%,P<0.05)。多因素Logistic回归分析显示:带有f等位基因(Ff+ff)的受试者表现出较高的患胃癌的风险(OR值2.87)。结论 VDR的Fok I酶切位点多态性是胃癌易感性影响因素。f等位基因可能是胃癌发生的危险因素之一,而F等位基因可能是胃癌的保护因素。

pGH基因全序列ApaⅠ酶切位点多态性与生产性能的相关分析

本实验利用PCR-RFLP技术分析了约克夏和长白猪pGH基因ApaⅠ酶切位点多态性及其与生产性能的关系.结果表明,在pGH基因序列中共检测到5种基因型,4种等位基因,基因型频率和等位基因频率在2个猪品种间分布差异不显著;约克夏ApaⅠ酶切多态位点中,AC基因型个体在165日龄体重和70-165日龄日增重上显著高于AA基因型个体(P<0.1);但长白猪ApaⅠ多态位点不同基因型在这两个生产性状上的差异不显著.

联合应用巢式PCR和创造酶切位点法检测单核苷酸改变

此文介绍了一种检测单核苷酸改变的方法。联合应用巢式PCR和创造酶切位点法,操作简便,结果可靠,能有效地对SNP位点进行分型。本文以M134位点的突变检测为例,探讨联合应用巢式PCR和创造酶切位点法检测单核苷酸改变的思路、方法和策略。

广州地区鼻咽癌EB病毒LMP1基因N端XhoI酶切位点的丢失

目的 检测广州地区鼻咽癌组织EB病毒LMP1基因N -末端区XhoI酶切位点的丢失 ,探讨LMP1基因变异在鼻咽癌发生发展中的作用。方法 收集中山大学肿瘤防治中心鼻咽癌新鲜活检标本 63例以及EB病毒健康携带者外周血单个核细胞 10例。采用QIAampDNAMiniKit和QIAampDNABloodMiniKit分别抽取组织和外周血单个核细胞的DNA ,应用巢式PCR扩增EB病毒LMP1基因的N -末端区 ,并用XhoI对扩增产物进行酶切。采用四色荧光末端终止法对扩增产物进行序列分析。结果 10例健康携带者外周血单个核细胞的EB病毒LMP1基因N -末端区均未见XhoI酶切位点的丢失。 63例鼻咽癌组织中有 5 0例 ( 79%)出现XhoI酶切位点的丢失 (XhoI -loss) ,4例 ( 6%)为XhoI酶切位点部分丢失 ,只有 9例 ( 14 %)未见XhoI酶切位点的丢失 (wt -XhoI)。除了XhoI酶切位点的丢失 (nt:16942 3～16942 8;GAGCTC→GATCTC)外 ,还发现 4个错义点突变。结论 广州地区EB病毒健康携带者外周血单个核细胞所携带的EB病毒LMP1基因为wt -XhoI ,而在鼻咽癌组织中主要为XhoI -loss。因此 ,我们认为EB病毒LMP1基因N -末端区XhoI酶切位点的丢失和其他的错义点突变可能是在鼻咽癌的发生发展过程中产生的。

扩增引进限制性酶切位点技术检测CYP2C9基因的多态性

建立了一种简便、快速、准确的检测CYP2C9基因Arg144Cys位点和Ile359Leu位点多态性的新方法.该方法采用与模板具有1个碱基错配的引物通过PCR在扩增产物中引进限制性酶切位点,即扩增引进限制性酶切位点(amp lification-created restriction sites,ACRS),其中通过上游引物在扩增Arg144Cys位点的片断中引入AvaⅡ切点,使得野生型基因CYP2C9*1和突变型基因CYP2C9*2的PCR产物中分别含有2个和1个AvaⅡ切点;通过下游引物在扩增Ile359Leu位点的片断中引入MvaⅠ切点,使得野生型基因CYP2C9*1和突变型基因CYP2C9*3的PCR产物中分别含有1个和2个MvaⅠ切点.将来自Arg144Cys位点和Ile359Leu位点的PCR产物各取一份测序,表明错配碱基成功引入PCR产物中.将包含Arg144Cys位点的PCR产物用AvaⅡ消化,将包含Ile359Leu位点的PCR产物用MvaⅠ消化,然后通过聚丙烯酰胺凝胶电泳-银染进行基因分型.由于野生型基因和突变型基因的PCR产物中都至少含有1个酶切位点,能完全避免因限制性核酸内切酶失活或酶切不完全而导致的基因分型错误.

DNA酶切位点计算机查询软件的研究

本文介绍一个已投入实际运行的ＤＮＡ酶切位点查询系统，该系统成功地将微型计算机引入核苷酸序列分析中，给分子生物学研究者提供了科学的手段。

鼠疫耶尔森氏菌16S-23SrRNA基因间区的酶切位点分析

目的 :了解鼠疫耶尔森氏菌 16S - 2 3SrRNA基因间区的酶切位点分布情况。方法 :PCR扩增及限制性内切酶分析。结果 :对EV菌及不同来源的 10 3株鼠疫耶尔森氏菌 16S - 2 3SrRNA基因间区进行了扩增 ,选用限制性内切酶TaqⅠ及MspⅠ对扩增产物进行酶切分析 ,结果发现所用鼠疫耶尔森氏菌该间区扩增产物及酶切图谱一致 ;选用TaqⅠ +MspⅠ ,HinfⅠ +MspⅠ对EV菌 16S - 2 3SrRNA基因间区扩增产物进行了双酶切分析 ,作出了TaqⅠ ,MspⅠ ,HinfⅠ在EV菌该间区的酶切位点图。结论 :鼠疫耶尔森氏菌 16S - 2 3SrRNA基因间区相当保守 ;