人重组成釉蛋白C端肽在大肠杆菌中的表达及初步纯化

目的 :在大肠杆菌中表达人重组成釉蛋白C端肽 ,并对重组蛋白进行纯化 ,为进一步制备抗人成釉蛋白抗体和功能研究奠定基础。方法 :将编码人成釉蛋白C端肽的基因片段克隆到大肠杆菌表达载体pRSET -A上 ,构建表达质粒 pRSET -A -AMBN ,以大肠杆菌E .coliBL2 1(DE3)为宿主菌进行诱导表达 ,表达产物经镍 -次氮基三乙酸 (Ni -NTA)柱进行亲和层析纯化。结果 :工程菌在IPTG诱导 3h后 ,在SDS -PAGE上出现一条新的蛋白带 ,相对分子量 (Mr)为 5 2× 10 3 ,以可溶形式存在 ,经Ni-NTA柱纯化后获得纯度大于 95 %的人重组成釉蛋白C端肽。结论 :获得Mr为 5 2× 10 3 的人重组成釉蛋白C端肽。

釉原蛋白、釉蛋白及成釉蛋白在小鼠牙胚组织发育过程中的表达

目的:比较小鼠釉原蛋白(amelogenin,AMELX)、成釉蛋白(ameloblastin,AMBN)和釉蛋白(enamelin,ENAM)在牙胚组织发育过程中表达的差异,从而揭示其不同的功能。方法:选择牙胚发育期分别位于钟状期、钟状晚期、釉质成熟期的昆明小鼠头颅切片,使用抗鼠AMELX、AMBN和ENAM多克隆抗体(由美国德州大学健康科学中心Dr.Sim-mer赠送),行免疫组织化学EnVision二步法染色,观察三种蛋白在处于三个不同发育阶段小鼠头颅切片中的表达情况。结果:免疫组化结果显示,三种蛋白在三种小鼠牙胚的成釉细胞、釉质、牙本质中的表达存在时空顺序差异,随着牙胚发育和釉质成熟,AMELX呈递减表达,而AMBN和ENAM则较恒定表达。AMELX在周围发育中的编织状骨组织中也有微弱表达。结论:AMELX、AMBN和ENAM为主要的釉质基质蛋白,在牙胚发育的不同阶段有不同的调节矿化的作用,AMELX在釉质矿化早期促进晶体生长,而其在骨中的表达则进一步表明其在骨修复中可能的作用;AMBN促进釉质基质矿化,并维持晶体形状、大小;ENAM促进和维持晶体生长,并与再矿化有关。

过量氟对大鼠下切牙发育过程中釉蛋白表达的影响

目的研究过量氟对大鼠下切牙发育过程中釉蛋白表达的影响。方法选择20只Wistar大鼠,随机分成实验组和对照组。饲养8周后处死,利用HE染色和免疫组织化学染色的方法观察过量氟对大鼠成釉细胞形态及釉蛋白表达的影响。结果实验组大鼠下切牙成釉细胞由原有的高柱状结构变矮,细胞排列成多层,釉基质形成混乱,成釉细胞和成牙本质细胞中釉蛋白表达明显低于对照组,其差异有统计学意义(P<0.01)。结论过量氟可抑制釉蛋白表达,影响釉质发育。

成釉蛋白在小鼠牙胚发育不同时期的免疫组化定位

目的 :观察成釉蛋白 (ameloblastin ,AMBN)在小鼠牙胚发育不同时期的表达和分布情况。方法 :采用免疫组化的方法观察AMBN在小鼠牙胚不同时期的表达和定位。结果 :蕾状期、帽状期和钟状早期牙胚中未见AMBN的表达 ;出生后 1d钟状期 ,在成釉细胞和釉基质中呈强阳性表达 ,成牙本质细胞和牙本质基质中呈弱阳性表达 ;出生后 3d ,在成釉细胞胞浆中呈弱阳性表达 ,在成牙本质细胞中表达阳性 ,着色较成釉细胞深 ;出生后 7d ,AMBN在成釉细胞托姆氏突呈弱阳性表达 ,其余部位呈阴性表达。在牙胚发育的各个时期 ,AMBN在外釉细胞、星网层细胞、牙乳头细胞均呈阴性表达。结论 :AMBN参与釉基质的形成 。

人成釉蛋白编码区cDNA的克隆和N端肽的融合表达

目的 :克隆人成釉蛋白 (Ameloblastin)编码区基因并原核表达其N端肽。方法 :抽提人牙胚总RNA ,用Oligo(dt)作引物逆转录合成人牙胚cDNAs,然后利用PCR方法 ,从cDNAs中扩增出人成釉蛋白编码区cDNA序列 ,将所得基因片段插入 pGEM -TEasy质粒载体 ,转化入大肠杆菌DH5α后挑选阳性克隆 ,提取重组质粒DNA ,通过限制性酶切和核苷酸序列测定鉴定阳性克隆。将所克隆序列的 5’端 5 5 8bp的片段连入原核表达载体 pGEX - 4T1并在大肠杆菌中诱导表达 ,SDS -PAGE分析。 结果 :克隆片段测序结果与GenBank数据库收录的序列一致 ,经诱导表达见Mr为 4 6× 10 3 的融合蛋白。结论 :克隆到人成釉蛋白编码区cDNA 。

硼氟联合作用对大鼠切牙釉蛋白表达的影响

目的通过观察过量氟、硼以及氟硼联合作用对大鼠切牙釉蛋白表达的影响,初步探讨硼在预防氟斑牙中的作用。方法选择32只Wistar大鼠,随机分为4组。Ⅰ组常规饮用蒸馏水;Ⅱ组饮用含氟化钠质量浓度为220 mg/L的氟化水;Ⅲ组饮用含硼质量浓度为382 mg/L的水;Ⅳ组饮用含氟、硼质量浓度分别为220 mg/L、382 mg/L的水。8周后处死动物,获取切牙标本,利用免疫组织化学法和HE染色观察大鼠切牙成釉细胞和釉蛋白的表达。结果Ⅱ组釉蛋白的表达明显弱于Ⅰ组(P<0.01),Ⅲ组与Ⅰ组表达差异无统计学意义,Ⅳ组与Ⅰ组表达差异无统计学意义,Ⅳ组与Ⅱ组表达差异有统计学意义(P<0.01)。结论过量氟可抑制釉蛋白的表达,而经硼与氟的联合作用后,釉蛋白表达所受影响降低。硼可降低氟对牙齿的危害性。

小鼠成釉蛋白成熟肽编码区cDNA序列的克隆

目的：克隆小鼠成釉蛋白（ＡＭＢＮ）成熟肽编码区基因。方法：用异硫氰酸胍一步法从昆明新生小鼠磨牙牙胚组织中抽提总ＲＮＡ，用Ｏｌｉｇｏ（ｄｔ）作引物逆转录合成牙胚ｃＤＮＡ，然后利用ＰＣＲ方法，从ｃＤＮＡ中扩增出小鼠成釉蛋白成熟区的基因片段（约１．１ｋｂｐ），将所得基因片段插入ｐＴＺ１８质粒载体，转化到大肠杆菌ＤＨ５α后挑选阳性克隆，提取重组质粒ＤＮＡ，通过限制性酶切和核苷酸序列分析鉴定阳性克隆。结果：重组质粒ｐＴＺ－ＡＭＢＮ的酶切图谱和部分序列分析结果与国外文献报道一致。

大鼠切牙发育中釉蛋白的免疫荧光定位

目的:观察釉蛋白在大鼠切牙发育不同时期的表达和分布情况。方法:采用免疫荧光法观察釉蛋白在大鼠切牙发育不同时期的表达与分布。结果:在成釉器增殖期、分化早期,未见釉蛋白表达;在分化晚期,前成釉细胞有弱阳性表达;在成熟早期,成釉细胞和成牙本质细胞均阳性表达;在成熟中期,成釉细胞及其基质呈强阳性表达,而成牙本质细胞阳性表达;在成熟晚期,成釉细胞和成牙本质细胞弱阳性表达。在成釉器各期,釉蛋白在外釉细胞、星网状细胞、牙乳头细胞均呈阴性表达。结论:釉蛋白参与釉基质和牙本质基质的形成,可能与牙发育中基质形成的信息传递有关。

牙釉蛋白在大鼠切牙颈环上皮细胞中的表达

目的分离、培养和纯化大鼠切牙颈环上皮细胞,观察牙釉蛋白在大鼠切牙颈环上皮细胞中的表达情况。方法取出生2d的威斯塔大鼠牙胚颈环组织,培养原代混合细胞,纯化颈环上皮细胞,将细胞进行抗牙釉蛋白免疫细胞化学染色。结果牙釉蛋白在培养且纯化的颈环上皮细胞中呈强阳性表达,对照组呈阴性表达。结论大鼠切牙颈环上皮细胞具有向成釉细胞分化的潜能。

成釉蛋白基因的分子生物学研究进展

成釉蛋白是酸性的非釉原蛋白的组成成分之一,主要分布于釉柱周围,可以控制晶体生长速度,维持晶体生长,并决定釉柱的结构。如果其功能障碍,就会导致釉质发育不全。本文就成釉蛋白的结构、生理活性、表达调控等研究现状和进展作一综述。

PCR扩增妊娠奶牛牙釉蛋白基因进行胚胎性别鉴定的研究

牙釉蛋白(amelogenin,简写为AML)基因是牙齿发育过程中丰富表达的多拷贝基因,AML基因的同源基因分别定位在XY染色体上。本试验利用X-Y同源的牙釉蛋白基因序列设计一对特异性引物(牛AML基因序列的扩增片段长度:雌性为只有467bp的特异性扩增片段;雄性为同时具有341bp和467bp的两条特异性扩增片段),应用PCR技术同时扩增X和Y染色体上的特异性片段,扩增产物用PAGE电泳分离技术,经硝酸银溶液染色及扫描分析进行妊娠奶牛早期胚胎的性别鉴定。结果显示,从X染色体上扩增出467bp的片段,从Y染色体上扩增出341bp的特异性片段。由此可知,PCR扩增妊娠奶牛牙釉蛋白基因可以进行胚胎的性别鉴定。

釉质基质特异蛋白——成釉蛋白

成釉蛋白是釉基质特异蛋白之一 ,由成釉细胞合成分泌 ,主要分布于釉柱周围。由于不同的转录剪接形式和翻译后修饰 ,成釉蛋白具多样性。该蛋白含磷酸化和钙结合位点 ,可能与釉质矿化有关。

人成釉蛋白基因在COS-7细胞中的表达

目的:通过构建真核表达载体,在COS-7细胞中表达人成釉蛋白基因。方法:分别将人成釉蛋白基因克隆入非融合和融合真核表达载体pcDNA 3.1和pEGFP-C3中,证实克隆正确后,用脂质体介导将载体转染哺乳动物细胞COS-7,通过免疫组织化学、W estern B lot等方法检测成釉蛋白在哺乳动物细胞中的表达。结果:表达的绿色荧光蛋白融合蛋白所发出的荧光位于细胞浆中,胞核中无荧光,与免疫组化结果一致,说明人成釉蛋白位于细胞浆中。W estern B lot检测显示在COS-7细胞中表达的成釉蛋白的分子量为65×103,分泌至培养基中的成釉蛋白的分子量为62×103。结论:成功在哺乳动物细胞中表达了人成釉蛋白,为研究成釉蛋白合成后的修饰加工和成釉蛋白的结构,为今后进一步研究成釉蛋白结构和功能的关系奠定了基础。

人成釉蛋白基因的启动子活性区域分析

目的:构建人成釉蛋白(ameloblastin,AMBN)基因不同长度的上游启动子荧光素酶报告基因载体,比较不同的启动子片段在成釉细胞、Hela细胞中的活性。方法:以PCR方法获取基因上游启动子片段,将其构建至报告基因载体pGL3-Basic中,瞬时转染成釉细胞、Hela细胞,通过检测荧光素酶活性来分析启动子区域的转录调控能力。结果:成功地获得了不同长度的ameloblastin基因启动子目的片段,酶切鉴定表明不同长度启动子荧光素酶报告基因载体构建成功,不同长度的启动子在不同的细胞中活性不同,-424-267与-128-37区域为特异性转录调控作用区。结论:成功构建了不同长度的ameloblastin基因启动子的pGL3-Basic荧光素酶报告基因载体,初步确定ameloblastin基因启动子的转录活性区,为进一步研究ameloblastin基因转录调控特点奠定基础。

富亮氨酸牙釉蛋白在羟基磷灰石(010)晶面选择性吸附的分子动力学研究(英文)

蛋白质可以影响晶体的成核及生长速率,从而改变晶体的形貌和习性,因此了解牙釉蛋白在羟基磷灰石(HAP)表面的相互作用对于了解牙齿的生长机理具有重要意义.采用分子动力学(MD)和操控式分子动力学(SMD)相结合的方法研究了六个不同取向的富亮氨酸牙釉蛋白(LRAP)在HAP(010)晶面的吸附-脱附行为.在MD模拟中筛选出关键的吸附残基,并通过SMD模拟中的脱附时间对其进行分类.研究发现Glu56和Asp58是两个出现概率较高的吸附残基,其中Asp58在六个体系中都发挥了主要的吸附作用.我们进一步对吸附位点的作用基团和作用形式进行分析,发现酸性氨基酸侧链上的羧基基团与HAP表面钙离子的静电相互作用是最主要的作用形式.羧基上的两个氧原子可以钳住"钙离子,从而将LRAP锚定在HAP表面.因此,富含羧基基团的氨基酸是HAP晶型控制的首选残基.

成釉蛋白的结构及其生理病理学意义

成釉蛋白是发育期釉基质主要蛋白,其一级结构各物种高度类似。人类编码此蛋白的基因有2个,分别位于X染色体和Y染色体,X染色体成釉蛋白基因结构改变,可引起数种类型牙釉质发育不全表明成釉蛋白在牙釉质形成中起着重要作用。成釉蛋白合成和表达调节机制的阐明将在牙齿发生学研究上产生深远影响。

釉基质非成釉蛋白研究进展

非成釉蛋白含量不足发育时期釉基质蛋白的10％,包括釉丛蛋白、釉蛋白、釉鞘蛋白、牙本质涎磷蛋白。以往人们对其认识较少。近年来,随着分子生物学的发展,非成釉蛋白的基因结构、mRNA转录及蛋白表达逐渐被人们认识,并初步证实,非成釉蛋白基因突变与常染色体遗传性釉质发育不全关系密切。

MMP-9基因敲除小鼠磨牙牙胚中釉原蛋白和成釉蛋白表达的研究

目的:检测MMP-9基因敲除小鼠(MMP-9^(-/-))和野生型小鼠磨牙牙胚中釉原蛋白和成釉蛋白的表达。方法:使用免疫组化方法检测出生后2d(P2)、5d(P5)、7d(P7)野生型小鼠和MMP-9^(-/-)小鼠下颌磨牙牙胚中釉原蛋白和成釉蛋白的表达分布。结果:在P2时,釉原蛋白主要表达在成熟的成釉细胞胞、及其相邻的成牙本质细胞内,敲除MMP-9后,釉原蛋白的表达可扩散至牙乳头间充质;在P5和P7时,釉原蛋白的表达分布在野生型小鼠和MMP-9^(-/-)小鼠中无差异,但在MMP-9^(-/-)小鼠中釉原蛋白在成釉细胞中的表达量明显增强。在P2、P5和P7时,成釉蛋白的表达分布和表达量在野生型小鼠和MMP-9^(-/-)小鼠中均无差异。结论:MMP-9可能通过酶切釉原蛋白而影响其表达分布。

釉蛋白及其与釉质发育不全的关系

釉蛋白是一种非釉原蛋白,是釉质基质中分子量最大、含量最少的蛋白。本文对釉蛋白的基因结构以及釉蛋白与釉质发育不全疾病的关系等方面的研究现状作全面介绍。