重叠延伸PCR技术及其在基因工程上的应用

重叠延伸PCR技术(genesplicingbyoverlapextensionPCR,简称SOEPCR)由于采用具有互补末端的引物,使PCR产物形成了重叠链,从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸,将不同来源的扩增片段重叠拼接起来。此技术利用PCR技术能够在体外进行有效的基因重组,而且不需要内切酶消化和连接酶处理,可利用这一技术很快获得其它依靠限制性内切酶消化的方法难以得到的产物。重叠延伸PCR技术成功的关键是重叠互补引物的设计。重叠延伸PCR在基因的定点突变、融合基因的构建、长片段基因的合成、基因敲除以及目的基因的扩增等方面有其广泛而独特的应用。本文综述了重叠延伸PCR的原理和目前的应用情况,并指出了此技术中的注意事项,展望了其应用前景。

获得重构基因的简捷方法——重叠延伸PCR

目的 :构建 IFN- β信号肽序列与白细胞介素 18(IL- 18)成熟肽的重组嵌合分子。方法 :从 BAL B/ c鼠基因组 DNA扩增 IFN- β信号肽序列 ;由小鼠 Pro- IL- 18真核表达质粒获得 IL- 18成熟肽序列 ;以非对称 PCR技术得到IFN- β信号肽编码区的反义链和 IL- 18成熟肽正链 ;采用重叠延伸 PCR(SOE- PCR)产生具有 IFN- β信号肽与 IL- 18成熟肽的嵌合编码序列 ;定向连方式构建嵌合 IL- 18的表达质粒并测序。结果 :连续胶 PAGE表明非对称 PCR可分别扩增出两个靶序列的特异性单链 ,大小符合预期。IFN- β信号肽对称 PCR产物与 IL- 18非对称 PCR产物混合作为模板 ,进行重叠延伸 ;电泳分析可见清晰的嵌合片段 ;测序显示重组质粒的表达框由两个设计的靶序列构成 ,且无移码。结论 :重叠延伸 PCR是一种获得重构基因的简捷方法。

重叠延伸PCR法构建小鼠Sumf1基因的定点突变真核表达载体

前期通过染色质免疫沉淀技术（chromatin immunoprecipitation assay，CHIP）筛选出了转录因子activator protein．2 alpha（AP-2α）的靶基因Sumf1．采用重叠延伸PCR定点诱变技术，对AP．2α在Sumf1内含子片段上的两个结合位点的碱基进行定点突变，并构建定点突变表达载体．DNA测序表明，Sumf1内含子片段103—111bp，411～419bp两处的碱基已分别由GCCGTCAGG突变为GAAGTCCTG，由GCCTCTAGG突变为GGATCTCTG，成功实现定点诱变，为进一步研究AP-2α对基因Sumf1的表达调控奠定了基础．

重叠延伸PCR法扩增猪囊尾蚴AgB基因及其在BHK-21细胞中的表达

【目的】克隆猪囊尾蚴AgB基因并在体外细胞中表达。【方法】采用RT-PCR法分别扩增AgB基因的上半段和下半段序列。采用重叠延伸PCR法(splicing overlap extension PCR method,SOE-PCR)把具有35个相同碱基的上下半段扩增为全长基因,并构建到真核表达载体pVAX1,将酶切、PCR、测序鉴定的阳性质粒经脂质体转染BHK-21细胞。通过SDS-PAGE、Western-blotting、间接免疫荧光法,检测细胞中B抗原的表达。【结果】琼脂糖凝胶电泳显示扩增的不同片段大小分别与预期的相同。重组表达载体转染BHK细胞后有荧光出现。表达的蛋白能被猪囊尾蚴病阳性血清所识别。【结论】通过重叠延伸PCR法成功扩增了AgB基因全长并构建到真核表达载体,目的蛋白在BHK-21细胞中表达。

重叠延伸PCR法克隆人脂联素基因及其在毕赤酵母中表达

利用重叠延伸PCR法克隆出人脂联素基因,连接至克隆载体pGEM-T中,转化大肠杆菌DH5α,通过测序对其进行序列分析后,进一步构建毕赤酵母表达载体pPIC3.5K-ADPN,通过电击法转化毕赤酵母GS115,转化的重组酵母菌用甲醇诱导外源基因表达。经PCR、Southern blotting鉴定,获得了重组毕赤酵母菌株;经甲醇诱导人脂联素基因表达,Western blotting杂交鉴定证明人脂联素基因已经在毕赤酵母中成功表达。结果表明重叠延伸PCR法准确方便克隆出人脂联素基因,在30oC,1%甲醇诱导48h,人脂联素基因在巴斯德毕赤酵母中的表达最佳。

重叠延伸PCR法构建VPS4B基因定点突变真核表达载体

目的构建含液泡蛋白质分选因子4B(VPS4B)基因定点突变的真核表达载体。方法用RT-PCR法从HuH-7细胞中扩增VPS4B基因,并克隆到真核载体pXF3H上。采用重叠延伸PCR定点突变技术,构建K180Q和E235Q两种突变质粒,经DNA测序确证定点突变的结果,再将VPS4B及两种突变载体转染HepG2细胞,western blot检测融合蛋白表达。结果克隆了VPS4基因,构建了真核载体pXF3H-VPS4B,经重叠延伸PCR得到突变体。DNA测序结果显示,编码180位氨基酸的538～540位碱基由AAG突变为CAG;编码235位氨基酸的703～705位碱基由GAA突变为CAA,其他碱基均无突变。VPS4B及两种突变载体转染HepG2细胞可检出HA-VPS4B融合蛋白表达。结论成功构建了VPS4以及K180Q和E235Q两种突变的真核表达载体。

重叠延伸PCR克隆拟南芥ACCase基因和植物表达载体构建

植物的乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)催化乙酰辅酶A羧化生成丙二酸单酰辅酶A,是脂肪酸合成的第一步,该步骤是种子脂肪酸合成与含油量形成的关键调控步骤。拟南芥中的真核形式ACCase基因cDNA长约7 000bp,难以直接克隆。本研究先通过常规PCR将其cDNA分成八个重叠的片段分别扩增出来,再用重叠延伸PCR将得到的片段逐步拼接成长度为6 890bp的完整的基因序列,测序证实克隆序列正确无误,最后将其克隆到农杆菌转化植物的载体上。序列分析发现ACCase基因的开放阅读框长度为6 765bp,编码一个含2 254个氨基酸残基的多肽链,推测其分子量约为250kDa。ACCase基因的成功克隆为利用该基因调控油料作物的含油量奠定了良好基础,同时为克隆长度较大的基因提供了一种经济可行的方法。

利用重叠延伸PCR技术进行DNA的人工合成

重叠延伸PCR技术是一种通过寡聚核苷酸链之间重叠的部分互相搭桥、互为模板进行PCR扩增,从而获得目的DNA基因片段的方法。该技术在目的基因的人工合成及外源蛋白在宿主中的高效表达等方面显示出良好的应用前景。综述了重叠延伸PCR技术的原理、反应条件的优化及其应用。

重叠延伸PCR法构建小菜蛾化学感受蛋白1基因突变体研究

【目的】探索重叠延伸PCR法在昆虫化学感受蛋白基因点突变上的应用,研究半胱氨酸(Cys32)对小菜蛾(Plutella xylostella)化学感受蛋白1(PlxyCSP1)结合特性的影响。【方法】用计算机软件模拟PlxyCSP1上Cys32突变前后的蛋白三级结构以及与配体化合物的结合情况,确定点突变位点。根据扩增得到的PlxyCSP1序列设计并合成重叠引物,利用重叠延伸PCR法,将PlxyCSP1上的Cys32突变成色氨酸(Trp32),获得突变体PlxyCSP1-M。将突变后的基因与载体pET-32a(+)连接,转化大肠杆菌BL21(DE3)。【结果】分子对接图显示,配体可以顺利进入PlxyCSP1的结合口袋,而无法进入PlxyCSP1-M的结合口袋。结合能预测显示,配体化合物与PlxyCSP1的结合能均为正值,与PlxyCSP1-M的结合能均为0。突变后的重组质粒测序结果表明,Cys32(TGC)已突变为Trp32(TGG),经IPTG诱导,该菌表达了分子质量约为36 ku的融合蛋白。【结论】Cys32是影响PlxyCSP1结构和功能的重要氨基酸残基。Cys32突变为Trp32后,PlxyCSP1-M结合特性发生了变化,不能与配体化合物正常结合。

重叠延伸PCR法克隆重组复合干扰素

目的:用重叠延伸PCR(overlap extension PCR)法获得人工优化的干扰素-重组复合干扰素(consensus interferon,cIFN)基因,用原核表达系统对其进行表达,鉴定表达的cIFN活性.方法:根据大肠杆菌的偏爱密码子,人工设计cIFN的高表达基因,用overlap PCR法合成cIFN全基因,用基因重组技术构建其原核表达载体pRA-cIFN,在大肠杆菌BL21中进行高效表达,用SDS-PAGE和Western blotting鉴定cIFN表达,用GuHCl阶段透析法进行蛋白变性、复性,用TALON(His)6亲和层析柱进行纯化,用ELISA、MTS比色定量法及血凝抑制试验检测cIFN的免疫活性和生物活性.结果:成功合成了cIFN全基因,其DNA长度与理论长度534 bp相符;用基因重组技术成功构建了cIFN原核表达载体pRA-cIFN,并用大肠杆茵BL21进行了高效表达。SDS-PAGE和Western blotting鉴定结果显示,表达蛋白主要以包涵体形式存在,其分子质量符合理论值23-3 kDa;用GuHCl阶段透析法成功进行包涵体蛋白的复性,亲和层析法纯化后cIFN的ELISA、MTS比色定量法及血凝抑制试验结果显示。表达蛋白具有明显的cIFN免疫学活性、剂量依赖性PLC/PRF/5细胞增殖抑制作用和HBsAg分泌抑制作用.结论:重叠延伸PCR法是获得重组复合基因的有效简便的方法,我们通过重叠延伸PCR法获得并表达的cIFN具有明显的抗病毒、抗细胞增殖活性.

TAT PTD-Tachyplesin融合基因的重叠延伸PCR法合成

为探讨HIV-Tat蛋白转导域(protein transduction domain,PTD)对中国鲎抗菌肽tachyplesin的协同作用,试验以经毕赤酵母密码子优化后的tachyplesin成熟肽(54 aa)加TAT PTD(11 aa)的cDNA序列为参考模板,设计了6条单链寡核苷酸片段,首尾引物的5'端分别引入EcoR I和Xba I酶切位点,通过重叠延伸PCR方法成功合成了TAT PTD+Tachyplesin序列,序列全长219 bp,为其后续功能与协同作用研究奠定了基础。

重叠延伸PCR合成血管内皮生长因子基因

目的:重叠延伸PCR(OE-PCR)方法合成人血管内皮生长因子(VEGF)基因。方法:根据Genbank中人VEGF基因的编码序列合成15个寡核苷酸片段,相邻引物间均有19个碱基互补,经过7轮PCR循环扩增出人VEGF基因,并将其克隆至pMD18-Tvector,挑取3个重组质粒进行筛选并测序。结果:酶切和测序鉴定结果表明,其中一个与VEGF的同源性达到100%。结论:动态模板OE-PCR基因合成法成功获得576bp的VEGF全长DNA。

重叠延伸PCR法体外重建鸡主要组织相容性复合体Ⅰ

本研究旨在体外重建鸡主要组织相容性复合体Ⅰ类分子(MHCⅠ)重链(α链)胞外区与轻链(β2m)成熟肽的重组嵌合分子。采用RT-PCR法分别扩增鸡MHCⅠ的重链胞外区和轻链的成熟肽序列;采用重叠延伸PCR(Splicing overlap extension PCR method,SOE-PCR)把通过45个碱基的链连接的鸡MHCⅠ重链胞外区基因和轻链成熟肽基因重组到可溶性表达质粒pMAL-p2X进行可溶性表达。经琼脂糖凝胶电泳证明RT-PCR可分别扩增出鸡MHCⅠα链胞外区基因和β2m成熟肽基因,大小符合预期。采用MHCⅠα链胞外区序列的反义引物与β2m成熟肽基因正义引物有15个碱基重叠的两对引物,以MHCⅠα链胞外区序列与β2m成熟肽序列PCR产物的混合物作为模板,进行重叠延伸获得了预期大小的连接片段;测序显示重组质粒上MHCⅠα链胞外区序列与轻链β2m成熟肽基因的靶序列由一柔性的linker相连,阅读框正确且无移码。本研究表明SOE-PCR是体外重构鸡MHCⅠ的一种简捷可行方法。

利用重叠延伸PCR定点突变衰退病P23基因

分析已知柑桔衰退病强毒系基因组并克隆CTV中一个重要的基因P23.利用重叠延伸PCR法的原理,成功的将P23基因保守序列第206位碱基由C突变成T,由此该位点成为限制性酶(SacI)的识别位点.把改良后的P23基因插入到T载体中,测序发现成功地突变掉目的位点.为进一步利用分子生物学手段研究CTV病毒,克隆突变CTV序列奠定了基础.

利用重叠延伸PCR技术进行定点突变研究

[目的]建立一种高效、便捷、经济的DNA定点突变方法。[方法]以重组人组织型纤溶酶原激活剂rPA(Reteplase)基因为模板,采用重叠延伸PCR技术对3个位点进行定点突变,将突变基因片段克隆到克隆载体pEASY-Blunt上,并通过测序验证突变结果。[结果]测序结果表明3个位点的突变结果与预期完全一致,即第10位引入单个碱基A、第137位碱基C突变为G以及第686位碱基G突变为A,通过重叠延伸PCR技术一次引入3个突变碱基,100%的实现目的位点的定点突变。[结论]该研究成功实现目的位点的定点突变,为rPA基因的进一步克隆和功能研究奠定了基础。同时也表明重叠延伸PCR技术是一种高效、便捷、经济的DNA定点突变方法。

重叠延伸PCR技术构建β-环糊精葡糖基转移酶基因的定点突变原核表达载体

采用重叠延伸PCR技术对环糊精葡萄糖基转移酶基因序列中保守区域的二个氨基酸位点Y127,R254进行体外基因定点突变。将突变基因分别亚克隆进pUC-18,经PCR鉴定及序列分析,所转化的Escherichia coli BL21(DE3)中含有插入的突变基因重组质粒,结果表明成功构建了Y127F、R254F二个突变基因的重组表达载体。

用改进的重叠延伸PCR技术构建三位点突变载体

目的:改进传统重叠延伸PCR方法,实现引入3个不同DNA突变位点的简便的多位点定点突变。方法:根据前期构建的包含人线粒体12S rRNA(NC 01290)3个热点突变位点的野生型质粒序列,利用Muta Primer 2.0软件设计针对3个热点突变位点的3对互补的定点突变引物,以野生型质粒为模板,结合重叠延伸PCR反应和冷冻析出法,产生同时包含3个突变位点的突变目的片段,酶切后克隆到载体中,测序确证是否突变成功。结果:DNA测序证实3个不同突变位点同时成功引入,定点突变载体构建成功。结论:用改进的重叠延伸PCR技术能简便、高效地获得多位点定点突变载体,在分子生物学领域有较高的使用价值。

降落和重叠延伸PCR构建靶向肿瘤干细胞腺病毒载体及感染实验

目的应用降落和重叠延伸PCR法构建对肿瘤干细胞有特异靶向性的高效载体-复制缺陷型腺病毒载体,观察其对CD133+人大肠癌细胞株SW480的感染效率。方法利用重叠延伸PCR技术扩增5型腺病毒纤毛球端HI环两端的基因序列,定向插入真核表达质粒pEGFP-N1中,构建重组质粒pEGFP-N1.KNOB△HI,同时在缺失HI环部位引入EcoRV限制性酶切位点。在此基础上,用降落PCR克隆纤毛基因全长编码区序列,构建出腺病毒穿梭质粒pNEB-F5。利用凝胶图像分析和基因测序验证所构建质粒的正确性。再与pAdEasy-1,pShuttle-GFP在E.coli BJ5183中同源重组,得腺病毒载体Ad5FHI-GFP和Ad5-GFP。用Ad5FHI-GFP和Ad5-GFP分别感染CD133+人大肠癌细胞株SW480,通过荧光显微镜观察感染效率。结果降落PCR和重叠延伸PCR都扩增出特异性条带,测序结果与预期相符。与Ad5-GFP相比,Ad5FHI-GFP对CD133+人大肠癌细胞株SW480有显著提高。结论利用降落和重叠延伸PCR成功构建新型靶向肿瘤干细胞的腺病毒载体,利用降落和重叠延伸PCR成功构建新型靶向肿瘤干细胞的腺病毒载体,其对CD133+人大肠癌细胞株SW480实验显示Ad5FHI-GFP组感染效率明显强于Ad5-GFP组。

重叠延伸PCR对DNA片段进行定点双突变

探讨如何利用重叠延伸PCR对同一靶DNA片段中的两个不同位点实施联合突变。先用野生型DNA作模板,通过一轮重叠延伸PCR,获得突变一个预期位点的DNA片段,再用此突变DNA片段作模板,通过另一轮重叠延伸PCR获得两个预期位点均突变的DNA片段。重叠延伸PCR能对DNA片段进行双突变甚至多点突变,具有简便、快速、经济等特点,在阐明基因的调控机理、改造蛋白质结构等分子生物学领域中具有极大的应用价值。

运用重叠延伸PCR技术构建SGK3激酶PX结构域突变体

目的:构建SGK3激酶PX结构域突变体载体,观察其在人肾胚细胞293T中的表达与定位。方法:利用重叠延伸PCR原则设计引物,合成具有点突变的SGK3突变体,将其连接到p EGFP载体上,测序验证;将所获突变载体瞬时转染人肾胚细胞293T,利用荧光倒置显微镜检验突变体在细胞中的表达及功能实现。结果:测序结果表明合成了具有点突变的SGK3序列;荧光倒置显微镜下SGK3突变体相较野生型SGK3在293T细胞内的不均匀分布表明转染成功,突变体载体在人肾胚细胞293T中获得表达且有所定位。结论:通过改变PX结构域序列上第90位氨基酸可以使SGK3激酶失去定位的功能,从而为研究SGK3在细胞中的功能提供基础。