单菌落PCR法直接快速鉴定重组克隆

利用单菌落PCR法直接筛选含有GFP、LTB-ST外源基因的重组克隆,阳性克隆可以扩增出目的条带,和质粒PCR扩增的结果一致。同时,单菌落PCR法也可应用于重组质粒转化后的农杆菌的筛选,单菌落PCR法的扩增结果和农杆菌液扩增的结果一致。结果表明,单菌落PCR法是一个有效简便的鉴定重组阳性克隆的方法。

一种快速提取质粒DNA用于鉴别重组克隆的方法

介绍了一种利用过夜培养的菌液瞬时提取质粒DNA，并用于电泳鉴别含有插入子克隆的方法。事先无需准备许多繁琐的相关试剂，提取质粒的全过程只需3～5min就可完成，非常适合于做重组克隆的快速鉴别。

野油菜黄单胞菌重组克隆pIXU9278对黄原胶生物合成的影响

用ｐＩＪ３２００作为载体，构建了包含１５６２个重组克隆野生型野油菜黄单胞菌的粘粒文库，通过三亲交配法，基因文库中的重组克隆可以在ｐＲＫ２０１３的帮助下，从Ｅ．ｃｏｌｉ中转移到ＸＣＣＮＡＵ－９２中，绝大多数重组克隆对黄原胶合成无影响，但导致菌株生长缓慢。工程菌株ＸＣＣＮＡＵ－９２７８（ｐＩＸＵ９２７８）在２８℃、１２０ｒ／ｍｉｎ条件下发酵７２ｈ，产量达３７．５０ｇ／ｋｇ，发酵液粘度为１４６００ｍＰａ·ｓ，与ＸＣＣＮＡＵ－９２相比，产量增加７．１４％，发酵液粘度增加７．３５％。

PCR快速筛选重组克隆方法的建立

目的 :建立一种PCR技术快速筛选重组克隆的方法。方法 :用Triton裂解菌落作为模板 ,以pMD - 18T载体多克隆位点设计的引物与目的基因猪 β-INF引物设计不同组合 ,PCR扩增待检重组克隆。 结果 :PCR技术快速筛选出猪 β -INF重组克隆并鉴定了插入方向。结论

重组克隆PCR扩增快速筛选方法的建立

目的 :建立PCR扩增快速筛选重组克隆的方法。方法 :利用载体本身的启动子序列和目的片段的特异性引物作为引物 ,通过合理搭配 ,用常规PCR方法扩增待检重组克隆。结果 :可以方便地筛选出重组克隆以及顺向和反向重组克隆 ,与传统的酶切鉴定结果一致。结论 :该方法可以快速、准确的筛选重组克隆 ,并能够确定片段插入的方向和大小。

变形链球菌luxS基因同源重组克隆载体的构建实验

目的构建luxS基因的同源重组克隆载体以备将来进行luxS基因同源重组knockout突变株的研究。方法利用高保真的pfuDNA聚合酶,通过嵌套式PCR的方法,分别扩增出变形链球菌luxS基因的上下游片段(Xup,Xdn)以及大肠杆菌pH1+质粒的卡那霉素抗性基因片段(Kana),依次采用相应的双酶切反应将这些片段连接入噬菌体载体pBluescriptS(K+)Phagemids,以构建目的质粒Xukd-pbsk重组载体。结果经酶切鉴定目的质粒各片段插入无误,插入片段的测序报告也显示碱基无错配,含目的质粒的菌株可在含30mg/L卡那霉素的LB培养基内生长良好,证明插入的卡那霉素抗性基因体外表达良好。结论本研究构建的变形链球菌luxS基因同源重组克隆载体正确,可用于今后对于变形链球菌luxS基因突变株构建的研究。

单菌落PCR在发夹RNA重组克隆鉴定中的应用

以单菌落为模板进行PCR扩增,直接筛选插有发夹RNA(Small hairpin RNA,shRNA)干扰片段的重组阳性克隆。以圆滑单菌落为PCR模板,采用载体通用引物直接扩增目的片段,质粒测序验证PCR结果的正确性。结果表明,在筛选的6个菌落中均扩增出324 bp的目的条带,进一步进行测序分析鉴定,证实了菌落PCR阳性克隆含有发夹RNA干扰片段。单菌落PCR是一种简便、快速、可靠、有效筛选重组阳性克隆的方法。

HIV-1SF_2env重组克隆近PL启动子序列的测定

①目的确定ＨＩＶ－１ＳＦ２ｅｎｖ重组克隆的近启动子ＤＮＡ序列及其读码框架。②方法使用ＡＢＩ公司的３７３Ａ自动测序仪，对插入有ＨＩＶ－１ＳＦ２株ｅｎｖ基因的原核表达质粒ｐＳＦ２ｅｎｖ近启动子ＤＮＡ序列进行了序列测定。③结果该质粒的近启动子ＤＮＡ序列读码框架正确，重组表达质粒ｐＳＦ２ｅｎｖ构建成功。④结论使用限制性内切酶可以进行重组克隆的定向插入。

利用寡核苷酸探针快速筛选重组克隆

提出了利用寡核苷酸探针快速筛选重组克隆的方法，在数小时内即可完成杂交和自显影的过程。以克隆羊β－乳球蛋白基因（ＢＬＧ）第一内含子为例进行了说明。

CFA/Ⅰ重组克隆定居因子抗原的纯化及形态学观察

用基因重组技术获得的高效表达CFA/I的重组克隆,在CFA固体培养基上培养后,通过匀浆破碎、硫酸铵分级盐析纯化,再经超离心及DEAE—Sephadex A50柱层析,得到了纯化的CFA/I产品,得率约0.9mg/g湿菌。SDS—PAGE分析显示一条蛋白质带,并测其分子量为15000,与天然CFA/I相同。同时,免疫扩散和蛋白质印迹试验证明,纯化的重组克隆的CFA/I与天然CFA/I具有相同的抗原性及免疫原性。在电镜下也观察到了菌毛的形态。

微量限制性酶切法快速鉴定阳性重组克隆

介绍了一种简便的能在 1h内鉴定阳性重组克隆的方法。该方法准确性高于PCR法 ,比常规先小量提取质粒再酶切鉴定的方法简便、快速。同时配制的 1种适合多种酶切反应的缓冲液 ,每种限制性内切酶在该缓冲液中的活性与其最适条件下的活性相当。 2种或 2种以上的酶切反应可以同时在这种缓冲液中进行 ,不用更换缓冲液一步完成。

放射性与非放射性标记重组克隆pPF_（14）DNA探针诊断恶性疟疾的比较研究

放射性与非放射性标记重组克隆ｐＰＦ_（１４）ＤＮＡ探针诊断恶性疟疾的比较研究王季石，陆惠民，李卓江（贵阳医学院附院内科苏州医学院分子生物研究室）本研究用恶性疟原虫重组质粒ｐＰＦ１４ＤＮＡ片段，分别经［α─３２Ｐ］─ｄＡＴＰ和［Ｄｉｇ］─１１─ｄＵＴＰ?..

卫氏并殖吸虫基因文库的构建——Ⅰ重组克隆的方法

以SDS-酚-乙醇沉淀法提取卫氏并殖吸虫成虫基因组DNA,分别用Sau 3A和Eco RI核酸限制性内切酶酶切,电泳回收0.4—4Kb大小的DNA片段,与相应的大肠杆菌质粒载体pBR^(322)或pUR^(222)重组连接,转染大肠杆菌7118。结果显示,pUR^(222)质粒经碱性磷酸脂酶处理后与DNA片段以1/4(W/W)比例重组连接,获得的重组克隆最多,并且可以利用菌落的色泽不同,从麦康凯培养基平板上直接挑选出重组克隆。是利用质粒载体构建基因文库重组克隆的较好方法。

乙肝表面抗原及恶性疟疾杂合抗原基因的重组克隆

乙型肝炎及疟疾流行全世界,是严重危害人类健康的传染病。由于疟疾的抗药性不断出现,乙肝缺乏有效的治疗措施,对于两种疾病疫苗的研究具有重要意义。我们将乙肝表面抗原与恶性疟杂合抗原基因串联,再与质粒pCITE2b重组,构建重组质粒,试图通过基因工程的方法得到既能对抗乙肝又能对抗恶性疟疾的疫苗。 首先用PCR方法从HBV(adr亚型)基因组中扩增出编码HBsAg的S基因。

基于转化相关重组克隆曲酸合成基因簇及其在黑曲霉中的异源整合表达

【背景】黑曲霉(Aspergillus niger)是一种重要的丝状真菌底盘细胞,然而对其进行大片段DNA的遗传操作存在工具缺乏、效率低下的问题。海量基因组数据中存在大量未被鉴定的次级代谢产物合成基因簇,因相应DNA分子量大而难以克隆,大部分基因与产物分子之间的映射关系尚未被解析。【目的】开发一种适配黑曲霉的大片段DNA分子直接克隆的方法。以直接克隆米曲霉(Aspergillus oryzae)来源的曲酸合成基因簇(约30 kb)在黑曲霉底盘细胞中表达,实现曲酸的异源发酵。【方法】基于转化相关重组(transformation-associated recombination,TAR)克隆,构建适配黑曲霉转化的TAR捕获骨架载体pSEA-TAR;将曲酸合成基因簇上下游各1 kb同源DNA序列先后引入pSEA-TAR,中间以唯一的XhoⅠ相隔,得到曲酸合成基因簇捕获载体pSEA-KLR;随后,将NotⅠ/SbfⅠ消化后含有完整曲酸合成基因簇及上下游同源序列的米曲霉基因组与经XhoⅠ线性化的pSEA-KLR共同转化酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)VL6-48,通过营养缺陷筛选获得成功捕获曲酸合成基因簇的重组子,提取质粒,电转化大肠杆菌(Escherichia coli)扩增重组质粒;借助农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导黑曲霉转化,对获得的含有曲酸合成基因簇的黑曲霉转化子进行曲酸发酵,检测曲酸合成水平。【结果】获得了含有ARSH4/CEN6、TRP1、hph和LB/RB-T-DNA repeat的基于TAR克隆、适配黑曲霉表达的大片段DNA捕获载体pSEA-TAR。借助酿酒酵母高效的同源重组系统,通过同源重组获得含有曲酸合成基因簇的重组质粒pSEA-TAR-KA,捕获成功率为5.9%。对获得的含有曲酸合成基因簇的10株黑曲霉重组菌株KA1–KA10进行发酵分析发现均成功合成了曲酸,其中黑曲霉KA-2发酵7 d后曲酸水平最高,达到5.86 g/L。【结论】构建了适配黑曲霉的TAR克隆体系,用于大片段DNA高效捕获、重构和表达大型生物合成基因簇。以来源于米曲霉的曲酸合成基因簇捕获及在黑曲霉中成功实现曲酸合成验证了其有效性,进一步丰富了黑曲霉作为底盘细胞在重要化合物绿色生物制造中的作用。

用PCR法快速筛选中国对虾含微卫星的重组阳性克隆

运用PCR法在中国对虾的小片段基因组文库中快速筛选含有微卫星序列的重组阳性克隆。PCR中使用的引物为载体pGEM - 3zf(+)上多克隆位点两侧的T7/Sp6启动子引物和根据微卫星核心重复序列设计的STR引物 :STR1:5’ -ATATATATATATAT - 3’ ;STR2 :5’ -TCTCTCTCTCTCTC - 3’。直接使用含有重组克隆的菌液 ,在PCR反应前增加一段裂解细菌的高温。筛选出来的含有微卫星序列的重组阳性克隆经DNA测序验证。结果证明 ,采用PCR方法用菌液快速筛选含有微卫星序列的重组阳性克隆完全可行 ,而且具有简便、快速、高效。

对虾白斑综合症病毒重组cDNA克隆的构建与分析

取经人工注射感染了对虾白斑综合症病毒 40— 45h的凡纳对虾鳃组织 ,分离mRNA ,以mRNA为模板合成双链cDNA ,并克隆于PUC质粒的NotI/SalI位点 ,构建了 1 0 0 0余株对虾感染后期鳃细胞的重组cDNA克隆。重组质粒经PCR鉴定插入片段 ,DNA斑点杂交分析目的片段 ,测定了 2 0株对虾白斑综合症病毒的重组cDNA克隆的末端DNA序列 ,并对其进行了包含存在的开放阅读框架、启动区上游序列、编码产物的特性等分析。结果显示 :PCR产物在0 3— 1 6kb之间 ;大于 1kb的克隆中有 31 8%的克隆为白斑综合症病毒的重组cDNA克隆。已测序的不包含同源序列的 1 3株克隆中含有 1 4个开放阅读框 ,其中 1 1个上游可检出启动子基序 ,4个可检出启动子调制元件。ORF转译产物的特性基序分析显示 :有 2个ORFs可检出锌指基序 ,3个ORFs可检出亮氨酸拉链基序 ,2个ORFs可检出NTP结合基序 ,未检出核定位信号基序。

利用酵母同源重组系统克隆肺炎克雷伯菌基因组岛

利用酵母同源重组系统克隆耐药性条件致病菌肺炎克雷伯菌的基因组岛.具体方法为:对20株从临床中分离的肺炎克雷伯菌进行体外tRIP PCR扩增以搜索外源基因组岛;利用酵母同源重组系统构建作用于arg6 tRNA基因位点的酵母捕捉载体YCV6并克隆该位点的基因组岛.结果表明:在该20株肺炎克雷伯菌中,arg6 tRNA基因位点的tRIP PCR结果都是1.2 kb,没有筛选到大基因组岛插入;所构建的酵母捕捉载体YCV6携带了2个1.8 kb的靶序列,分别与肺炎克雷伯菌arg6 tRNA基因位点两侧的保守序列同源;将线性化的载体YCV6与肺炎克雷伯菌临床株HS04044的总DNA一起转入酵母细胞,利用酵母同源重组克隆临床菌株HS04044染色体上插入arg6位点的小基因组岛.该位点特异性的捕捉载体YCV6可用于克隆肺炎克雷伯菌临床株染色体插入arg6位点的外源DNA序列.

大鼠抗小鼠重组Foxc2单克隆抗体的制备与检测应用

目的 :为了研究叉头框c2 (Foxc2 )在骨骼和主动脉发育上的作用。方法 :利用基因重组融合蛋白制作大鼠抗小鼠Foxc2单克隆抗体 (抗 Foxc2mAb) ,并利用蛋白质印迹和免疫荧光分析了Foxc2蛋白在小鼠肌胚细胞C2C12的表达和在小鼠胚胎的表达部位。结果 :用小鼠GST Foxc2融合蛋白免疫大鼠制得的抗 Foxc2mAb效价为 1∶5 0 0 0 ,并特异地与转染了CX Foxc2质粒的小鼠L细胞和人膀胱癌HTB9细胞产生的Foxc2蛋白结合。在骨成形蛋白 2 (BMP 2 )的诱导下 ,Foxc2蛋白在C2C12细胞中显著地增加 ,用反义Foxc2序列转染C2C12细胞可以明显地抑制Foxc2蛋白在这个细胞系中的表达。Foxc2蛋白表达主要定位于 11 5 dpc小鼠胚胎的生骨节和主动脉周围的间充质组织。结论 :应用大鼠抗小鼠基因重组Foxc2单克隆抗体研究Foxc2的作用 ,结果表明Foxc2蛋白在BMP 2的诱导下 。